陳 靜,樊慧杰,耿 申,范菲菲

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州 450052

肺癌是我國危害嚴(yán)重的惡性腫瘤之一,其中非小細(xì)胞肺癌占據(jù)肺癌的85%以上[1]。肺癌早期臨床癥狀不明顯,患者確診時多已處于晚期,目前主要采用以鉑類為基礎(chǔ)的化療手段治療,但副作用較大且部分患者易產(chǎn)生耐藥性[2-3]。miRNA在肺癌組織或細(xì)胞系中表達(dá)異常,是肺癌潛在的治療靶點[4-5]。有研究[6]表明,在非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞中miR-654-3p表達(dá)降低。既往研究[7]顯示中醫(yī)藥可能通過作用于miRNA而調(diào)控肺癌細(xì)胞的生長及轉(zhuǎn)移,從而發(fā)揮治療作用。異丹葉大黃素(isorhapontigenin,ISO)是從中醫(yī)藥買麻藤中提取分離的一種中藥單體成分。研究[8-10]顯示,ISO可通過調(diào)控miR-145、miR-365a表達(dá),抑制膀胱癌細(xì)胞生長并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究分析了ISO調(diào)控miR-654-3p表達(dá)后對人肺腺癌A549細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力的影響,探討ISO對肺癌的治療作用以及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司提供ISO(純度≥98%,貨號32507-66-7);上海通派生物科技有限公司提供A549;美國Thermo Fisher公司提供實時熒光定量PCR試劑盒;北京天根生化提供miRNA提取試劑盒及其反轉(zhuǎn)錄試劑盒;美國Invitrogen公司提供LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑;北京索萊寶公司提供CCK-8試劑、Transwell小室及Matrigel。E-cadherin、N-cadherin和內(nèi)參GAPDH抗體以及山羊抗兔二抗為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品。

1.2 ISO干預(yù)對A549生物學(xué)行為影響的觀察

1.2.1實驗分組 A549細(xì)胞密度達(dá)到95%左右時,將其接種在6孔板(1×105個/孔),用含不同濃度(0、5、10、20 μmol/L)ISO的 DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h[11],分別記錄為對照組、ISO-L組、ISO-M組和ISO-H組。

1.2.2細(xì)胞增殖能力的檢測 分組培養(yǎng)后,將細(xì)胞接種于96孔板(1×103個/孔,每組3孔),在37 ℃含有體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,每孔加CCK-8溶液10 μL培養(yǎng)2 h,用微量板讀取器測量450 nm處每個孔的光密度(OD)值。以未處理細(xì)胞孔為空白對照。細(xì)胞增殖抑制率=(對照組OD-實驗組OD)/(對照組OD-空白組OD)×100%。

1.2.3細(xì)胞克隆形成能力的檢測 分組培養(yǎng)后,將A549細(xì)胞接種于6孔板(500個/孔,每組3孔),在37 ℃含有體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d。待肉眼可見的細(xì)胞集落出現(xiàn)后,丟棄培養(yǎng)基,用預(yù)冷PBS清潔細(xì)胞,每孔加甲醇固定20 min,棄甲醇,加結(jié)晶紫染色1 min,拍照并用Image J計數(shù)細(xì)胞克隆數(shù)量。大于50個細(xì)胞的集落為一個克隆。

