王 晨,夏 征,王光安,任樂寧

河南推拿職業(yè)學(xué)院針灸推拿系 河南洛陽 471023

番茄紅素(lycopene)是廣泛存在于蔬果中的類胡蘿卜素,人體無法自行合成,具有強烈的抗氧化、抗腫瘤、抗炎以及抗衰老等多種生理功能[1],能夠改善腎臟和肝臟的缺血再灌注(ischemia-reperfusion,IR)損傷[2-3]。PI3K/Akt信號通路存在于多種組織和細(xì)胞內(nèi),參與細(xì)胞生長、凋亡等多種生物學(xué)過程的調(diào)控[1]。PTEN是一種抑癌基因,可負(fù)反饋抑制PI3K/AKT信號通路的傳導(dǎo),參與IR損傷的調(diào)控[4]。本研究以線栓法建立大鼠腦IR模型,觀察番茄紅素對模型大鼠海馬組織學(xué)表現(xiàn)、細(xì)胞凋亡及PTEN及PI3K/AKt信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,探討番茄紅素對IR腦組織的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、材料及儀器雄性SD大鼠38只(180～200 g),購自北京維通利華公司 [SCXK(京)2015-0036],SPF級,飼養(yǎng)于恒溫23 ℃、晝夜節(jié)律光照條件下,自由進(jìn)食。番茄紅素購自美國Sigma公司。TUNEL凋亡檢測試劑盒購自美國羅氏公司。PI3K、p-Akt、PTEN、Bcl-2、Bax兔抗多克隆抗體購自英國Abcam公司。β-actin鼠抗多克隆抗體及二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。ECL化學(xué)發(fā)光液購自Millipore公司。蛋白定量試劑盒購自北京普利萊公司。Western blot系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.2 大鼠腦IR模型的建立方法線栓法建立大鼠腦IR模型,具體操作參考文獻(xiàn)[5-6]。結(jié)扎頸內(nèi)動脈2 h后緩慢取出線栓?？p合切口,抗生素預(yù)防感染。術(shù)后清醒后,采用ZeaLonga 5分制標(biāo)準(zhǔn)對大鼠進(jìn)行行為學(xué)評分[7]:無神經(jīng)缺損癥狀為0分;無法完全伸展左側(cè)前肢為1分;行走時向左側(cè)轉(zhuǎn)圈為2分;行走時向左側(cè)傾倒為3分;不能自發(fā)行走,痙攣、昏睡、意識喪失[8-9]為4分。1～3分為造模成功,0分和4分及死亡為造模失敗。

1.3 實驗分組實驗分為假手術(shù)組、模型組、番茄紅素組。最終共36只用于實驗,每組12只。假手術(shù)組插入線栓但不結(jié)扎血管,余2組均建立IR模型。建模成功24 h后,番茄紅素組按10 mg/kg灌胃番茄紅素(玉米油配置),1次/12 h,連續(xù)7 d;假手術(shù)組和IR模型組給予等劑量玉米油灌胃,連續(xù)7 d。

1.4 大鼠腦組織學(xué)觀察①TCC染色:治療結(jié)束后,每組取3只大鼠斷頭取腦,等滲鹽水沖洗,-20 ℃冰凍20 min,然后置于模具中,自視交叉水平做等距離連續(xù)冠狀切片,片厚2 mm。將切片放于37 ℃ TTC溶液中避光孵育30 min,多聚甲醛固定24 h,拍照,利用Image-Pro Plus5.0圖像處理軟件分析。②HE染色:治療結(jié)束后,每組取3只大鼠,灌注固定,取海馬組織,制備低溫冰凍切片,常規(guī)HE染色,顯微鏡下觀察。

1.5 大鼠海馬組織細(xì)胞凋亡的檢測治療結(jié)束后,每組取3只大鼠,灌注固定取海馬組織,制備低溫冰凍切片,每只大鼠選取海馬CA3區(qū)組織切片3張,TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡,按試劑盒說明操作。每張切片選取5個視野(200×),計數(shù)棕褐色染色細(xì)胞(凋亡細(xì)胞)和細(xì)胞總數(shù),計算細(xì)胞凋亡率。

