潘楨婕,李攀陽(yáng),李 磊,冀建偉,白 倩,李志業(yè)

1)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部 鄭州 450014 2)河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校組織胚胎學(xué)教研室 鄭州 451191 3)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室 鄭州 450001 4)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科 鄭州 450014

奧沙利鉑在結(jié)直腸癌、乳腺癌、胃癌等實(shí)體腫瘤的治療中取得了良好的療效,但在治療過(guò)程中誘發(fā)的周圍神經(jīng)毒性可嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。研究[2]發(fā)現(xiàn)奧沙利鉑可誘導(dǎo)大鼠周圍神經(jīng)毒性,出現(xiàn)神經(jīng)病理性疼痛,與增加鈉離子通道蛋白Nav1.6的表達(dá)有關(guān)。DiBAC4(3)是負(fù)離子熒光染料,具有親脂性[3-5],對(duì)膜電位敏感,可以隨著細(xì)胞膜電位的改變而進(jìn)出細(xì)胞膜[6-7]。當(dāng)DiBAC4(3)與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)即可發(fā)出熒光,熒光的變化可反映離子通道改變對(duì)膜電位的影響,進(jìn)而反映神經(jīng)元興奮性的變化[8-10]。Nav1.6由SCN8A基因編碼,是一種鈉離子通道蛋白亞型。本研究在激光共聚焦顯微鏡下觀察抑制Nav1.6表達(dá)后大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞膜電位的動(dòng)態(tài)變化,以及大鼠機(jī)械痛縮足閾值和冷痛閾值的變化,探討Nav1.6在奧沙利鉑誘導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、儀器與動(dòng)物奧沙利鉑購(gòu)于齊魯制藥(海南)有限公司(產(chǎn)品批號(hào):FA1E9011B),DMEM購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司,胎牛血清購(gòu)于美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司,SCN8A-siRNA-1、SCN8A-siRNA-2和SCN8A-siRNA-3由上海吉瑪公司合成,β-actin抗體購(gòu)于武漢三鷹生物公司,Nav1.6抗體及其二抗購(gòu)于以色列Alomone Labs公司;激光共聚焦顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品,Von-Frey纖維測(cè)痛儀為上海玉研公司產(chǎn)品;PC12細(xì)胞來(lái)源于鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室;SPF清潔級(jí)、體重180～220 g成年雄性SD大鼠購(gòu)于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 奧沙利鉑對(duì)PC12細(xì)胞Nav1.6表達(dá)的影響選用DMEM培養(yǎng)液,置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)PC12細(xì)胞,隔天換液,待細(xì)胞密度達(dá)70%～80%后,接種于6孔板,細(xì)胞分3組,分別加入終濃度為0.00、0.02和0.05 μmol/L的奧沙利鉑48 h。胰蛋白酶消化細(xì)胞45 s。收集細(xì)胞于EP管中,4 ℃、1 000 r/min離心5 min,棄上清液,重復(fù)兩遍。EP管中加入500 μL細(xì)胞裂解液,吹打后冰盒上孵育5 min,低溫離心機(jī)12 000 r/min離心5 min。收集上清液,置100 ℃的水浴鍋5 min。測(cè)蛋白濃度,等量上樣。采用Western blot檢測(cè)Nav1.6的表達(dá)。分離膠電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜。用50 g/L脫脂奶封閉2 h。洗滌后加入Nav1.6抗體(按1∶200稀釋),低溫4 ℃過(guò)夜。用TBST洗滌3遍,然后加二抗(按1∶1 000稀釋)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。采用Image J軟件分析,以Nav1.6與β-actin條帶灰度值比值作為Nav1.6的表達(dá)水平。

