周菁,王玉珍,李麗娜,郭亞煥,史玉民,焦咪,段煉,閻麗,王佳

(1.陜西省腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科;2.空軍軍醫(yī)大學(xué)附屬西京醫(yī)院泌尿外科,陜西 西安 710000)

肺癌具有高發(fā)病率和高死亡率,主要有非小細(xì)胞癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)和小細(xì)胞癌兩種類型,以NSCLC最為常見[1]。NSCLC患者主要為肺腺癌,此類患者在疾病早期通常無典型表現(xiàn),但具有高轉(zhuǎn)移潛能。調(diào)查[2]發(fā)現(xiàn),在確診為肺腺癌患者中,70%的患者已進(jìn)展為中晚期,錯(cuò)失最佳治療時(shí)機(jī)。通過手術(shù)、放療、化療、靶向、免疫等手段的應(yīng)用,晚期患者生存率提高有限[3-4]。臨床研究[5]已證實(shí),中醫(yī)在惡性腫瘤的臨床治療中具有安全性高、藥物副作用小等突出優(yōu)勢。養(yǎng)正消積膠囊是一種由16味中藥組方構(gòu)成的方劑,可從多種途徑誘導(dǎo)腫瘤的凋亡和自噬,進(jìn)而抑制腫瘤的進(jìn)展[6]。研究[7-8]發(fā)現(xiàn),PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路是調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡的重要通路。本課題組通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)數(shù)據(jù)庫應(yīng)用,發(fā)現(xiàn)養(yǎng)正消積膠囊可能是通過PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路抑制肺腺癌的發(fā)展,故對肺腺癌A549細(xì)胞進(jìn)行探究。

1 材料與方法

1.1 材料

人肺腺癌A549細(xì)胞(中國科學(xué)院細(xì)胞庫),取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。養(yǎng)正消積膠囊購自石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司。高糖DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司);胎牛血清(上海源葉生物科技有限公司);β-actin單克隆抗體(美國Abcam公司);p-AKT、p-PI3K、p-mTOR、Beclin-1、LC3Ⅰ、ILC3Ⅱ單PI3K、AKT、mTOR、克隆抗體(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2 主要儀器

CyFlowCounter型流式細(xì)胞儀(德國Partec公司)、5427R型低溫高速離心機(jī)(德國Eppendrof公司)、HF240型細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海力申科學(xué)儀器公司)、TE22型轉(zhuǎn)膜儀、SE300型電泳儀(均購于美國Hoefer公司)、SpectramaxM3型多功能酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)、Mini-PROTEANTetra System型垂直電泳槽(美國Bio-Rad公司)。

1.3 方法

1.3.1 養(yǎng)正消積膠囊化學(xué)成分及靶點(diǎn)預(yù)測 中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(TCMSP)中分別輸入養(yǎng)正消積膠囊的主要成分黃芪、莪術(shù)、白花蛇舌草、半枝蓮進(jìn)行檢索并整理,獲得活性化合物和作用靶點(diǎn),使用R語言將與藥物活性成分相關(guān)的靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)進(jìn)行匹配映射,且繪制韋恩圖(Venn),將獲得的潛在抗肺腺癌的作用靶點(diǎn),構(gòu)建養(yǎng)正消積膠囊靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò),進(jìn)行KEGG通路分析和基因本體(GO)富集分析。

1.3.2 養(yǎng)正消積膠囊提取物制備 將養(yǎng)正消積配方粉添加至純DMSO溶液中,并在4 ℃條件下靜置12 h,離心機(jī)100 r/min離心20 min后過濾上清液。用平衡鹽溶液稀釋提取物,使用分光光度計(jì)在波長405 nm波長下進(jìn)行光密度定量化,以透光度0.25的溶液作為標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)用藥,將養(yǎng)正消積膠囊提取物命名為DME25用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將DMEM(含有濃度為10%的胎牛血清、濃度為1%雙抗)培養(yǎng)基于培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)中對人肺腺癌A549細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),觀察每日的生長情況。依據(jù)不同濃度將細(xì)胞分為空白對照組、DME25高(1∶200)、中(1∶1 000)、低(1∶5 000)濃度組。

1.3.4 CCK-8法測定DME25對人肺腺癌A549細(xì)胞增殖能力 將A549細(xì)胞(1×104個(gè)細(xì)胞/孔)接種到96孔板中,然后用不同濃度的DME25(1∶200、1∶1 000、1∶5 000)處理48 h。將10 μL CCK-8溶液添加到96孔板中。溫育3 h后,采用酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞吸光度值。

1.3.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將濃度為1×105個(gè)/mL的A549細(xì)胞接種至12孔板。細(xì)胞貼壁后,10 μL槍頭垂直于培養(yǎng)板背面劃痕,PBS清洗3次,將細(xì)胞隨機(jī)分為4組:對照組、DME25低、中、高濃度組,給予對應(yīng)濃度藥液處理后繼續(xù)培養(yǎng),分別于0、12、24 h時(shí)拍照觀察。并繪制24 h時(shí)各組細(xì)胞遷移距離的柱狀圖。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.3.6 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 將100 μL Matrigel用DMEM培養(yǎng)基稀釋后,加入Transwell上室。取不同濃度DME25干預(yù)24 h的對數(shù)生長期A549細(xì)胞,消化后放入不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中。將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×104個(gè)/mL的細(xì)胞接種至Transwell上室,混有血清和細(xì)胞的培養(yǎng)基緩慢加入下室。在37 ℃、5% CO2小室內(nèi)培養(yǎng)24 h后取出,細(xì)棉簽輕擦小室內(nèi)部未穿膜的細(xì)胞,固定20 min(固定物:4%多聚甲醛),染色20 min(染色物:結(jié)晶紫),顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)。

1.3.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測A549細(xì)胞凋亡率 將對數(shù)生長過程的A549細(xì)胞,按照每個(gè)孔4×105/個(gè)接種于6孔板內(nèi)。在37 ℃的培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)24 h,待細(xì)胞貼壁生長后,向?qū)嶒?yàn)組中加入提前配好的不同濃度DME25溶液,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。收集上述處理后的細(xì)胞,用提前預(yù)冷的無菌PBS溶液洗滌后加入1×Binding緩沖液100 μL,隨后加入Annexin V-FITC溶液和碘化丙啶溶液各5 μL。細(xì)胞放置在避光黑暗處,輕輕震蕩10 min后加1×Binding緩沖液400 μL搖勻,上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡率。

1.3.8 Western blot檢測PI3K激活劑對各組細(xì)胞中PI3K、AKT、mTOR、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、Beclin-1、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ表達(dá)的影響 在6孔板內(nèi)接種將密度為5×105個(gè)/mL的A549細(xì)胞,貼壁生長融合≥75%時(shí),將濃度相當(dāng)?shù)腄ME25干預(yù)細(xì)胞加入,在培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2)中培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞。各組細(xì)胞總蛋白的提取使用蛋白提取試劑盒,BCA試劑盒檢測蛋白濃度。100 ℃下將混合均勻蛋白樣品液與緩沖液變性5 min,進(jìn)行SDS-PAGE分離蛋白、轉(zhuǎn)膜、封閉,加一抗(1∶1 000稀釋的PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1抗體與β-actin抗體),于4 ℃孵育過夜,將二抗加至洗滌后的TBST,室溫避光孵育2 h,TBST洗膜、顯影,顯影設(shè)備為化學(xué)發(fā)光顯影試劑盒,β-actin為內(nèi)參,分析DME25對上述蛋白表達(dá)水平的影響。此后將細(xì)胞分為兩組,一組加中濃度DME25干預(yù),一組加入PI3K激活劑740Y-P干預(yù),置于培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2)培養(yǎng)48 h后收集提取蛋白,Western blot法檢測各組細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、Beclin-1、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ蛋白的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)數(shù)據(jù)庫研究養(yǎng)正消積膠囊治療肺腺癌的潛在作用靶點(diǎn)及機(jī)制

通過TCMSP平臺(tái)數(shù)據(jù)庫的檢索養(yǎng)正消積膠囊組份中重要的4種中藥,其中黃芪化學(xué)成分87個(gè),莪術(shù)81個(gè),半枝蓮94個(gè),白花舌蛇草37個(gè)。通過OB>30%和DL>0.18篩選得到這4種藥物的潛在活性成分莪術(shù)3個(gè),黃芪18個(gè),白花舌蛇草7個(gè),半枝蓮26個(gè)。