1.6 大鼠海馬組織中PI3K、p-Akt、PTEN、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的檢測每組取3只大鼠,斷頭取腦后固定,取海馬組織,Western blot法測定目的蛋白表達(dá)水平。一抗包括PI3K、p-Akt、PTEN、Bcl-2、Bax和β-actin抗體。ECL試劑發(fā)光,凝膠成像儀觀察成像,用Quaulity One軟件分析條帶灰度值,以目的蛋白與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值表示目的蛋白表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。3組大鼠各指標(biāo)的比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用SNK-q檢驗,檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠腦梗死面積和海馬神經(jīng)元形態(tài)TTC染色結(jié)果(圖1)顯示,模型組大鼠腦梗死面積顯著大于假手術(shù)組,番茄紅素組小于模型組。HE染色結(jié)果(圖2)顯示,假手術(shù)組大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元形態(tài)正常,排列致密,結(jié)構(gòu)清晰,未見細(xì)胞壞死。模型組細(xì)胞稀疏,細(xì)胞核大,胞核固縮、深染,間隙增大,壞死神經(jīng)元明顯增多。番茄紅素組神經(jīng)元形態(tài)大多正常,壞死神經(jīng)元較模型組減少。

圖1 假手術(shù)組(上)、模型組(中)和番茄紅素組(下)大鼠腦梗死面積(TTC染色)

圖2 假手術(shù)組(左)、模型組(中)及番茄紅素組(右)大鼠海馬組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)(HE,×400)

2.2 3組大鼠海馬組織中細(xì)胞凋亡率的比較TUNEL染色結(jié)果(圖3、表1)顯示,模型組細(xì)胞凋亡率大于假手術(shù)組,番茄紅素較模型組降低。

2.3 3組大鼠海馬組織中PI3K、p-Akt、PTEN、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的比較見表1。與假手術(shù)組比較,模型組海馬組織中PTEN、Bax表達(dá)水平升高,PI3K、Akt、Bcl-2表達(dá)水平降低。與模型組比較,番茄紅素組PTEN、Bax表達(dá)水平降低,PI3K、p-Akt、Bcl-2表達(dá)水平增高。

表1 3組大鼠海馬組織中細(xì)胞凋亡率及PI3K、p-Akt、PTEN、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的比較

3 討論

番茄紅素是廣泛存在于自然界植物中的天然色素。番茄紅素能夠通過減輕氧化應(yīng)激和激活PI3K/Akt信號通路,減少阿爾茨海默病模型大鼠神經(jīng)元的凋亡[1],減輕缺血缺氧誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞損害[10];降低臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷[11],具有強大的抗氧化、抗腫瘤、抗炎等生物活性。本研究結(jié)果顯示,番茄紅素能夠減輕IR誘導(dǎo)的大鼠神經(jīng)元凋亡,減小腦梗死面積,具有神經(jīng)保護(hù)作用。

多項研究結(jié)果顯示,抑制PTEN繼而激活PI3K/Akt信號通路能夠改善IR誘導(dǎo)的神經(jīng)缺損癥狀[4,8-12];還能夠抑制肝臟[13]IR損傷。Bax是促凋亡基因,Bcl-2是抑制凋亡基因,兩者廣泛分布于線粒體內(nèi)膜、核膜、細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。本研究結(jié)果顯示,與模型組比較,番茄紅素組大鼠海馬組織中PTEN、PI3K蛋白表達(dá)降低,Akt信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)升高,Bcl-2蛋白表達(dá)升高,Bax蛋白表達(dá)降低。因此推測,番茄紅素可能通過抑制PTEN表達(dá),激活PI3K/Akt信號通路,促進(jìn)Akt的磷酸化,繼而調(diào)控Bax、Bcl-2等信號分子的表達(dá),從而抑制IR大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡。

綜上所述,番茄紅素可以抑制IR海馬神經(jīng)元的凋亡,具備一定的神經(jīng)保護(hù)作用,可能具有治療腦梗死的應(yīng)用潛力。