1.3 抑制Nav1.6表達(dá)對(duì)奧沙利鉑作用后的PC12細(xì)胞膜電位的影響

1.3.1實(shí)驗(yàn)分組 PC12細(xì)胞分為奧沙利鉑組、對(duì)照組、SCN8A-siRNA-1組、SCN8A-siRNA-2組、SCN8A-siRNA-3組。奧沙利鉑組是用含終濃度為0.05 μmol/L奧沙利鉑培養(yǎng)的PC12細(xì)胞,對(duì)照組是正常培養(yǎng)的PC12細(xì)胞。SCN8A-siRNA-1、SCN8A-siRNA-2、SCN8A-siRNA-3組:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞,以每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中,加入2 mL含0.05 μmol/L奧沙利鉑的DMEM培養(yǎng)液,置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細(xì)胞密度達(dá)30%～50%時(shí)轉(zhuǎn)染。先將5 μL Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑加入200 μL無(wú)血清、無(wú)抗生素的DMEM中混勻室溫靜置 5 min,分別加入5 mL SCN8A-siRNA-1、SCN8A-siRNA-2或SCN8A-siRNA-3混勻,室溫靜置 25 min,加入含PC12細(xì)胞的DMEM培養(yǎng)液,置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育6 h后終止轉(zhuǎn)染。更換含胎牛血清和青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3.2Nav1.6表達(dá)的檢測(cè) 收集各組細(xì)胞,采用1.2中的Western blot法檢測(cè)Nav1.6的表達(dá)。

1.3.3膜電位的檢測(cè) 將各組PC12細(xì)胞以1×104個(gè)/mL的密度接種于激光共聚焦專用皿上,用PBS潤(rùn)洗5遍,皿中保留少量PBS以保持細(xì)胞浸潤(rùn);添加含有鉀通道阻滯劑和鈣通道阻滯劑的細(xì)胞外液,用NaOH調(diào)節(jié)至pH 7.4。將終濃度為0.25 μmol/L的DiBAC4(3)加入細(xì)胞外液,同時(shí)進(jìn)入熒光動(dòng)態(tài)掃描,保留染液,檢測(cè)熒光強(qiáng)度的變化。激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm,熒光波長(zhǎng)為530 nm,間隔5 s掃描1次,共計(jì)5 min。采用Image J軟件分析。

1.4 奧沙利鉑對(duì)大鼠機(jī)械痛縮足閾值及冷痛閾值的影響配制完全溶解于葡萄糖注射液的奧沙利鉑,終濃度為2 g/L。SD大鼠24只隨機(jī)分為3組,每組8只。分別給予0(對(duì)照組)、2和4 mg/kg奧沙利鉑腹腔注射,每2 d注射1次,共6次。采用Von-Frey纖維測(cè)痛儀和冷板檢測(cè)大鼠給藥后第0、7、15、21天的機(jī)械痛縮足閾值及冷痛閾值,檢測(cè)時(shí)間均設(shè)在上午9:30～11:30。

1.5 抑制Nav1.6的表達(dá)對(duì)奧沙利鉑作用的大鼠機(jī)械痛縮足閾值及冷痛閾值的影響SD大鼠24只分為3組:對(duì)照組、奧沙利鉑組和SCN8A-siRNA-3組,每組8只。奧沙利鉑組給予4 mg/kg奧沙利鉑腹腔注射,每2 d注射1次,共6次。SCN8A-siRNA-3組在奧沙利鉑注射后第7天背根神經(jīng)節(jié)(DRG)顯微注射SCN8A-siRNA-3。對(duì)照組不處理。異氟烷麻醉大鼠,剔去大鼠背部毛發(fā)備皮,碘伏擦拭,以髂嵴為坐標(biāo)點(diǎn)沿脊柱左側(cè)方向,將皮膚劃開(kāi)2 cm,暴露筋膜層,并劃破到達(dá)肌肉層,夾開(kāi)棘突、橫突、關(guān)節(jié)突,暴露L4、L5的DRG;立體定位儀抽吸2 μL SCN8A-siRNA-3,每個(gè)DRG分別注射1 μL,注射時(shí)間為5 min。采用1.4的方法檢測(cè)建模第0、3、7、11、15、18、21天大鼠機(jī)械痛縮足閾值及冷痛閾值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0分析。各組PC12細(xì)胞Nav1.6表達(dá)的比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠機(jī)械痛縮足閾值及冷痛閾值的比較采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 奧沙利鉑對(duì)PC12細(xì)胞Nav1.6表達(dá)的影響見(jiàn)表1。奧沙利鉑增加了PC12細(xì)胞Nav1.6的表達(dá)。選用0.05 μmol/L奧沙利鉑用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 奧沙利鉑作用后3組PC12細(xì)胞Nav1.6表達(dá)的比較

