唐婕，嚴建

1 湖南中醫(yī)藥大學 湖南長沙 410208

2 湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 湖南長沙 410021

潰瘍性結腸炎是一種病變在黏膜及黏膜下層形成潰瘍的非特異性炎癥性腸病，今年發(fā)病率逐年上升[1]，至今UC 發(fā)病原因沒有文獻明確闡述，其發(fā)病機制與遺傳、免疫、腸道微生物與其環(huán)境的相互作用有關，臨床癥狀主要為發(fā)熱、腹痛、腹瀉、黏液膿血便、里急后重，病程日久可致癌變[2]。治療潰瘍性結腸炎的著手點在于保護腸黏膜、抗炎止血、修復腸壁潰瘍、調節(jié)腸道菌群、修復平衡免疫屏障等為主[3]。西醫(yī)在治療潰瘍性結腸炎常使用水楊酸制劑、糖皮質激素、免疫抑制劑、生物制劑、益生菌等，但此病病程長，治療難度大，長期使用存在肝腎毒性、藥物劑量依賴、激素撤減過程出現病情反復、機會性感染[4-5]等副作用，生物制劑效果較好但價格昂貴，長期治療家庭經濟負擔重等弊端[6-8]。故患者的長期生活質量不理想[9]。

白芷味辛，性溫，具散寒止痛、燥濕止帶、消腫排膿的功效?，F代藥理學研究顯示白芷有解熱鎮(zhèn)痛、消炎、抗菌以及抗腫瘤作用[10-12]，白芷主要成分香豆素類（異歐前胡內酯 （isoimperatorin）、別異歐前胡內酯（alloisoimpera-torin）、白當歸腦 （byakangelicol）等）所制成的化合物作為抗凝和抗血栓藥廣泛運用于臨床[13]。臨床處方常加白芷用以治療潰瘍性結腸炎，但白芷作用于UC 的治療機制未有人研究，本研究通過網絡藥理學篩選白芷活性成分、作用靶點及信號通路，從而與UC 構建潛在網絡關系，推斷可能作用機制，并通過分子對接進行驗證。

材料與方法

1 白芷有效活性化合物及作用靶點篩選

以“白芷”為檢索詞，將篩選條件調整為“口服利 用 度（OB）≥30%”和“類 藥 性（DL）≥0.18”，在TCMSP（https：//tcmspw.com/tcmsp.php） 數 據庫檢索白芷的有效成分及所對應蛋白質靶點，利用 Uniprot（https：//www.uniprot.org）數 據 庫 選 擇以“Reviewed”“Human”為條件，對蛋白質靶點轉化為對應基因靶點并規(guī)范。最后將數據導入Cytoscape3.8.2，繪制“白芷-活性成分-作用靶點”圖。

2 潰瘍性結腸炎靶點收集

以“ulcerativecolitis”為疾病檢索詞，分別在Drugbank https：//www.drugbank.ca）、GeneCards （https：//）www.genecards.org）、OMIM （http：//omim.org）、TTD（http：//db.idrblab.net/ttd/）四個疾病數據庫進行檢索，收集潰瘍性結腸炎相關靶點結果的并集。將獲取的成分靶點與疾病靶點通過Venny（http：//jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html）平臺獲取結果，并繪制韋恩圖。

3 蛋白互作PPI 網絡的構建

通過韋恩圖獲得的交集基因導入String（https：//string-db.org）數據庫獲取蛋白相互作用關系并構建PPI 網絡，將獲得的tsv 文件導入Cytoscape，利用Network S Analyze 和CytoNCA 內置插件進行網絡分析篩選，最終得到核心蛋白。

4 GO 和KEGG 富集分析

將活性成分與疾病共有靶點錄入Metascape（http：//metascape.org/gp/index.html）平臺，分析其細胞成分（CC），分子功能（MF），生物過程（BP）及代謝通路（KEGG）并進行富集分析，并對數據進行可視化處理。將富集分析結果導入Cytoscape 繪制“交集靶點-潰瘍性結腸炎-信號通路”圖。

5 分子對接

計算“活性成分- 靶點”網絡圖中活性成分的度值，將degree 值＞6 的3 個活性成分與查閱文獻后保留的3 個密切度高的核心蛋白分子進行對接，在PubChem 數 據 庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）獲取活性成分的2D 結構，并借助Chem3D 軟件進行結構優(yōu)化。PDB（http：//www.rcsb.org）數據庫獲取蛋白空間結構，通過AutoDockTools 軟件對蛋白受體和配體進行去水、加氫等處理后，AutoDock-Vina 進行分子對接計算結合能，Pymol 進行數據可視化處理。

結 果

1 白芷有效活性化合物及靶點篩選

經TCMSP 數據庫，以OB＞30%，DL＞0.18 為條件，共獲得活性成分22 種，作用靶點158 個，在uniprot 規(guī)范后最終獲得基因靶點61 個，對應有效化合物10 種，具體對應情況見表1，其潛在作用見圖1。

圖1 白芷成分-靶點圖

表1 白芷有效成分

2 潰瘍性結腸炎靶點整合

將4 個數據庫檢索的潰瘍性結腸炎靶點進行整合，Drugbank 獲得58 個 Genecards 篩選后獲得1208個，OMIM 獲得191 個，TTD 獲得39 個，去除重復值得到1329 個疾病基因。取疾病與藥物靶點的交集，獲得17 個共有基因，見圖2。

圖2 藥物-疾病Vene 圖

3 蛋白互作PPI 網絡的構建

將獲得的數據錄入String 進行網絡分析，得到17個節(jié)點，51 條邊，平均Degree 值為6，平均局部聚類系數為0.744，預期邊數為11，PPI 富集p 值為＜ 1.0e-16，見圖3。將獲得的數據導入Cytoscape3.8.2，使用Network Analyze 功能，根據Degree＞6 篩選得到8 個基因核心互作網絡。

圖3 交集靶點PPI

4 GO 富集分析

通過Metascape 數據庫進行GO 富集分析，得到972 條生物過程（BP），主要與對雌二醇的反應、對無機物質的反應、管形態(tài)發(fā)生、對傷害的反應、對有毒物質的反應、對激素的反應、凋亡信號通路、成纖維細胞增殖的調節(jié)、細胞周期的負調節(jié)、血液循環(huán)、傷口愈合等功能相關；得到15 條細胞組成（CC），主要為膜筏、細胞器外膜、黏著、轉錄調節(jié)因子復合物、細胞體；分析得到78 條分子功能（MF），主要為半胱氨酸型內肽酶活性參與細胞凋亡的執(zhí)行階段、蛋白質均質二聚活性、蛋白質結構域特異性結合、蛋白酶結合、蛋白激酶結合、泛素蛋白連接酶結合、脂質結合。根據富集基因數目繪制氣泡圖，見圖4。

圖4 GO 分析氣泡圖

5 KEGG 富集通路分析

通過Metascape 數據庫進行KEGG 通路富集分析，共得到富集通路84 條，結果顯示基因主要富集在乙型肝炎、結直腸癌、小細胞肺癌、人T 細胞白血病病毒1 型感染、內分泌抵抗、5-羥色胺能突觸、癌癥蛋白聚糖、胰腺癌、微核糖核酸、癌癥轉錄失調，見圖5。使用Cytoscape3.8.2 繪制“關鍵靶點-潰瘍性結腸炎-信號通路”，見圖6。

圖5 KEGG 信號通路氣泡圖

圖6 關鍵靶點篩選

6 分子對接分析

為了進一步佐證并預測白芷與UC 的作用機制，使用AutoDock Vina 軟件進行分子對接，將度值最高的3 個活性 成分（beta-sitosterol、Stigmasterol、Prangenidin）經查閱文獻后與3 個密切度較高的蛋白（CASP3、PTGS2、BAX）進行分子對接，見圖7。據相關文獻研究成分與蛋白結合自由度能小于-5kcal/mol認為二者結合穩(wěn)定。結果顯示活性成分與蛋白結合能均＜-6kcal/mol，見表2。以上對接結果表明了白芷有效活性成分與潰瘍性結腸炎的靶點基因有著很好的結合作用。

圖7 分子對接示意圖

表2 白芷活性成分與UC 靶基因對接評分表

討 論

潰瘍性結腸炎已被WTO 列入國際難治性疾病和終身型疾病，現在認為發(fā)病原因主要是腸道屏障的破壞、腸道微生物菌群失調與免疫屏障的失衡有關，故主要治療途徑，主要通過腸道屏障，微生物途徑，免疫屏障途徑著手。多項研究表明美沙拉嗪、腸道益生菌、西藥對潰瘍性結腸炎的病情發(fā)展控制效果不太理想，藥物副作用不可避免。在此同時，有研究證實中藥對潰瘍性結腸炎的病情控制及癥狀的緩解均取的了良好的療效，且不良反應少。潰瘍性結腸炎病情的發(fā)生發(fā)展受到多種條件因素的影響，多種細胞成分及多條通路的調控。白芷在現代藥理學研究中證實有消炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、止血、抗腫瘤的作用，但對于治療UC 的作用機制尚不明確。本研究通過網絡藥理學收集白芷主要活性成分作用靶點與UC 疾病靶點篩選后發(fā)現其作用關系并通過分子對接技術證實其可行性，探討其可能作用機制。

筆者通過網絡藥理學由藥物-成分-靶點圖可知白芷所含主要成分為β- 谷甾醇、豆甾醇、別歐前胡素。相關研究表明β-谷甾醇可以以濃度依賴的方式降低實驗性結腸炎小鼠腸道組織中促炎因子TNF-α，IL-6 和IL-1β 的水平。還可以治療腸上皮細胞，可顯著增加抗菌肽的表達并降低細胞內鼠傷寒沙門氏菌的存活率[14]，顯示了β-谷甾醇對致病菌的多種作用。炎癥性腸?。↖BD）伴有腸道微生物群失衡和調節(jié)性T（Treg）/T 輔助者17（Th17）免疫失衡。有關研究顯示，豆甾醇已顯示出抗炎作用，豆甾醇可以增強腸道微生物群衍生的短鏈脂肪酸（SCFAs）尤其是丁酸鹽的產生，丁酸鹽介導的PPARγ 激活恢復了Treg / Th17 細胞的平衡，豆甾醇還可以改變葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導的結腸炎模型中的腸道微生物群[15]。β-谷甾醇和豆甾醇均顯著抑制結腸縮短，降低糞便血紅蛋白含量及結腸中遠端結腸炎的嚴重程度（P＜0.05）。明顯抑制了核因子kappa B 的激活，還降低了集落刺激因子-1 和炎癥主調節(jié)因子-kappa B 的核易位。豆甾醇顯著降低了結腸炎癥評分以及環(huán)加氧酶-2 和集落刺激因子-1 的表達，而β-谷甾醇則較低或無效[16]?？梢酝茰y通過這些機制，β-谷甾醇、豆甾醇可以對IBD 起到治療作用。別歐前胡素在多種癌癥模型中均表現出抗腫瘤活性作用，如肺癌，胃癌，乳腺癌，誘導急性髓系白血病HL-60 細胞凋亡等[17]。目前別歐前胡素對于腸道疾病方面研究尚少，可作為今后研究突破點。

根據網絡藥理學PPI 的數據結果，白芷作用于潰瘍性結腸炎的關鍵靶點為CASP3、BAX、CASP8、BCL-2、CASP9、PTGS2、ESR1 等。半 胱 天 冬 酶-3（CASP3）編碼的蛋白質是半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶，在細胞凋亡執(zhí)行階段起核心作用[18]。相關研究表明：炎癥性腸病患者的腸道組織通過減少屏障蛋白閉塞素的表達從而限制了CASP3 表達并防止通過內源途徑（由5-氟尿嘧啶刺激）或外源途徑（由腫瘤壞死因子刺激）誘導細胞凋亡，并降低了腸上皮細胞對凋亡的敏感性，可能促進炎癥性疾病后黏膜穩(wěn)態(tài)的恢復[19]。PTGS2 編碼環(huán)氧合酶-2（COX-2），腸道炎癥反應由于各種原因引發(fā)后刺激COX-2 表達增加，而COX-2 可促使花生四烯酸轉化為PGE2，PGE2 作為前列腺素和血栓素的前體，其生成的增加從而促使炎癥反應進一步加重，相關研究表明在潰瘍性結腸炎的活動期PGE2 血清濃度及尿液中的濃度均明顯上升[20-21]，促進腸道毛細血管舒張、產熱、產痛，作用于周圍神經末梢的EP1、EP2 受體，增加膜興奮性，進而激活痛覺感受器，引發(fā)或加重腹痛。白芷通過其主要成分呋喃香豆素通過抑制COX-2 調節(jié)花生四烯酸的代謝途徑[22]，PTGS2 編碼COX-2 減少，使得前列腺素、PGE2 合成減少，從而抑制炎結腸組織中的炎癥，從而起到治療UC 的效果。BAX 是編碼的蛋白質屬于BCL2 蛋白質家族，作為各種細胞活動的促凋亡調節(jié)劑，在線粒體的凋亡過程中發(fā)揮作用[23-26]，可通過促進CASP3 的激活，從而促進細胞凋亡[24-25，27]。相關研究表明，通過抑制COX-2、NF-κB 以及BAX和CASP3 凋亡蛋白的表達，來增加抗凋亡蛋白，抑制Bcl-2 的凋亡，減少腸上皮細胞的凋亡來維持腸黏膜屏障的穩(wěn)定性來治療UC[28]。相關研究表明，BAX 還與結直腸癌相關[29-31]。

