廖霞,姚婷,謝泓源,余湘,雷天意,張全波,青玉鳳

(川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院,1.風濕免疫科 ;2.老年科,四川 南充 637000)

類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是最常見的自身免疫病之一,全球發(fā)病率為0.5%～1%[1],我國發(fā)病率約為0.42%,女性多于男性[2]。RA除累及關(guān)節(jié)外,也常出現(xiàn)肺間質(zhì)改變、心血管事件、慢性病貧血、惡性腫瘤等關(guān)節(jié)外表現(xiàn)。RA疾病的進展可能導致患者生活質(zhì)量下降,死亡率增加[3-5]。早診斷、早治療對于減少RA患者功能喪失,改善預后十分重要。目前RA發(fā)病機制尚不明確,與遺傳、環(huán)境等因素相關(guān)[6-7]。近年來相關(guān)研究[8]發(fā)現(xiàn),Janus蛋白酪氨酸激酶/信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子(janus protein tyrosine kinase/signal transducer and activator of transcription,JAK/STAT)信號通路的持續(xù)激活對RA的發(fā)病過程具有重要調(diào)控意義,以此為基礎誕生了包括托法替布在內(nèi)的一系列新型的口服(janus protein tyrosine kinase,JAK)抑制劑,并且在臨床中逐漸得到應用。

自噬是一種廣泛存在于真核生物中的降解機制,其主要作用是在溶酶體介導下降解或清除受損的細胞器和蛋白質(zhì)聚集體及病原體從而維持細胞自身代謝及調(diào)節(jié)細胞穩(wěn)態(tài)[9]。研究[10-12]發(fā)現(xiàn),自噬的異常在心血管疾病、感染、衰老、腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病及自身免疫性疾病的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。越來越多的研究[13-14]也發(fā)現(xiàn)自噬參與了RA疾病的發(fā)生發(fā)展。本研究欲探討RA患者體內(nèi)是否存在自噬的異常表達,并探索其與RA患者臨床表現(xiàn)之間的關(guān)系,同時通過檢測托法替布治療前后自噬相關(guān)基因(autophagy-related genes,ATGs)表達水平的變化,以明確托法替布是否可通過調(diào)控自噬而發(fā)揮作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2020年6月至2021年6月于川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院門診就診的RA患者(RA組)30例為研究對象。納入標準:符合2010年美國風濕病學會聯(lián)合歐洲抗風濕病聯(lián)盟關(guān)于類風濕患者分類標準[15];既往僅接受傳統(tǒng)合成抗風濕藥(conventional synthetic disease-modifying anti-rheumatic drugs,csDMARDs)治療。排除標準:排除合并其他自身免疫性疾病、重要臟器疾病、感染、腫瘤、內(nèi)分泌疾病患者及妊娠。選取同期川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院體檢中心年齡、性別匹配的30名健康體檢者為對照組(healthy control group,HC組),HC組實驗室指標均正常,無自身免疫性疾病和家族史。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過,且全部患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 給藥方式 予以枸櫞酸托法替布片(正大天晴藥業(yè)集團股份有限公司,H20193281),5 mg/次,2次/d,連續(xù)治療24周。

1.2.2 臨床資料與實驗室指標 收集托法替布治療前、治療后24周RA患者的臨床治療反應性指標,包括健康評估問卷殘疾指數(shù)(HAQ-DI)、關(guān)節(jié)腫脹數(shù)目(SJC)、關(guān)節(jié)壓痛數(shù)(TJC)、28個關(guān)節(jié)疾病活動評分(DAS-28)、患者總體評估(PtGA)、DAS-28(ESR)疾病活動度分級、ACR20/50/70應答率、紅細胞沉降率(ESR)、超敏C反應蛋白(hsCRP)、自身抗體(RF、CCP)。所有實驗室指標均在川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科完成。

1.2.3 引物合成 根據(jù)Pubmed Gene中ATG3、ATG5、ATG12、ATG16、Beclin-1、LC-3和β-actin人基因序列,采用Primier 6.0引物設計軟件設計相應引物,由上海生工生物合成公司合成引物。見表1。

表1 引物序列

1.2.4 實時熒光定量法(RT-qPCR) 采用RT-qPCR檢測RA患者及健康對照組外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMCs)中ATGs的表達水平。用肝素鈉抗凝的外周靜脈血3 mL,分離提取PBMCs,采用Trizol法提取總RNA,紫外分光光度儀測定總RNA濃度,取OD260/OD280在1.8～2.0的RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。RT-qPCR總體積為20 μL,反應體系:TB Green Premix Ex Taq II 5 μL,ROX Reference Dye II 0.2 μL,去離子水3.2 μL,正向及反向引物各0.3 μL,cDNA 1 μL。反應條件:第一步:95 ℃預變性3 min。第二步:95 ℃ 5 s→60 ℃ 34 s進行循環(huán)擴增,循環(huán)40次。溶解曲線階段:95 ℃ 15 s→60 ℃ 1 min→95 ℃,每15 s 1個循環(huán)。每份標本均設兩個復孔,反應結(jié)束后做溶解曲線。以目的基因的Ct值減去內(nèi)參的Ct值為ΔCt,以2-ΔCt值表示目的基因mRNA表達水平。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較

兩組研究對象年齡、性別構(gòu)成比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),RA組ESR、hSCRP水平高于HC組(P<0.05)。見表2。

表2 兩組一般資料比較

2.2 兩組自噬基因mRNA表達水平比較

與HC組相比,RA組ATG5、Beclin-1、LC-3的mRNA表達水平均升高(P<0.05),ATG16的mRNA表達水平降低(P<0.05),ATG3、ATG12的mRNA表達水平無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表3及圖1。