采用Genecard、GAD和Omim數(shù)據(jù)庫平臺(tái),檢索關(guān)鍵詞“l(fā)ung adenocarcinoma”,共得到肺腺癌的潛在作用靶點(diǎn)8 685個(gè),靶基因中歸屬于黃芪的152個(gè),莪術(shù)9個(gè),白花舌蛇草135個(gè),半枝蓮164個(gè),與肺腺癌基因取交集后共同靶點(diǎn)為8個(gè)。將黃芪-莪術(shù)-白花舌蛇草-半枝蓮與肺腺癌相關(guān)的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因?qū)隒ytoscape軟件,進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化,得到養(yǎng)正消積膠囊治療肺腺癌的有效活性成分。將黃芪-莪術(shù)-白花舌蛇草-半枝蓮治療肺腺癌的潛在的關(guān)鍵靶基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫平臺(tái),獲取各蛋白質(zhì)之間的關(guān)系,采用該平臺(tái)繪制蛋白關(guān)系網(wǎng)絡(luò),根據(jù)Degre≥24的節(jié)點(diǎn)制作出前20個(gè)關(guān)鍵蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)分別為MAPK1、TP53、JUN、AKT1、TNF、RELA、HSP90AA1、ESR1、MAPK14、FOS、IL6、RXRA、MAPK8、EGFR、CCND1、RB1、CXCL8、PRKCA、CDKN1A、MYC。后續(xù)的GO富集分析結(jié)果顯示,養(yǎng)正消積膠囊與肺腺癌相關(guān)的關(guān)鍵生物學(xué)功能主要為細(xì)胞對化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)、對氧化應(yīng)激的反應(yīng)、對藥物的反應(yīng)、對凋亡信號(hào)通路的負(fù)向調(diào)節(jié)、對缺氧的反應(yīng)、凋亡信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控、凋亡信號(hào)通路的調(diào)控等。KEGG通路富集分析顯示相關(guān)靶點(diǎn)主要富集的通路為脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、PI3K-AKT信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、癌癥中的蛋白糖、IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等,提示上述通路可作為研究養(yǎng)正消積膠囊抗肺腺癌療效的重要方向。見圖1。

2.2 CCK-8法測定DME25對人肺腺癌A549細(xì)胞增殖的影響

與對照組相比,低、中、高濃度DME25處理的A549細(xì)胞增殖能力下降,濃度越高細(xì)胞增殖能力越弱,且不同濃度組間細(xì)胞增殖能力比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

2.3 DME25對人肺腺癌A549細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

DME25處理后,細(xì)胞遷移、侵襲能力較對照組弱,且高濃度組<中濃度組<低濃度組<對照組(P<0.05)。見圖3及圖4。

2.4 DME25對人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡的影響

與對照組相比,DME25低、中及高濃度組中A549細(xì)胞的凋亡率均增高(P<0.05),且濃度越高,凋亡率越高。見圖5。

2.5 DME25對人肺腺癌A549細(xì)胞自噬的影響

Western blot結(jié)果顯示,A549細(xì)胞經(jīng)DME25干預(yù)24 h后,自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ的表達(dá)水平升高,同時(shí)促進(jìn)LC3Ⅰ向ILC3Ⅱ轉(zhuǎn)化,且Beclin-1蛋白水平也升高(P<0.05)。見圖6。

2.6 DME25對PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

與對照組相比,經(jīng)DME25干預(yù)對數(shù)生長期的A549細(xì)胞24 h后,DME25能降低p-P13K、p-mTOR和p-AKT蛋白的水平(P<0.05),而DME25對P13K、AKT、mTOR蛋白的表達(dá)無影響。見圖7。

2.7 PI3K激活劑740Y-P對PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

與對照組相比,加入50 μg/mL 濃度的740Y-P(PI3K激活劑)培養(yǎng)8 h后,p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表達(dá)均增多,Beclin-1、LC3Ⅱ、LC3Ⅱ表達(dá)減少、LC3Ⅰ比值均降低(P<0.05)。見圖8。