2.2 抑制Nav1.6表達(dá)對(duì)奧沙利鉑作用的PC12細(xì)胞膜電位的影響

2.2.1各組PC12細(xì)胞Nav1.6表達(dá)水平的比較 見(jiàn)表2。SCN8A-siRNA轉(zhuǎn)染抑制了經(jīng)奧沙利鉑處理的PC12細(xì)胞Nav1.6的表達(dá),SCN8A-siRNA-3的抑制效果最好。

表2 各組PC12細(xì)胞Nav1.6表達(dá)水平的比較

2.2.2各組PC12細(xì)胞膜電位的熒光強(qiáng)度變化 見(jiàn)圖1。與奧沙利鉑組相比,SCN8A-siRNA-1、SCN8A-siRNA-2和SCN8A-siRNA-3組細(xì)胞膜電位熒光強(qiáng)度變化均減慢,后兩組變化更明顯。

A:奧沙利鉑組;B:SCN8A-siRNA-1組;C:SCN8A-siRNA-2組;D:SCN8A-siRNA-3組;1～5:分別為10 s、20 s、30 s、1 min、5 min

2.3 奧沙利鉑對(duì)大鼠機(jī)械痛縮足閾值及冷痛閾值的影響見(jiàn)圖2。奧沙利鉑可降低大鼠的機(jī)械痛縮足閾值和冷痛閾值。

1:對(duì)照組;2:2 mg/kg奧沙利鉑組;3:4 mg/kg奧沙利鉑組;上:F組間=209.553,F時(shí)間=40.807,F交互=36.561,P均<0.001;下:F組間=83.799,F時(shí)間=38.537,F交互=23.741,P均<0.001;*:與1相比,P<0.05;#:與2相比,P<0.05

2.4 抑制Nav1.6表達(dá)對(duì)奧沙利鉑作用的大鼠機(jī)械痛縮足閾值及冷痛閾值的影響見(jiàn)圖3。與奧沙利鉑組相比,在siRNA注射后第18和21天SCN8A-siRNA-3組機(jī)械痛縮足閾值及冷痛閾值均升高。

1:對(duì)照組;2:SCN8A-siRNA-3組;3:奧沙利鉑組;上:F組間=201.306,F時(shí)間=19.489,F交互=26.367,P均<0.001;下:F組間=103.576,F時(shí)間=29.879,F交互=34.236,P均<0.001;*:與1和3比較,P<0.05

3 討論

高分化的PC12細(xì)胞具有交感神經(jīng)元的形態(tài)[11-12]。由于PC12細(xì)胞膜上的離子通道特性與神經(jīng)元類似,因此其在神經(jīng)科學(xué)研究中被廣泛使用[12]。本研究結(jié)果顯示奧沙利鉑作用后PC12細(xì)胞Nav1.6的表達(dá)增加,而SCN8A-siRNA-1、SCN8A-siRNA-2、SCN8A-siRNA-3均可有效抑制PC12細(xì)胞Nav1.6的表達(dá)。DRG顯微注射SCN8A-siRNA-3后,奧沙利鉑誘導(dǎo)的周圍神經(jīng)痛大鼠的機(jī)械痛縮足閾值及冷痛閾值升高,表明通過(guò)調(diào)低鈉離子通道亞型Nav1.6的表達(dá),可以緩解奧沙利鉑誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛。

激光共聚焦顯微鏡利用熒光探針在細(xì)胞膜內(nèi)外分布的瞬時(shí)變化而檢測(cè)出膜電位的動(dòng)態(tài)改變,適用于檢測(cè)非興奮細(xì)胞的平均膜電位變化,被測(cè)量細(xì)胞需浸在含有DiBAC4(3)的細(xì)胞外液中。它與傳統(tǒng)膜片鉗相比較,避免了使用微電極對(duì)細(xì)胞所造成的損傷[13-14]。本研究結(jié)果顯示SCN8A-siRNA-2、SCN8A-siRNA-3組鈉離子進(jìn)入細(xì)胞的速度明顯減慢,使靜息細(xì)胞膜電位去極化程度明顯減慢。

綜上所述,降低鈉離子通道亞型Nav1.6的表達(dá)可減緩鈉離子透過(guò)細(xì)胞膜傳導(dǎo)的神經(jīng)沖動(dòng),膜電位的改變降低了細(xì)胞興奮性,最終可緩解奧沙利鉑誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛。