王熙瀅，吳 點(diǎn)，劉雅杰，汪 鵬，王平航，胡長玉

（黃山學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，安徽屯溪 245041）

如今，食品的健康問題越來越受人們的關(guān)注，對(duì)健康的質(zhì)量要求也變得越來越高[1]。紅茶富含茶多酚、茶色素、茶多糖、茶蛋白、茶氨酸和咖啡因等功能成分，具有抗腫瘤、抗突變、抗衰老、抗疲勞、抗輻射、抗齲齒、消除重金屬毒害、代謝調(diào)節(jié)和生理調(diào)節(jié)、美容、抑制有害微生物、增強(qiáng)記憶及改善大腦功能等[2]醫(yī)療保健功效。

咖啡因是一種黃嘌呤生物堿化合物，具有提神和抗疲勞效果，是世界上使用最普遍的中樞神經(jīng)興奮劑。目前，消費(fèi)品市場上咖啡、茶、軟飲料及能量飲料十分暢銷的原因也是因?yàn)楹锌Х纫虺煞諿3]。咖啡因作為茶葉中的主要呈味物質(zhì)之一，咖啡占茶葉干物質(zhì)總含量的2%~5%[4]。經(jīng)常攝入高劑量的咖啡因會(huì)刺激中樞神經(jīng)、影響睡眠、增加血壓、提高類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的患病率、引起嬰兒早產(chǎn)等[5-8]。對(duì)于兒童、哺乳期婦女及某些病患者來說，茶葉中的咖啡堿成了他們望茶生畏的主要原因[9]。因此，如何盡可能地脫除紅茶中咖啡因具有一定的研究價(jià)值。

目前，脫咖啡因技術(shù)主要有水脫除、溶劑萃取、吸附分離和超臨界CO2萃取等傳統(tǒng)方法，以及后來發(fā)展的微生物和酶法降解咖啡因、培育低咖啡因茶樹等[10]。研究表明，對(duì)于茶鮮葉、蒸青葉或萎凋葉在85 ℃的熱水中快速浸取1 min，咖啡堿脫除率達(dá)71%，浸取3 min 后，咖啡堿的脫除率達(dá)83%，說明提高浸取時(shí)間可能會(huì)提高咖啡堿脫除率[11]。研究表明，加溫2~3 min，熱水溫度從80 ℃上升到90 ℃[12]，咖啡堿的脫除率可以從60.51%提高到72.26%，以1∶20 的茶水比于100 ℃下浸泡3 min，可脫除83%的咖啡因，而鮮葉中保留了95%的兒茶素。由于熱水高溫處理會(huì)導(dǎo)致茶鮮葉中多酚氧化酶失活，在揉捻及發(fā)酵酶活性難以達(dá)到制作紅茶要求[13-14]，為了提高紅茶中咖啡因脫除率，保持紅茶品質(zhì)，以紅茶為研究對(duì)象，通過單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化制作低咖啡因紅茶工藝，并對(duì)其品質(zhì)進(jìn)行分析，旨在為低咖啡因紅茶的制作工藝提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶鮮葉，谷雨前購于休寧榮山茶廠；多酚氧化酶（食品級(jí)生產(chǎn)批號(hào)21096582 酶活度10 000 U/g），青島隆川生物科技有限公司提供。

鹽酸、咖啡因、氧化鎂、甲醇（分析純），太倉滬試試劑有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

手提式萬能粉碎機(jī)，濟(jì)寧凌琛機(jī)械設(shè)備有限公司產(chǎn)品；發(fā)酵箱，廣州市尼科機(jī)械設(shè)備有限公司產(chǎn)品；QYGDW-s10a 型真空干燥箱，上海琦意工業(yè)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司產(chǎn)品；電子分析天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公公司產(chǎn)品；恒溫水浴鍋，上海聲彥超聲波儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

低咖啡因紅茶工藝流程圖見圖1。

圖1 低咖啡因紅茶工藝流程圖

1.3.2 操作要點(diǎn)

（1） 萎凋。將采摘的鮮葉在15~23 ℃下萎凋6~8 h，攤?cè)~厚度12~15 cm ，翻葉頻次2 h /次，得到萎凋葉。

（2） 熱水浸提、脫水。將萎凋葉浸泡在一定溫度的水中一定時(shí)間后撈出脫水得到處理葉。

（3） 加酶。用一定濃度的多酚氧化酶液噴灑處理葉，表面濕潤為宜，空白組噴灑蒸餾水。

（4） 揉捻。將萎凋葉與處理葉按一定比例混合揉捻0.5 h，從同一個(gè)方向先空揉再加壓，成塊后抖開再重復(fù)之前操作，利于保持芽葉完整性。

（5） 發(fā)酵。將經(jīng)揉捻處理的二次處理葉置于溫度30 ℃的恒溫發(fā)酵室，攤?cè)~厚度6~8 cm，保持濕度95%以上發(fā)酵5 h。

（6） 干燥。用烘干機(jī)分2 次烘干。在第1 次烘干結(jié)束后，待茶葉冷卻回潮后再進(jìn)行第2 次烘干。

（7） 篩分。用4.5 目和14 目的平圓篩機(jī)對(duì)毛茶的頭腳進(jìn)行分揀，除去過大的頭茶和過小的碎茶。利用風(fēng)力通過風(fēng)力分離器去除淡黃色片狀、碎片等。

（8） 挑揀。主要為人工挑揀。挑去紅茶中風(fēng)選后留下的紅片、紅筋、黃片等影響紅茶品相的低等茶。

（9） 提香。于70~80 ℃條件下提香2 h。

1.4 咖啡因脫除率的測(cè)定

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

（1） 標(biāo)準(zhǔn)液的制備。稱取咖啡因125 mg（純度不低于99%），按1∶4 的比例加入乙醇和蒸餾水，溶解并定容至250 mL，搖勻，相當(dāng)于每1 mL 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液含0.5 mg 咖啡因，吸取1.0，2.0，5.0，10.0 mL 上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，分別加蒸餾水定容至50 mL 作為系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，每1 mL 該系列標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中，分別相當(dāng)于含10，20，50，100 μg 咖啡堿。

（2） 處理液的制備。稱取1.0 g 的制備的紅茶樣葉，磨碎后置于500 mL 燒杯中，加入氧化鎂4.5 g，加入300 mL 沸水，沸水浴加熱20 min，每隔5 min晃動(dòng)燒瓶搖勻。沸水浴完成后，立即轉(zhuǎn)入抽濾機(jī)中進(jìn)行過濾，將濾液移入500 mL 容量瓶中，冷卻后用蒸餾水定容，混勻制成處理液待測(cè)。

（3） 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取適量咖啡因標(biāo)準(zhǔn)液置于HPLC 進(jìn)樣瓶中，分別以咖啡因標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度為5，10，25，50 μg/mL，按照高效液相色譜條件為檢測(cè)波長：紫外檢測(cè)器，波長280 mm；流動(dòng)相：取600 mL 甲醇加入1 400 mL 蒸餾水，混勻，過0.45 μm膜；流速0.5~1.5 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量10~20 μL 進(jìn)行測(cè)定。以咖啡因標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：Y=96.892X+523.64（R2=0.992 7）。

1.4.2 咖啡因含量的計(jì)算方法

參照GB/T 8312—2013，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品和處理樣品的峰面積進(jìn)行定量，將茶葉中咖啡因的含量表示為干態(tài)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定咖啡因含量，計(jì)算方法如下：

式中：C1——根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算得出的測(cè)定液中咖啡堿質(zhì)量濃度，μg/mL；

V1——樣品總體積，mL；

m——試樣的質(zhì)量，g；

ω——試樣干物質(zhì)含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），%。

1.4.3 咖啡因脫除率的計(jì)算

1.4.4 感官評(píng)分的測(cè)定

按照國標(biāo)GB/T 23776—2018，從干茶外形、香氣、滋味、葉底和湯色5 個(gè)方面對(duì)茶葉進(jìn)行專業(yè)品評(píng)，采用百分制評(píng)分。

茶葉感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 茶葉感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.4.5 產(chǎn)品品質(zhì)指標(biāo)的測(cè)定

氨基酸含量：按GB/T 8314—2013《游離氨基酸總量的測(cè)定》執(zhí)行。

總糖：采用蒽酮比色法測(cè)定總糖的含量。

1.5 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.5.1 浸提溫度對(duì)紅茶咖啡因脫除率及感官評(píng)分的影響

按照1.3.1 的工藝流程，按萎凋葉與處理葉比例1∶2 制作紅茶，其中處理葉按固定熱水浸提時(shí)間30 s，多酚氧化酶添加量2%，考查燙漂溫度（50，60，70，80，90 ℃） 對(duì)制作完成后的紅茶咖啡因脫除率以及感官評(píng)分的影響。

1.5.2 浸提時(shí)間對(duì)紅茶咖啡因脫除率及感官評(píng)分的影響

按照1.3.1 的工藝流程，其中固定熱水浸提溫度70 ℃，萎凋鮮葉與處理葉質(zhì)量比為1∶2，多酚氧化酶添加量2%，考查熱水浸提時(shí)間（0，15，30，45，60 s） 對(duì)紅茶咖啡因脫除率以及感官評(píng)分的影響。

1.5.3 萎凋鮮葉與處理葉的質(zhì)量比對(duì)紅茶咖啡因脫除率及感官評(píng)分的影響

按照1.3.1 的工藝流程，其中固定熱水浸提時(shí)間30 s，熱水浸提溫度70 ℃，多酚氧化酶添加量2%，考查萎凋鮮葉與處理葉質(zhì)量比（0∶1，1∶0，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4） 對(duì)紅茶咖啡因脫除率以及感官評(píng)分的影響。

1.5.4 多酚氧化酶添加量對(duì)紅茶咖啡因脫除率及感官評(píng)分的影響

按照1.3.1 的工藝流程，固定熱水浸提工藝條件為溫度70 ℃，萎凋鮮葉與處理葉質(zhì)量比為1∶2，浸提時(shí)間30 s。在茶堆上噴灑多酚氧化酶溶液后進(jìn)行揉捻，探討不同添加量（0，2%（酶活度200 U/g），4% （酶活度400 U/g），6% （酶活度600 U/g），8%（酶活度800 U/g）） 的多酚氧化酶液對(duì)紅茶咖啡因脫除率及感官評(píng)分的影響。

1.6 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為參考，采用Box-behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取浸提溫度（A）、浸提時(shí)間（B）、萎凋鮮葉與處理葉的質(zhì)量比（C） 3 個(gè)因素作為自變量，以咖啡因脫除率為評(píng)價(jià)指標(biāo)。分別以A、B、C 為代表，將每一個(gè)自變量的低中高試驗(yàn)水平分別以-1，0，1 進(jìn)行編碼，將咖啡因脫除率（Y） 記為響應(yīng)值，采用三因素三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化低咖啡因紅茶加工工藝。

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素與水平設(shè)計(jì)見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素與水平設(shè)計(jì)

1.7 數(shù)據(jù)處理

所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)為3 次重復(fù)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)的平均值。Excel 2016 用于數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，Origin pro 2018 用于數(shù)據(jù)繪制，Expert-Design 10.0 用于響應(yīng)面優(yōu)化分析、回歸模型方差分析和顯著差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 浸提溫度對(duì)紅茶咖啡因脫除率及感官評(píng)分的影響

浸提溫度對(duì)紅茶咖啡因脫除率及感官評(píng)分的影響見圖2。

圖2 浸提溫度對(duì)紅茶咖啡因脫除率及感官評(píng)分的影響

由圖2 可知，隨著溫度的升高咖啡因脫除率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在70 ℃達(dá)到最大值51.82%±1.41%。因?yàn)殡S著溫度的提升，咖啡因會(huì)在熱水中迅速溶解、浸出，使得茶葉中的咖啡因含量不斷減少，脫除率升高[15]。但是，當(dāng)溫度高于70 ℃時(shí)，咖啡因脫除率變化不顯著，同時(shí)高溫會(huì)使多酚氧化酶失活，從而使兒茶素不能被氧化成茶紅素，使紅茶色澤受到影響，造成紅茶感官評(píng)分下降。綜合考慮，選擇70 ℃作為浸提溫度是較適宜的。

2.1.2 浸提時(shí)間對(duì)紅茶咖啡因脫除率及感官評(píng)分的影響

浸提時(shí)間對(duì)紅茶咖啡因脫除率及感官評(píng)分的影響見圖3。

圖3 浸提時(shí)間對(duì)紅茶咖啡因脫除率及感官評(píng)分的影響

由圖3 可知，隨著浸提時(shí)間的增長，紅茶咖啡因脫除率及感官品質(zhì)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在30 s 達(dá)到最大值。可能因?yàn)樵谝欢ǖ臅r(shí)間內(nèi)，咖啡因會(huì)在熱水中迅速浸出，咖啡因脫除率不斷升高，一旦時(shí)間過長，茶葉由于升溫收縮，導(dǎo)致茶葉中的咖啡因脫除率下降。同時(shí)，隨著浸提時(shí)間的延長，茶湯顏色變深，影響其感官品質(zhì)，因此浸提時(shí)間不是越長越好，浸提時(shí)間30 s 較為適宜。