從GO 分析里可知白芷通過影響腸道組織細胞的凋亡通路、對細胞周期的負調節(jié)、成纖維細胞增殖的調節(jié)、對局部傷口的愈合，局部血液循環(huán)實現參與細胞凋亡的執(zhí)行階段、蛋白質均質二聚活性、蛋白質結構域特異性結合、蛋白酶結合、蛋白激酶結合、泛素蛋白連接酶結合、脂質結合從而影響腸上皮組織連續(xù)性，影響腸黏膜屏障的穩(wěn)定性。通過這復雜的過程來治療潰瘍性結腸炎。

從KEGG 結果中可知白芷主要富集在乙型肝炎、結直腸癌、小細胞肺癌、人T 細胞白血病病毒1 型感染、內分泌抵抗、5-羥色胺能突觸、癌癥中的蛋白聚糖、胰腺癌、癌癥中的微核糖核酸、癌癥中的轉錄失調中。IBD 的致病因素中，腸道組織的炎癥性免疫應答反應發(fā)揮核心作用，同時免疫炎性反應也受到復雜的多方面因素調節(jié)，mi-RNA 在人體中廣泛存在，UC 特異相關性mi-RNA 的表達對UC 疾病的發(fā)生發(fā)展具有極大的相關性[32]。mi-RNA143 可以通過結合靶向自噬相關蛋白同源體2 基因上的3-UTR，來干擾腸上皮細胞的自噬作用，從而增強腸道組織的局部炎癥[33]，mi-RNA21 基因敲除后的小鼠與正常小鼠腸道菌群構成存在明顯差異，其通過影響定植的腸道菌群來促進UC 的發(fā)生，還可以通過作用于PTEN/NF-κB 信號通路的表達來影響腸道菌群定植和腸道炎癥的進展[34]。根據相關研究表明潰瘍性結腸炎與結直腸癌的發(fā)生存在必然聯系[35-37]。但相關機制闡明尚未明確，mi-RNA 在其中的作用機制只基于單個通路，相關研究表示在IBD 相關性結直腸癌發(fā)生發(fā)展中，miRNA-29a-5p/STAT3 信號軸發(fā)揮著重要作用，其正反饋作用通路可通過放大炎癥作用，抑制DNA 羥甲基化酶10-11轉位蛋白（TET）的表達[38]，mi-RNA-155 通過降低在多種腫瘤發(fā)生中起重要作用的靶蛋白HIF-1α 表達最終導致IBD 相關性結直腸癌發(fā)生[39]。mi-RNA 對于 UC 乃至IBD 從多角度多途徑的方式誘導其發(fā)生發(fā)展，其中的機制及對應治療值得我們進一步探索。筆者推測白芷可通過mi-RNA 這一通路作用于UC，通過調節(jié)腸道菌群，減輕腸道炎性反應，調節(jié)其免疫反應，從而達到降低其發(fā)生、減緩其發(fā)展的作用。

3 個主要化合物與核心靶點靶基因的分子對接顯示：β-谷甾醇、豆甾醇、別歐前胡素與核心靶基因CASP3、PTGS2、BAX 結合性較好，進一步佐證了網絡藥理學篩選的合理與可行性。

本研究基于網絡藥理學、生物信息學與虛擬分子對接的方法預測白芷單味重要治療UC 的作用機制，研究結果在一定研究基礎上闡明了白芷通過多成分、多靶點、多通路的共同作用治療UC 的作用機制，但由于白芷單味藥治療UC 的實驗研究尚少，且本研究僅從理論上探討白芷治療UC 的作用機制，缺乏實驗數據驗證，后續(xù)還將采用實驗的方式加以佐證本次理論預測，也將加以復方的方式加以研究，為治療UC 開發(fā)新思路、新方法。