1.2.4細(xì)胞遷移能力的檢測 用記號筆事先在6孔板背面每隔0.5 cm畫一橫線,橫穿過孔,每孔6條線。分組培養(yǎng)后,將細(xì)胞按1×105個/孔接種于6孔板(每組3孔),在37 ℃含有體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),直至細(xì)胞長滿。用10 μL槍頭在細(xì)胞單層劃線,此時為0 h,然后將其放入培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用Image J軟件檢測劃痕寬度(6條線間距離的均值)并計算劃痕愈合率。劃痕愈合率=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.2.5細(xì)胞侵襲能力的檢測 用Matrigel稀釋液涂抹Transwell小室的上室后固定5 h。分組培養(yǎng)后,將細(xì)胞接種于上室,將含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液600 μL加入下室,將小室在37 ℃含有體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。取出小室,多聚甲醛固定20 min,加結(jié)晶紫染色10 min,PBS洗滌,于顯微鏡下用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)6個高倍鏡視野下的侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.2.6細(xì)胞中miR-654-3p表達(dá)水平的檢測 分組培養(yǎng)后,用miRNA提取試劑盒提取細(xì)胞的小RNA,參照miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作,將小RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板,以U6為內(nèi)參,進(jìn)行實時熒光定量PCR。反應(yīng)體系: SYBR qPCR Master Mix 10 μL,正、反向引物各0.4 μL,cDNA 2 μL,雙蒸水7.2 μL。反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min預(yù)變性;95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算miR-654-3p相對表達(dá)量。miR-654-3p正向引物5’-GGGATGTCTGCTGACCA-3’,反向引物5’-CAGTGCGTGTCGTGGA-3’;U6正向引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’,反向引物5’-AACGCT TCACGAATTTGCGT-3’。

1.2.7細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)的檢測 采用Western blot法檢測。收集各組A549細(xì)胞,加RIPA裂解物裂解,12 000 r/min離心12 min,取上清,用BCA法檢測蛋白質(zhì)濃度。經(jīng)SDS-PAGE分離,轉(zhuǎn)膜、密封2 h,加入E-cadherin(1∶1 000)、N-cadherin和內(nèi)參GAPDH抗體(1∶2 000)4 ℃孵育24 h,PBS洗滌5次,加山羊抗兔二抗(1∶3 000)室溫孵育1 h,用Image J軟件分析條帶的灰度值。用GAPDH蛋白表達(dá)歸一化E-cadherin和N-cadherin蛋白的表達(dá)。

1.3 ISO干預(yù)聯(lián)合上調(diào)miR-654-3p表達(dá)對A549細(xì)胞生物學(xué)行為影響的觀察待A549細(xì)胞密度達(dá)到95%左右時,將其接種在6孔板(1×105個/孔),當(dāng)細(xì)胞生長匯合達(dá)80%時,分兩組,采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別轉(zhuǎn)染miR-NC和miR-654-3p模擬物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。轉(zhuǎn)染48 h后,加20 μmol/L ISO孵育24 h。然后參照1.2方法檢測細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移能力,以及miR-654-3p、E-cadherin和N-cadherin蛋白的表達(dá)。

1.4 ISO干預(yù)聯(lián)合下調(diào)miR-654-3p表達(dá)對A549細(xì)胞生物學(xué)行為影響的觀察待A549細(xì)胞密度達(dá)到95%左右時,將其接種在6孔板(1×105個/孔),當(dāng)細(xì)胞生長匯合達(dá)到80%時,分兩組,采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別轉(zhuǎn)染anti-miR-NC、anti-miR-654-3p(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。轉(zhuǎn)染48 h后,加20 μmol/L ISO孵育24 h。然后參照1.2方法檢測各指標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1 ISO干預(yù)對A549細(xì)胞生物學(xué)行為和miR-654-3p表達(dá)的影響對照組、ISO-L組、ISO-M組和ISO-H組Western blot、侵襲實驗及劃痕實驗結(jié)果見圖1、2,各指標(biāo)測定結(jié)果見表1。結(jié)果顯示,ISO干預(yù)后A549細(xì)胞中miR-654-3p表達(dá)量升高;細(xì)胞增殖抑制率升高,克隆形成數(shù)減少;劃痕愈合率、侵襲細(xì)胞數(shù)、N-cadherin蛋白表達(dá)水平均降低,E-cadherin蛋白表達(dá)水平升高;上述指標(biāo)的變化均呈劑量依賴性。

圖1 4組細(xì)胞中E-cadherin和N-cadherin蛋白的表達(dá)

表1 4組細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力相關(guān)指標(biāo)及miR-654-3p表達(dá)的比較(n=3)

2.2 ISO干預(yù)聯(lián)合上調(diào)miR-654-3p表達(dá)對A549細(xì)胞生物學(xué)行為的影響miR-NC和miR-654-3p模擬物組Western blot、侵襲實驗及劃痕實驗結(jié)果見圖3、4,各指標(biāo)測定結(jié)果見表2。與miR-NC組比較,miR-654-3p模擬物組克隆形成數(shù)減少,增殖抑制率升高;劃痕愈合率、侵襲細(xì)胞數(shù)、N-cadherin蛋白表達(dá)水平降低,E-cadherin蛋白表達(dá)水平升高。

圖3 miR-NC和miR-654-3p模擬物組細(xì)胞中E-cadherin和N-cadherin蛋白的表達(dá)

圖4 miR-NC和miR-654-3p模擬物組細(xì)胞劃痕實驗(上、中)和侵襲實驗(下)結(jié)果(×400)

表2 miR-NC和miR-654-3p模擬物組細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力相關(guān)指標(biāo)及miR-654-3p表達(dá)的比較(n=3)

2.3 ISO干預(yù)聯(lián)合下調(diào)miR-654-3p表達(dá)對A549細(xì)胞生物學(xué)行為的影響anti-miR-NC組和anti-miR-654-3p組Western blot、侵襲實驗及劃痕實驗結(jié)果見圖5、6,各指標(biāo)測定結(jié)果見表3。與anti-miR-NC組比較,anti-miR-654-3p組克隆形成數(shù)增加,增殖抑制率降低;劃痕愈合率、侵襲細(xì)胞數(shù)、N-cadherin蛋白表達(dá)水平增高,E-cadherin蛋白表達(dá)水平降低。

圖5 anti-miR-NC和anti-miR-654-3p組細(xì)胞E-cadherin和N-cadherin蛋白的表達(dá)

圖6 anti-miR-NC和anti-miR-654-3p組細(xì)胞劃痕實驗(上、中)和侵襲實驗結(jié)果(下)(×400)

表3 anti-miR-NC和anti-miR-654-3p組細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力相關(guān)指標(biāo)及miR-654-3p表達(dá)的比較(n=3)

3 討論

miR-654-3p通過靶向RASAL2,抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[12]。miR-654-3p表達(dá)上調(diào)可抑制卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲及克隆形成能力[13]。在結(jié)直腸癌組織中miR-654-3p表達(dá)降低,上調(diào)miR-654-3p可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移,促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14]。

本研究結(jié)果顯示,ISO可抑制肺腺癌A549細(xì)胞的增殖及克隆形成能力。N-cadherin表達(dá)上調(diào)時上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)被激活,而E-cadherin表達(dá)上調(diào)時EMT被抑制[15]。本研究結(jié)果表明,隨著ISO濃度的增加,A549細(xì)胞的遷移和侵襲能力以及N-cadherin的表達(dá)受到抑制,而E-cadherin表達(dá)水平增加,表明ISO可以抑制A549細(xì)胞的遷移和侵襲,其機(jī)制可能與抑制EMT有關(guān)。本研究結(jié)果還顯示,上調(diào)miR-654-3p表達(dá)聯(lián)合ISO干預(yù)可抑制A549細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力;而下調(diào)miR-654-3p表達(dá)聯(lián)合ISO干預(yù)后,A549細(xì)胞的增殖、克隆形成、遷移及侵襲能力恢復(fù)。這表明ISO可能通過促進(jìn)miR-654-3p的表達(dá)而發(fā)揮抗肺癌的作用。

綜上所述,ISO可通過促進(jìn)miR-654-3p表達(dá)而抑制A549細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力,miR-654-3p可能是ISO治療肺癌的潛在靶點,這為肺癌治療藥物的研發(fā)提供了新方向。但I(xiàn)SO抗癌機(jī)制較為復(fù)雜,其是否可通過調(diào)控其他非編碼RNA或信號通路而調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為尚需進(jìn)一步探究。