2.1.3 萎凋鮮葉與處理葉的質(zhì)量比對(duì)紅茶咖啡因脫除率及感官評(píng)分的影響

萎凋鮮葉與處理葉的質(zhì)量比對(duì)紅茶咖啡因脫除率及感官評(píng)分的影響見圖4。

圖4 萎凋鮮葉與處理葉的質(zhì)量比對(duì)紅茶咖啡因脫除率及感官評(píng)分的影響

由圖4 可知，萎凋鮮葉和處理葉的質(zhì)量比對(duì)紅茶咖啡因脫除率和感官評(píng)分存在顯著性影響（p<0.05）?？Х纫蛎摮孰S著萎凋鮮葉和處理葉質(zhì)量比的增大出現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，因?yàn)轷r葉中咖啡因很容易從熱水浸出，咖啡因的脫除率與處理葉的量密切相關(guān)。但是隨著處理葉質(zhì)量的增加，感官評(píng)分呈下降趨勢(shì)，因此，萎凋鮮葉和處理葉的質(zhì)量比確定為1∶2 較為合適。

2.1.4 多酚氧化酶添加量對(duì)感官評(píng)分和咖啡因脫除率的影響

多酚氧化酶添加量對(duì)紅茶咖啡因脫除率及感官評(píng)分的影響見圖5。

圖5 多酚氧化酶添加量對(duì)紅茶咖啡因脫除率及感官評(píng)分的影響

紅茶中的茶黃素具有抗氧化、抗衰老、降血糖、抗癌等多種生物活性功能。由圖5 可知，多酚氧化酶添加量高于2%時(shí)對(duì)紅茶咖啡因脫除率的影響不顯著。研究表明，多酚氧化酶會(huì)降解茶葉中的咖啡因，使得咖啡因的脫除率上升，但是隨著多酚氧化酶添加量的增加，咖啡因脫除率變化不顯著。綜上所述，添加2%的多酚氧化酶較為適宜。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果分析

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，為了優(yōu)化咖啡因的最大脫出率，選取浸提溫度（A）、浸提時(shí)間（B）、萎凋鮮葉∶處理葉（C） 為自變量，以咖啡因脫除率為指標(biāo)進(jìn)行三因素三水平Box-behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

Box-behnken 試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 Box-behnken 試驗(yàn)結(jié)果

用Design Expert 軟件對(duì)表3 中數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到三因素與咖啡因脫除率之間的二次多項(xiàng)回歸模型方程為：

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析

模型回歸方程及方差分析見表4。

表4 模型回歸方程及方差分析

由表4 可知，模型p<0.000 1，呈現(xiàn)出極顯著差異，說明回歸模型對(duì)咖啡因脫除率具有很好的預(yù)測(cè)性。模型決定系數(shù)R2=0.995 3>0.95，模型修正決定系數(shù)R2Adj=0.989 2，說明回歸模型可信度高，并且與實(shí)際試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)擬合情況較好，呈現(xiàn)高度相關(guān)性；失擬項(xiàng)p=0.387 3>0.05，不顯著，說明模型研究以外的因素對(duì)咖啡因脫除率的影響較小。單因素A、C、AB、AC、A2、B2、C2對(duì)咖啡因脫除率的影響極顯著（p<0.01），B、BC 影響不顯著（p>0.05）。由顯著性檢驗(yàn)F、p 值的大小得出各因素對(duì)咖啡因脫除率影響的順序?yàn)槲蝓r葉與處理葉質(zhì)量比（C） >浸提溫度（A） >浸提時(shí)間（B）。綜上所述，可以用該模型回歸方程分析和預(yù)測(cè)咖啡因脫除率工藝的結(jié)果，具有一定的實(shí)用性。

