于瀟宇，琚婧儀，李相懿，張姝，李嘉倫

（1.華中科技大學(xué)附屬武漢協(xié)和醫(yī)院，湖北，武漢，430000 2.武漢皮可力醫(yī)療美容診所，湖北，武漢，430000）

作為人體最大的器官，皮膚是由表皮、真皮層、皮下層三部分構(gòu)成的。皮膚內(nèi)源性老化和外源性老化共同決定皮膚的老化進程，這一過程是長期的、高度異質(zhì)性的。內(nèi)源性老化是由時間進程決定的，難以避免。其主要由人體自身機制調(diào)控，特征是皮膚變薄和細(xì)紋產(chǎn)生[1]。內(nèi)源性老化也是一種氧化過程，這與年齡相關(guān)性的皮膚抗氧化能力下降和活性氧（ROS）生成增多有關(guān)[2]。外源性老化主要取決于暴露于環(huán)境因素的強度和持續(xù)時間以及皮膚類型，例如空氣污染、吸煙、營養(yǎng)不良和紫外線（UV）光等。隨著單細(xì)胞測序技術(shù)的發(fā)展，皮膚老化的分子機制愈發(fā)明確，與生長發(fā)育有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子下調(diào)是皮膚衰老的重要特征[3]。除了細(xì)胞內(nèi)的變化，細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）在內(nèi)源性和外源性的老化皮膚中也表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)和功能的變化，其中膠原蛋白的含量顯著減少[4]。

構(gòu)成皮膚組織的蛋白質(zhì)成分主要是膠原蛋白[5]。CP是一種線性或環(huán)狀聚合物（相對分子質(zhì)量＜3000），主要由水解膠原蛋白組成。CP具有多種生理功能，包括改善皮膚衰老、防止骨質(zhì)疏松和預(yù)防Ⅱ型糖尿病等方面的功能[6]。本文主要關(guān)注CP改善皮膚衰老的功能。許多關(guān)于CP的體外實驗、動物實驗和細(xì)胞實驗結(jié)果都已表明，CP在延緩皮膚自然衰老和抑制紫外線引起的光損傷方面具有良好效果[7]。此外，許多臨床試驗表明，CP能夠有效改善人體皮膚彈性、減少皺紋[8]。不同于現(xiàn)存的相關(guān)綜述，本文主要介紹局部涂抹CP的抗氧化、抗糖化、抗炎作用，并與口服CP的作用相比對。二者作用機制不同，但可以起到協(xié)同改善皮膚老化作用。

1 CP 概述

CP有廣泛的物質(zhì)來源，包括豬，牛，水產(chǎn)（主要是魚類），羊，家禽[9-11]等。我國海洋資源豐富，值得更廣泛關(guān)注的是水產(chǎn)動物源CP。膠原蛋白是以Gly-X-Y重復(fù)序列為特征的三螺旋結(jié)構(gòu)（見圖1），由約20種氨基酸組成。CP是膠原蛋白水解后形成的一種介于蛋白質(zhì)和氨基酸之間的分子質(zhì)量混合物，通常是幾百到幾千的分子量[12]。CP中含有羥基脯氨酸和羥基賴氨酸，對多肽的連接和膠原的穩(wěn)定具有重要作用[6]。CP主要有以下三種獲取方式：從天然生物體中提取，化學(xué)合成與重組DNA技術(shù)，水解體外膠原蛋白[13]。目前，主流的CP制備方法是體外膠原蛋白水解法，即將分子量較大的膠原蛋白水解為分子量較小的多肽。水解體外膠原蛋白法步驟主要有：原料預(yù)處理，膠原蛋白提取，膠原水解[14]。

圖1 膠原纖維組成和結(jié)構(gòu)

2 局部涂抹應(yīng)用

2.1 皮膚抗氧化作用

皮膚內(nèi)源性老化存在氧化應(yīng)激。這與線粒體滲漏、炎癥等增加活性氧（ROS）的產(chǎn)生，以及年齡相關(guān)的細(xì)胞修復(fù)能力下降有關(guān)[15]。UVB誘導(dǎo)的光老化與ROS的生成增多密切相關(guān)。皮膚老化過程中增多的ROS激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，誘導(dǎo)激活蛋白-1（AP-1）和核因子-Kb（NF-κB），抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）的表達，促進皮膚膠原蛋白的降解；抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）信號通路，抑制皮膚膠原蛋白的合成（見圖2）[16-19]。此外，UV照射引起的小鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)發(fā)生異常改變，如降低超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）的水平，增加脂質(zhì)過氧化物（LPO）和丙二醛（MDA）的水平，并觸發(fā)8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）的形成[20]。CP是一種常見的抗氧化劑。這種低分子量蛋白質(zhì)因其優(yōu)良的生物相容性、易降解性和較弱的抗原性而被廣泛應(yīng)用。CP通過清除自由基、中斷脂質(zhì)過氧化的自由基鏈來發(fā)揮抗氧化作用[21]。其抗氧化機制尚未完全闡明。據(jù)報道，CP的抗氧化效力與CP中的疏水性氨基酸有關(guān)[22]。這可能是CP的抗氧化活性位點與自由基結(jié)合的空間位阻不同造成的[23]。

圖2 皮膚老化的分子機制

Bang等[19]人利用水解牡蠣蛋白制備的CP局部涂抹在UVB照射的無毛小鼠的皮膚上。實驗組小鼠的皺紋長度、深度和表皮厚度得到明顯改善，體內(nèi)因UVB照射而降低的抗氧化酶活性得到恢復(fù)并調(diào)節(jié)了促炎細(xì)胞因子的表達。Qin等[24]將大馬哈魚魚皮來源的CP局部涂抹在UVB照射后的大鼠無毛背部皮膚，可增加皮膚抗氧化酶（GSH和SOD）含量，這有效對抗衰老。其中平均分子量為1194.00道爾頓的CP效果最好。鰱魚骨來源的CP具有減少ROS生成的能力，并使脂質(zhì)過氧化自由基鏈中斷，呈劑量依賴性的作用[25]。體外實驗顯示，它對纖維細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞有較好的光線保護的效果。值得注意的是，經(jīng)過鰱魚骨CP處理的炎性巨噬細(xì)胞釋放炎性細(xì)胞因子減少，尤其是腫瘤壞死因子-α（TNF-α）。但CP的抗氧化作用的具體機理還有待明確，這可能與它降低ROS生成，中斷過氧化自由基鏈有關(guān)，也可能與它增加抗氧化酶含量有關(guān)。

2.2 皮膚抗糖化作用

糖化被視為肌膚加速衰老的關(guān)鍵因素，特別是暴露于紫外線中的皮膚。蛋白、脂質(zhì)、核酸等大分子與葡萄糖或其他還原單糖反應(yīng)生成晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）。AGES與皮膚的衰老有著密不可分的聯(lián)系。AGEs直接或間接結(jié)合各種細(xì)胞表面的AGE特異性受體（RAGE），激活NF-κB和MAPK信號通路，增加MMP的產(chǎn)生[26]，并誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS[27]和炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生[28]。UV通過促進生成AGEs，可使皮膚的糖化程度加劇，釋放出大量的活性氧自由基，從而產(chǎn)生氧化應(yīng)激狀態(tài)[29]。第二，膠原蛋白由于更新速度慢，更容易發(fā)生糖化。AGES在皮膚老化的過程中修飾膠原蛋白，會影響膠原蛋白纖維結(jié)構(gòu)力學(xué)功能的完整性，和ECM對MMP介導(dǎo)組織的重塑的敏感性[30]。

局部涂抹CP通過抑制AGEs的積累來對抗皮膚的糖基化進程。據(jù)報道，Lee等[31]在一項由22名亞洲女性參與、為期4周的前瞻性單臂研究中發(fā)現(xiàn)，局部CP應(yīng)用后，第4周觀察到皮膚皺紋、彈性和密度明顯改善，皮膚AGEs積累減少，無不良影響。體外研究表明，成人真皮纖維細(xì)胞受紫外線照射，經(jīng)CP處理后，兩種主要的AGEs生物標(biāo)志物戊糖苷和甲基乙二醛的含量明顯減少[31]。抑制AGEs的機理主要包括3個方面，一是抑制其生成；二是斷裂交聯(lián)結(jié)構(gòu)；三是阻斷其與受體結(jié)合，其中最有效的是抑制AGEs生成，從源頭上解決問題。CP抗糖化的機理仍有待進一步闡明。盡管已經(jīng)生成的AGEs很難被清除，但是通過局部涂抹應(yīng)用CP，能有效抑制AGEs積累，從而實現(xiàn)皮膚的抗老化。