3 討論

養(yǎng)正消積膠囊是一種由黃芪、莪術(shù)、白花舌蛇草、半枝蓮等16味中藥材共同組成的中藥補(bǔ)益劑,具有扶正祛邪、解毒化瘀及健脾益腎等功效,對多種惡性腫瘤均具有良好的治療效果[9-10]。養(yǎng)正消積膠囊的藥理作用機(jī)制研究[11]顯示,該藥可通過作用于FAK、PI3K/Akt、HSP27及其受體c MET等來起到抑制腫瘤進(jìn)展的作用。一項(xiàng)納入11項(xiàng)研究的meta分析報(bào)告[12]顯示,與單純化療相比,養(yǎng)正消積膠囊與化療聯(lián)合治療非小細(xì)胞肺癌效果更優(yōu),且可減輕化療毒副反應(yīng)。陳曉萌等[13]研究也證實(shí)了養(yǎng)正消積膠囊對原發(fā)性肝癌具有明確的治療效果,且安全性較高。研究[14]發(fā)現(xiàn),當(dāng)細(xì)胞的凋亡受到抑制時(shí),便會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。本研究發(fā)現(xiàn),養(yǎng)正消積膠囊中四種中藥黃芪、莪術(shù)、白花舌蛇草、半枝蓮與肺腺癌密切相關(guān)的有效化合物槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、漢黃芩素等,通過MAPK1、TP53、JUN、AKT1、TNF、RELA、HSP90AA1、ESR1、MAPK14等基因,影響細(xì)胞對化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)、對氧化應(yīng)激的反應(yīng)、對藥物的反應(yīng)、對凋亡信號(hào)通路的負(fù)向調(diào)節(jié),可能是通過流體剪切應(yīng)力、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、PI3K-Akt及MAPK信號(hào)通路、癌癥中的蛋白糖、IL-17及TNF等信號(hào)通路發(fā)揮作用。進(jìn)而制備養(yǎng)正消積膠囊的提取物加入肺腺癌A549細(xì)胞后,通過表型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與對照組相比,DME25可降低A549細(xì)胞的增殖及遷移侵襲能力,提高細(xì)胞凋亡率,提示DME25對肺腺癌具有明確的治療效果。

細(xì)胞自噬指的是通過基因調(diào)控細(xì)胞自行結(jié)束生命的行為,與細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、發(fā)育及免疫反應(yīng)等多個(gè)生物學(xué)過程相關(guān),是目前新發(fā)現(xiàn)的癌癥治療靶點(diǎn)。LC3為細(xì)胞自噬活性的標(biāo)志性蛋白,其亞型有LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ。在自噬發(fā)生時(shí),LC3-Ⅰ可轉(zhuǎn)化為LC3-Ⅱ,故可通過LC3-Ⅱ/LC3-1值的高低來評(píng)估細(xì)胞的自噬水平[15]。現(xiàn)已證實(shí)[16],自噬相關(guān)基因Beclinl主要誘導(dǎo)自噬的啟動(dòng),是調(diào)節(jié)細(xì)胞正向自噬的最重要因子。研究顯示,A549細(xì)胞經(jīng)DME25干預(yù)24 h后,自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ的表達(dá)水平升高,同時(shí)促進(jìn)LC3Ⅰ向ILC3Ⅱ轉(zhuǎn)化,即ILC3Ⅱ/LC3Ⅰ升高,且Beclin-1蛋白水平也升高,提示養(yǎng)正消積膠囊可對腫瘤細(xì)胞的自噬過程也有著一定的促進(jìn)作用。

PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路是對腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)行為均有一定調(diào)節(jié)作用的信號(hào)通路。王軍等[17]研究亦證實(shí),抑制PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路可促進(jìn)人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的凋亡和自噬。本研究顯示,經(jīng)DME25干預(yù)的各組A549細(xì)胞中的p-PI3K、p-Akt及p-mTOR蛋白含量均低于對照組,Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值亦低于對照組,且呈劑量依賴性,提示DME25可能是通過下調(diào)A549細(xì)胞中PI3K、AKT磷酸化水平,促進(jìn)細(xì)胞自噬,進(jìn)而抑制PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路的促癌作用。

綜上,養(yǎng)正消積膠囊養(yǎng)通過下調(diào)肺腺癌A549細(xì)胞中PI3K、AKT、mTOR磷酸化水平,促進(jìn)細(xì)胞自噬,抑制PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路的促癌作用。