2.2.2 響應(yīng)面面圖分析

各因素的交互作用顯著情況，可根據(jù)曲面圖進(jìn)行分析，曲面的傾斜程度與顯著性呈正相關(guān)。響應(yīng)面圖顯示了浸提溫度、浸提時(shí)間、萎凋鮮葉與處理葉質(zhì)量比三因素之間的交相互作用對(duì)咖啡因脫除率的影響。采用Design Expert 11 軟件對(duì)影響紅茶咖啡因脫除率的3 個(gè)因素進(jìn)行交互分析。

各因素交互作用對(duì)紅茶咖啡因脫除率的影響響應(yīng)面圖見圖6。

圖6 各因素交互作用對(duì)紅茶咖啡因脫除率的影響響應(yīng)面圖

3 個(gè)響應(yīng)因素與紅茶咖啡因含量之間形成的響應(yīng)曲面坡度均較陡，表明該3 個(gè)因素對(duì)咖啡因脫除率的影響較大，同時(shí)隨著浸提時(shí)間、浸提溫度和萎凋鮮葉與處理葉質(zhì)量比的增加，紅茶的咖啡因脫除率先下降后上升。等高線呈橢圓形，表明所研究因素之間的交互作用顯著。AC 兩因素的傾斜程度最大，BC 兩因素的傾斜程度次之，AB 兩因素傾斜程度最小，表明浸提溫度和萎凋鮮葉與處理葉的質(zhì)量比這2個(gè)因素之間對(duì)紅茶咖啡因脫除率的交互影響最顯著。

2.2.3 最佳工藝條件確定及驗(yàn)證試驗(yàn)

依據(jù)Design Expert 11 軟件，以咖啡因脫除率為指標(biāo)，將模型進(jìn)行最優(yōu)分析，確定低咖啡因紅茶最佳生產(chǎn)工藝參數(shù)為熱水浸提溫度71.57 ℃，浸提時(shí)間29.25 s，萎凋鮮葉∶處理葉質(zhì)量比1∶2.133 7（g∶g），此時(shí)的咖啡因脫除率為52.87%?？紤]到實(shí)際情況，將最佳工藝參數(shù)修正為72 ℃，浸提時(shí)間為30 s，萎凋鮮葉∶處理葉質(zhì)量比為1∶2（g∶g），在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，所得紅茶的咖啡因脫除率為53%，與模型預(yù)測(cè)值接近，證明工藝參數(shù)具有準(zhǔn)確性，試驗(yàn)的優(yōu)化條件可行。

2.2.4 紅茶品質(zhì)分析

不同處理方式對(duì)紅茶品質(zhì)的影響見圖7。

圖7 不同處理方式對(duì)紅茶品質(zhì)的影響

由圖7 所知，對(duì)照組、熱水浸提處理、熱水浸提+多酚氧化酶處理對(duì)紅茶感官品質(zhì)、總糖、咖啡因含量及氨基酸含量產(chǎn)生了不同程度的影響。熱水浸提處理組與對(duì)照組相比，紅茶的感官品質(zhì)有所提升，總糖含量、氨基酸含量及咖啡因含量均降低。采用熱水浸提+多酚氧化酶處理可提高紅茶總糖及氨基酸含量，改善紅茶感官品質(zhì)，降低紅茶咖啡因含量。熱水浸提處理和熱水浸提+多酚氧化酶處理對(duì)紅茶咖啡因含量影響不顯著，兩者咖啡因含量相比于對(duì)照組分別下降了51%，51.6%。因此，熱水浸提+ 多酚氧化酶處理不僅可以改善紅茶感官品質(zhì)，提高總糖、氨基酸含量，還顯著降低了咖啡因含量，在此條件下紅茶咖啡因含量僅為1.58%，符合低咖啡因紅茶的標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)論

以茶鮮葉作為原料，以紅茶中咖啡因含量為響應(yīng)值，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)曲面法確定低咖啡因紅茶制作的最佳工藝參數(shù)為浸提溫度72 ℃，浸提時(shí)間30 s，萎凋鮮葉與處理葉質(zhì)量比為1∶2（g∶g），多酚氧化酶添加量為2%，在此最優(yōu)條件下制備的紅茶咖啡因脫除率為53%，咖啡因含量為1.58%，氨基酸含量為0.36%，總糖含量為2.82%。所制作的低咖啡因紅茶外形較為較細(xì)緊，尚烏潤，尚勻整，凈度尚好，具有純正的香氣和香醇的滋味，葉底尚嫩，多筋，尚紅亮，且茶湯色澤尚紅亮。