表3 兩組PBMCs中自噬相關(guān)基因mRNA表達水平比較

2.3 RA患者自噬基因表達水平與臨床指標的相關(guān)性分析

ATG5與ESR、hsCRP、SJC、PtGA、DAS-28(ESR)、CCP正相關(guān)(P<0.05);ATG12與hsCRP、CCP正相關(guān)(P<0.05);ATG16與hsCRP、SJC正相關(guān)(P<0.05);Beclin-1與ESR、hsCRP、PtGA、DAS-28(ESR)正相關(guān)(P<0.05),與RF-IgG負相關(guān)(P<0.05);LC-3與ESR、hsCRP正相關(guān)(P<0.05)。見表4。

表4 自噬相關(guān)基因與RA患者臨床指標相關(guān)性分析

2.4 RA組治療前后自噬基因表達水平對比

治療后,RA組經(jīng)托法替布治療24周后,ATG5、Beclin-1、LC-3的mRNA表達水平均降低(P<0.05),ATG16的mRNA表達水平升高(P<0.05),ATG3、ATG12的mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表5及圖2。

表5 RA組治療前后自噬相關(guān)基因mRNA表達比較

3 討論

類風濕關(guān)節(jié)炎是一種彌漫性結(jié)締組織病,可影響多個器官系統(tǒng),對患者及家庭產(chǎn)生嚴重影響。相關(guān)研究[10-12]發(fā)現(xiàn),自噬的異常上調(diào)或下調(diào)亦或是功能缺失在多種疾病的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。研究[16]表明,自噬在類風濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用:(1)誘導瓜氨酸化并呈遞瓜氨酸肽給免疫細胞導致免疫炎癥反應;(2)刺激破骨細胞生成并誘導其介導的骨吸收[17];(3)誘導并維持成纖維樣滑膜細胞形成“調(diào)亡抵抗”[18];(4)調(diào)節(jié)淋巴細胞的激活和保存[19-20]。瓜氨酸化是指在肽基精氨酸脫亞胺酶(peptidyl-arginine-deiminase,PAD)的作用下,精氨酸被化學轉(zhuǎn)化為瓜氨酸的過程。新生成的瓜氨酸蛋白抗原在自噬參與的條件下被呈遞給T淋巴細胞并導致抗瓜氨酸抗體生成,后者能夠分化為破骨細胞,從而促進骨丟失和破壞[21]。

本研究中,與HC組相比,RA組患者的ATG5、Beclin-1、LC-3的mRNA水平均呈高表達,與Zhu等[22]的研究結(jié)果一致,提示ATG5、Beclin-1、LC-3等自噬基因的上調(diào)可能參與RA的發(fā)病;但與之不同的是我們發(fā)現(xiàn)RA患者ATG16的mRNA表達水平降低。Saitoh等[23]研究中也發(fā)現(xiàn)在ATG16功能缺失的巨噬細胞中白細胞介素1、白細胞介素18表達增加,表明ATG16可能發(fā)揮著抑制某些炎癥因子表達從而發(fā)揮免疫作用。此外,Hamaoui等[24]研究也強調(diào)了ATG16除在自噬發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用,還廣泛作為炎癥的制動器發(fā)揮作用從而維持細胞穩(wěn)態(tài)。因此推測ATG16在RA中可能發(fā)揮著抑制炎癥的作用。

既往研究[22-24]及本研究結(jié)果均表明RA患者體內(nèi)的確存在自噬的異常,為了明確自噬異常對RA患者臨床癥狀及疾病活動性的影響,本研究進一步進行了相關(guān)性分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ATG5、ATG12、ATG16、Beclin-1、LC-3與ESR、hsCRP、CCP等指標呈現(xiàn)不同程度的正相關(guān)關(guān)系。在RA患者中,我們通常將ESR及hsCRP作為判斷患者疾病活躍的參考指標,而將RF和CCP抗體滴度作為判斷患者病情嚴重程度及疾病預后的預判指標。上述結(jié)果表明在活動性RA患者中,其自噬水平高低與疾病活動性、炎癥指標、關(guān)節(jié)腫脹等臨床指標密切相關(guān),降低自噬相關(guān)基因的表達水平可能成為類風濕關(guān)節(jié)炎治療的新靶點。

托法替布是一種新型的口服小分子藥物,主要通過靶向抑制JAK/STAT信號通路發(fā)揮治療目的。最近一項在Clec16aKO小鼠中的研究[25]結(jié)果表明,托法替布對自噬的影響可能是通過抑制JAK/STAT信號通路中STAT1、STAT3發(fā)揮作用。以此為基礎,本研究檢測了托法替布治療24周后RA患者的ATGs的表達水平,發(fā)現(xiàn)ATG5、Beclin-1、LC-3的基因表達水平降低,而ATG16基因表達水平升高,提示托法替布可能通過影響自噬相關(guān)基因的表達而參與自噬調(diào)節(jié)。但是由于目前缺乏托法替布對RA患者自噬影響的直接研究,因此關(guān)于托法替布對RA患者自噬影響的具體機制尚不明確。

綜上,RA患者體內(nèi)存在自噬基因的異常表達且與疾病活動性和炎癥水平等密切相關(guān),提示自噬可能成為未來RA治療的新靶點。此外,托法替布可通過調(diào)控部分自噬基因的表達從而影響自噬,可能為其治療RA的新途徑,亦可能成為潛在的自噬調(diào)控劑,但其具體作用機制有待進一步研究。