2.2 抗炎作用

皮膚的內(nèi)在老化涉及慢性低度炎癥。老化皮膚中的衰老細(xì)胞對皮膚慢性炎癥的驅(qū)動有著舉足輕重的作用。由于它們的分泌譜與年輕的細(xì)胞相比發(fā)生了改變，因此被稱為衰老相關(guān)的分泌表型（SASP）。其分泌譜主要變化有促炎性細(xì)胞因子、趨化因子、蛋白酶和生長因子等[32]。有可靠的證據(jù)顯示，促炎型衰老細(xì)胞在許多組織中隨著衰老而增強慢性低級別炎癥。這種狀態(tài)叫作炎癥性衰老（Inflammaging）[33]。

皮膚中SASP的發(fā)展是包括免疫細(xì)胞在內(nèi)的細(xì)胞成分之間相互作用的結(jié)果。老化的皮膚中，朗格漢斯細(xì)胞（LCs）的數(shù)量下降，遷移能力也較差[34]。CD4+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抑制干擾皮膚的免疫監(jiān)視能力[35]。皮膚駐留的巨噬細(xì)胞也表現(xiàn)出向促炎癥表型的轉(zhuǎn)變，這促進了進一步的組織炎癥[36]。這些免疫細(xì)胞是否參與衰老細(xì)胞的持續(xù)存在尚未明確。

Salminen等[37]認(rèn)為由紫外線輻射或其他一些損傷引起的持續(xù)炎癥狀態(tài)會刺激免疫抑制并促進過早衰老。UVR照射會造成皮膚DNA和ECM的損傷，產(chǎn)生ROS，促進氧化應(yīng)激，引起炎癥反應(yīng)。炎癥刺激皮膚免疫抑制細(xì)胞增殖，從而拮抗炎癥，但是這又會引發(fā)皮膚的免疫抑制狀態(tài)。免疫抑制細(xì)胞分泌抗炎細(xì)胞因子（IL-10和TGF-β）,減少真皮脂肪組織[38]，促進細(xì)胞衰老并擾亂ECM的結(jié)構(gòu)。皮膚的免疫抑制狀態(tài)會對發(fā)炎組織中的免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞產(chǎn)生有害影響[39]。UVR-炎癥-免疫抑制通路的激活增加了衰老細(xì)胞在受影響組織中的積累，衰老細(xì)胞表達SASP，推動皮膚的病理改變[40]。

體外研究實驗表明，遮目魚鱗片中分離的膠原肽不僅具有抗氧化和DNA保護活性，還通過降低脂氧合酶活性、一氧化氮（NO·）自由基等作用而表現(xiàn)出抗炎作用[41]。Peng等[42]局部應(yīng)用水解牡蠣蛋白來源的CP在皮膚上，通過多種機制顯著減輕了慢性UVB照射引起的皮膚膠原蛋白的流失。抗氧化方面，促進了抗氧化酶（SOD和GPH-Px）的活性，同時降低了皮膚中的丙二醛（MDA）水平。抗炎方面，抑制了炎癥細(xì)胞因子（IL-6、TNF-α）和炎癥相關(guān)蛋白（iNOS、COX-2）的表達?？鼓z原蛋白降解方面，CP抑制金屬蛋白酶1（MMP1）的表達。

