陳麗平,何勇均,蔡燕,石琪

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,1.遺傳與產(chǎn)前診斷中心;2.婦產(chǎn)科,四川 南充 637000)

脊髓性肌萎縮癥(spinal muscular atrophy,SMA)是一種嚴(yán)重的常染色體隱性遺傳性神經(jīng)肌肉疾病,主要是位于5q13.2區(qū)域的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活基因1(survival motor neuron,SMN1)致病性變異所致,當(dāng)SMN1基因第7或第7、8外顯子發(fā)生純合缺失或點(diǎn)突變時(shí)引起SMN蛋白表達(dá)缺失,造成脊髓前角α運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性,導(dǎo)致近端肢體和軀干進(jìn)行性、對(duì)稱性肌無(wú)力和肌萎縮[1]。該病在新生兒中的發(fā)病率約為1/10 000[2],攜帶者頻率為1/50～1/40。兒童型SMA(1～3型)的患病率為2.78～6.56人/10萬(wàn)人[3],其中4型SMA患病率約為0.32人/10萬(wàn)人[4]。SMA居<2歲兒童致死性遺傳病首位,其中累及呼吸系統(tǒng)導(dǎo)致的呼吸衰竭是最常見(jiàn)的致死原因[5]。中國(guó)人群中的攜帶者頻率約為1/42[6],但是各地區(qū)尚無(wú)發(fā)病率的確切數(shù)據(jù)。

SMA臨床表現(xiàn)嚴(yán)重,人群中的攜帶率較高,且致病基因明確,2008年美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(ACMG)[7]建議無(wú)論地域種族,應(yīng)該對(duì)所有育齡人群進(jìn)行SMA攜帶者篩查。目前已報(bào)道的SMA攜帶者篩查技術(shù)眾多,根據(jù)SMA致病基因的特點(diǎn),對(duì)SMN1基因外顯子7、8缺失進(jìn)行檢測(cè),已經(jīng)成為SMA攜帶者篩查的首選方法[8]。目前尚無(wú)關(guān)于南充地區(qū)人群的SMA攜帶率的相關(guān)研究,本研究從此角度出發(fā),采用多重連接依賴性探針擴(kuò)增(MLPA)技術(shù)和熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)技術(shù)對(duì)南充地區(qū)4 325例因不良妊娠史就醫(yī)的育齡期女性及183名配偶的SMN1基因進(jìn)行檢測(cè),調(diào)查SMA攜帶率,為本地區(qū)的SMA的篩查及孕婦的產(chǎn)前診斷提供一定的指導(dǎo)。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取2019年12月至2022年10月川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院收治的4 325例定期產(chǎn)檢且因不良妊娠史就醫(yī)的育齡期女性及183名配偶為研究對(duì)象,其中孕婦年齡(29.35±2.17)歲;孕周9～20周。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn),所有納入的研究對(duì)象均進(jìn)行檢測(cè)前溝通,取得研究對(duì)象的知情同意并簽署相關(guān)知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 所有受檢者均進(jìn)行外周靜脈血采集2 mL,采集后的血液進(jìn)行EDTA抗凝,于4 ℃的環(huán)境中保存,對(duì)采集的血液樣本均在1周內(nèi)完成基因檢測(cè)。

1.2.2 DNA提取 采用達(dá)安基因NP986-C系統(tǒng)進(jìn)行外周血核酸的提取,采用NanoDropOne超微量生物檢測(cè)儀進(jìn)行DNA濃度檢測(cè)。

1.2.3 基因檢測(cè) 采用熒光定量PCR法對(duì)SMN1基因進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海五色石公司,操作方案嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。PCR擴(kuò)增條件為:95 ℃預(yù)變性(10 min)→95 ℃變性(15 s)→58 ℃退火延伸(60 s),共40個(gè)循環(huán)。采用FAM及VIC通道進(jìn)行信號(hào)采集。若檢測(cè)孕婦為SMA攜帶者,則對(duì)其配偶進(jìn)行樣本采集及檢測(cè),配偶檢測(cè)方法同上。若配偶檢出為SMA攜帶者,則進(jìn)行胎兒的基因檢測(cè),經(jīng)夫婦雙方知情同意后,于妊娠的16～22周進(jìn)行經(jīng)腹壁羊膜腔穿刺術(shù)(B超引導(dǎo)下),用一次性無(wú)菌注射器緩慢抽取孕婦羊水10 mL,利用購(gòu)自荷蘭MRC-Holland公司的MLPA P060試劑盒(SALSA MLPA Kit P060-B2)經(jīng)變性、雜交、連接以及擴(kuò)增后,產(chǎn)物通過(guò)ABI3500基因分析儀(ThermFisher,美國(guó))檢測(cè),驗(yàn)證SMN1基因拷貝數(shù)變異,數(shù)據(jù)使用Coffalyser V8.0軟件分析。

2 結(jié)果

本研究納入4 508例研究對(duì)象(育齡女性4 325例及部分女性的配偶183例),共檢測(cè)到SMA攜帶者70例,攜帶率為1/64.4,其中E7和E8雙位點(diǎn)雜合缺少的64例(1/70.4),E7位點(diǎn)雜合缺失6例(1/751.3)。對(duì)夫妻雙方均為雜合性缺失胎兒的基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其為SMN1基因E7位點(diǎn)純合缺失。基因拷貝數(shù)變異檢測(cè)發(fā)現(xiàn),胎兒SMN1基因?yàn)?個(gè)拷貝數(shù),SMN2基因?yàn)?個(gè)拷貝數(shù)。將胎兒預(yù)后詳細(xì)告知胎兒父母后,胎兒父母決定終止妊娠。見(jiàn)圖1。