3 口服CP 改善皮膚水合作用

在社交平臺上，口服CP被宣傳可以通過增加真皮膠原蛋白、透明質(zhì)酸和皮膚的水含量來逆轉(zhuǎn)皮膚老化的臨床癥狀。近幾年來，消費者對于口服CP的熱情逐年上漲[43]。口服膠CP具有改善皮膚水合作用已被多項動物實驗、臨床試驗證實有效。Kang等[44]研究顯示，無毛小鼠口服CP后，皮膚皺紋得到改善。同時，改善水合作用，合成透明質(zhì)酸的透明質(zhì)酸合成酶表達上調(diào)；抑制水合作用，分解透明質(zhì)酸的透明質(zhì)酸酶表達下調(diào)。口服低分子量CP可以作為一種保健功能食品成分來改善人體皮膚的水合作用、彈性和皺紋。一項隨機、三盲、安慰劑對照研究表明，口服CP12周后，實驗組皮膚整體水合度、皮膚彈性較安慰劑組有明顯改善[45]。口服CP不僅可以美容養(yǎng)顏，還可以增強老年人皮膚機械性能。另一項臨床研究顯示，39名65歲或以上住院患者中，每天口服1次含有CP的營養(yǎng)補充劑（10.0g）的患者，比對照組角質(zhì)層水化度和皮膚彈性改善明顯，這樣可以幫助減少老年人皮膚的脆弱性[46]。Kim等[47]進行了隨機、雙盲、安慰劑的對照試驗，給予每日1000mg低分子量鲇魚皮CP的女性比安慰劑組女性皮膚水化值更高，皮膚彈性更好，皺紋更少?？诜桇~皮CP顯著增加皮膚HYP、透明質(zhì)酸、水分含量，提高血清及皮膚抗氧化酶SOD及CAT的活性[48]。一項針對34名40-65歲健康女性進行的為期12周的臨床試驗表明[49]，實驗組通過服用以水溶性輔酶Q10和膠原蛋白結(jié)合為特征的液態(tài)食物補充劑，使真皮層密度得到改善，眼眶周圍皺紋面積和皺紋總評分減少，皮膚光滑度得到改善。而皮膚的滋潤度、真皮層的厚度、失去經(jīng)皮的滋潤度（TEWL）以及黏性彈性等方面的變化，則沒有明顯的差別。這可能是因為攝取的食物補充劑是膠原蛋白，分子較大，而非CP。

4 膠原蛋白肽目前應(yīng)用的局限性和展望

4.1 提高CP 的生物利用度

局部涂抹CP和口服CP可以促進皮膚膠原蛋白的生成、抑制老化引起的膠原蛋白的降解。二者既有區(qū)別，也有聯(lián)系。從CP吸收方式上來講，口服CP在小腸被吸收，進入血液循環(huán)。有證據(jù)表明，進入血液循環(huán)的功能性肽可以轉(zhuǎn)移到皮膚上，并代謝發(fā)揮作用[50]。CP經(jīng)皮主要通過角質(zhì)層、毛囊、汗管及皮脂腺4條途徑吸收而不進入體循環(huán)，其中后3 者常被稱為旁路途徑[51]。局部涂抹CP很重要的一個問題，就是滲透到真皮里面的滲透性比較低。皮膚外層的滲透取決于不同的因素，如：物質(zhì)（分子大小，穩(wěn)定性，結(jié)合性，溶解性）的物理化學(xué)性質(zhì)不同，穿透的時間刻度，皮膚的厚度與成分，皮膚新陳代謝，皮膚的部位、區(qū)域和應(yīng)用持續(xù)時間特點，透皮裝置[52]。研究表明，一些合適的參數(shù)能夠增強并保證皮膚上局部產(chǎn)品的傳遞。這些參數(shù)與小于500da的分子量、介于1和3之間的辛醇/水分配系數(shù)、小于200°C的熔點、＞1mg/mL的水溶解度以及極少的極性中心有關(guān)[53]。角質(zhì)層通常被認(rèn)為是一種實體結(jié)構(gòu)，采用積極的繞過角質(zhì)細(xì)胞的方法來遞送CP是值得期待的。包括：微針陣列，角質(zhì)層消融，電輔助方法（超聲，離子滲透療法，電穿孔等）[51]。與一般的口服藥物遞送系統(tǒng)不同，局部應(yīng)用CP不需要經(jīng)皮滲透入血，因此提高CP透皮吸收效率和皮膚停留時間是有廣泛應(yīng)用前景的。