3 討論

SMA是遺傳性神經(jīng)肌肉疾病的一種,主要因?yàn)榧顾枨敖羌?xì)胞和低位腦干運(yùn)動(dòng)神經(jīng)核團(tuán)變性,導(dǎo)致不同程度的肌張力降低、肌萎縮,嚴(yán)重時(shí)可影響呼吸肌危及生命。該病常呈家族性,從胎兒期到成人不同年齡均可發(fā)病,且治療方法有限,預(yù)后通常不佳。SMA治療的研究領(lǐng)域近年來(lái)發(fā)展迅速,部分相關(guān)治療藥物已經(jīng)成功獲批上市,如索伐瑞韋、利司撲蘭、諾西那生等[9],可從不同方面提高全長(zhǎng)SMN蛋白水平,其他治療方式(如神經(jīng)保護(hù)治療、SMN修飾基因治療、肌肉激活治療、干細(xì)胞治療等)也相繼取得了進(jìn)展。上述治療給SMA患兒帶來(lái)了希望,但早診斷、早治療極其重要[10]。目前藥物必須依靠進(jìn)口,售價(jià)高昂,普通家庭難以承擔(dān),因此,利用先進(jìn)的技術(shù)對(duì)孕婦SMA攜帶率的篩查,預(yù)防SMA患兒的出生,是一種經(jīng)濟(jì)且有效的SMA防治方法,對(duì)減輕家庭的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和社會(huì)的負(fù)擔(dān)均有較好的價(jià)值。

對(duì)育齡期女性SMA攜帶情況進(jìn)行篩查屬于一級(jí)預(yù)防,不僅能避免SMA患兒的出生,而且還能夠提高我國(guó)新生兒的人口質(zhì)量。臺(tái)灣地區(qū)在2005至2009年共計(jì)檢測(cè)了10萬(wàn)余例孕婦,其中共檢測(cè)出SMA攜帶者2 262例,攜帶率約為1∶48[11];2013年我國(guó)上海地區(qū)同樣對(duì)4 719例孕婦進(jìn)行了篩查,SMA攜帶率約為1∶52[12];隨后相繼有廣西、云南及陜西地區(qū)報(bào)道了關(guān)于本地區(qū)的SMA篩查結(jié)果,其中以廣西地區(qū)的攜帶率較低,約為1∶81[13]。目前尚沒(méi)有南充市及周邊地區(qū)關(guān)于SMA攜帶率的研究,本研究納入4 508例研究對(duì)象(孕婦4 325例及部分配偶183例),共檢測(cè)到SMA攜帶者70例,攜帶率為1/64.4,其中E7和E8雙位點(diǎn)雜合缺少的64例(1/70.4),E7位點(diǎn)雜合缺失6例(1/751.3),基本符合當(dāng)前我國(guó)的SMA攜帶者的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果。同時(shí)對(duì)夫婦均為SMA攜帶者的胎兒基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其為SMN1基因E7位點(diǎn)純合缺失。MLPA技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),胎兒SMN1基因?yàn)?拷貝,SMN2基因?yàn)?個(gè)拷貝數(shù),最終通過(guò)遺傳咨詢預(yù)防SMA患兒的出生。

SMA患兒的父母多為SMN1單拷貝攜帶者,但也約有4%的SMA攜帶者為兩個(gè)SMN1拷貝位于同一染色體上,這種“2+0”型攜帶者目前缺少準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù),需要聯(lián)合SMA患者父母的SMN1基因拷貝數(shù)和家族史調(diào)查來(lái)進(jìn)行診斷評(píng)估。同時(shí),現(xiàn)階段對(duì)于家庭中有“2+0”類型攜帶者的夫妻,其再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)和產(chǎn)前診斷策略缺少準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù),對(duì)于“2+0”類型攜帶者進(jìn)行病例篩查與遺傳咨詢尤為關(guān)鍵[14]。目前臨床上常用的技術(shù)是MLPA和熒光定量PCR,但因各自的缺點(diǎn)限制了其在大規(guī)模篩查中的應(yīng)用。已有大量的研究數(shù)據(jù)表明,高通量測(cè)序(NGS)可以直接計(jì)算SMN1拷貝數(shù),但篩查或診斷SMN1微小變異仍存在很大困難,目前在我國(guó)尚未成為SMA的常規(guī)檢測(cè)方法。數(shù)字PCR(dPCR)法、高分辨率熔融分析法等新興技術(shù)方法在臨床SMA攜帶者篩查中有巨大的潛力。但由于dPCR法不能檢測(cè)出SMN1基因內(nèi)點(diǎn)突變以及沉默的SMA攜帶者(2+0),未來(lái)需要研究開(kāi)發(fā)可以檢測(cè)單核苷酸變化的dPCR技術(shù),以適用于大規(guī)模的篩查[15]。

綜上,本研究初步確定了南充地區(qū)SMA的攜帶率,同時(shí)對(duì)同為SMA攜帶者夫妻的胎兒進(jìn)行了SMN1基因的檢測(cè),最終確定為SMA患兒并避免了此例患兒的出生,減輕了家庭及社會(huì)的負(fù)擔(dān)。本研究也存在有一定的缺陷,如樣本數(shù)目少,樣本中配偶人數(shù)偏少,未進(jìn)行SMN2基因的檢測(cè),因此可能會(huì)對(duì)本研究的結(jié)論造成一定的影響,后續(xù)有待研究的進(jìn)一步完善。