4.2 CP 具體生物活性成分的鑒定

CP作為皮膚抗老化的營養(yǎng)品、化妝品已被廣泛應(yīng)用，但其中具體的抗老化生物活性成分卻有待更深層次的考察。Pro-Hyp和Hyp-Gly二肽在成纖維細(xì)胞的增殖中起重要作用[54]?？诜琍ro-Hyp和Hyp-Gly更多的CP，能更好地提高皮膚水合度、減少皺紋、增加皮膚彈性[55]。值得注意的是，兩種CP對成纖維細(xì)胞有趨化作用，Pro-Hyp可以促進成纖維細(xì)胞合成HA。魚鱗制備的CP，在體內(nèi)以雙肽形式（Gly-Pro和Pro-Hyp）吸收，降低了皮膚中MMP-1的產(chǎn)生，增加了成纖維細(xì)胞中1型前膠原的合成，對UVB誘導(dǎo)的體內(nèi)光老化的起保護作用[56]。Liu等[57]收集了口服后含膠原肽（CPS）的血清和從血清代謝物（SCP）中分離的膠原肽，SCP通過激活TGF-β/SMAD通路來促進膠原合成。抑制AP-1、MMP1和MMP3蛋白表達抑制膠原蛋白降解，從而起到修護效果。值得注意的是，血清代謝物中的IO（Ile-Hyp）和AOG（Ala-Hyp-Gly）兩種肽段被鑒定為通過激活TGF-β/Smad3途徑促進膠原前合成的活性肽。

目前的研究中，CP通過MAPK/AP-1信號通路抑制MMP的合成，進而抑制膠原蛋白的降解，同時激活TGF-β/Smad信號通路，促進膠原蛋白的合成[6]。但是，CP的功能肽段、結(jié)合受體、代謝途徑尚未完全闡明。膠原蛋白水解產(chǎn)物成分復(fù)雜，分子質(zhì)量分布較廣，為了分析CP具體的功能肽段，對膠原蛋白水解產(chǎn)物進行檢測具有必要性。CP分子質(zhì)量檢測方法有凝膠電泳法、尺寸排除色譜法、高效液相色譜與電噴霧-質(zhì)譜聯(lián)用、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜，其中基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜具有快速、靈敏度高，分析質(zhì)量范圍大的優(yōu)點，被認(rèn)為檢測膠原蛋白水解物分子質(zhì)量的最佳方法[12]。

4.3 口服與外用相結(jié)合

口服CP與局部涂抹應(yīng)用CP相結(jié)合正成為CP研究的新趨勢口服和外用CP的作用部位、機理不同[58]。局部應(yīng)用CP的患者，表皮深層水合作用改善?？诜﨏P的患者皮膚的彈性得到改善，毛孔減少。局部應(yīng)用CP與口服CP在皮膚抗老化中起協(xié)同作用，二者的作用是互補的而不是等效的，因此，將局部應(yīng)用CP與口服CP兩種攝入方式結(jié)合起來具有重要意義。

5 討論

文章從CP局部涂抹應(yīng)用的抗氧化作用、抗糖化作用、抗炎作用綜述了局部涂抹CP可能通過抑制氧化應(yīng)激、降低AGEs、調(diào)節(jié)皮膚炎癥微環(huán)境來修復(fù)皮膚的內(nèi)源性和外源性老化。并將口服CP的相關(guān)作用與局部涂抹應(yīng)用CP進行比較?？诜头肿恿緾P可以作為一種保健功能食品成分來改善人體皮膚的水合作用、彈性和皺紋。局部涂抹應(yīng)用和口服CP在遞送機制和修復(fù)機制上有所不同。改進CP的遞送載體，提高遞送效率有助于更好的發(fā)揮CP抗老化的作用。盡管攝入CP有許多好處，但是仍然缺乏大規(guī)模的臨床研究來證實，現(xiàn)有的證據(jù)仍是有限的、不標(biāo)準(zhǔn)的。CP未來在醫(yī)用耗材、保健食品、化妝品行業(yè)有著令人期待的前景。