李二冬

（1. 山西省檢驗(yàn)檢測(cè)中心（山西省標(biāo)準(zhǔn)計(jì)量技術(shù)研究院），山西太原 030032；2. 食品藥品安全防控山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西太原 030032）

0 引言

苦蕎醋利用苦蕎為原料，采用科學(xué)的方法，運(yùn)用微生物學(xué)發(fā)酵的基本原理而制成的一種功能食品[1]。苦蕎醋中含有多種營(yíng)養(yǎng)成分，如黃酮類(lèi)化合物、多種微量元素、葡萄糖、氨基酸成分[2-5]等。其中，黃酮類(lèi)化合物泛指2 個(gè)苯環(huán)通過(guò)中央三碳鏈連接而成的一類(lèi)化合物，即有C6-C3-C6 基本構(gòu)型[6]。黃酮類(lèi)化合物是植物在生長(zhǎng)過(guò)程中形成的一大類(lèi)次生代謝產(chǎn)物[7]，主要以碳糖基類(lèi)或者苷類(lèi)的形式廣泛存在于植物的根、葉、果實(shí)、花和蓮中。人體內(nèi)不能直接合成黃酮類(lèi)化合物，而黃酮類(lèi)化合物對(duì)人體有著非常重要的生化作用[8]，所以必須通過(guò)食物獲取[9]。對(duì)于研究食物中的黃酮類(lèi)化合物顯得尤為重要。羅磊等人[10]通過(guò)H2O2誘導(dǎo)HUVEC 細(xì)胞損傷，建立細(xì)胞氧化損傷模型，并通過(guò)對(duì)照試驗(yàn)得出，綠豆皮黃酮能提高機(jī)體抗氧化酶活性，清除自由基，減輕H2O2對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。張立虎等人[11]研究表明黃酮有抗腫瘤、預(yù)防腫瘤作用，是一種很有潛力的癌癥化學(xué)預(yù)防劑，能顯著降低多種惡性腫瘤的發(fā)病率。Maras J E 等人[12]和Fu Yu 等人[13]研究發(fā)現(xiàn)黃酮類(lèi)化合物有強(qiáng)心護(hù)肝，防治心血管疾病的作用。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，苦蕎醋中也含有黃酮類(lèi)化合物。

然而，由于制作工藝和醋本身的特征，苦蕎醋容易發(fā)生沉淀，而沉淀通常不被利用，作為垃圾而丟棄。為了研究苦蕎醋沉淀中黃酮類(lèi)化合物的含量，對(duì)比了兩款市售苦蕎醋沉淀中黃酮的含量，為苦蕎醋的改性工藝研究提供理論基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 試劑

兩款苦蕎醋（雁門(mén)清高苦蕎醋、寧化府黑苦蕎醋），購(gòu)自當(dāng)?shù)爻?；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC≥98%），江西佰草源生物科技有限公司提供；無(wú)水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、稀鹽酸（分析純），天津市大茂化學(xué)試劑廠提供。試驗(yàn)中所用的水為二次蒸餾水。

1.2 儀器設(shè)備

S224S 型電子分析天平，鶴壁市鑫泰高科儀器制造有限公司產(chǎn)品；U-3010 型紫外-可見(jiàn)（UV-Vis）分光光度計(jì)，日本日立公司產(chǎn)品；DZG-6050（D） 型真空干燥箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；電熱恒溫水浴鍋，浙江臨海市東方儀器廠產(chǎn)品；TDL-5A型離心機(jī)，上海菲恰爾分析儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 苦蕎醋沉淀中黃酮的提取

分別將2 款市售苦蕎醋的沉淀取出，在60 ℃真空干燥箱中烘干5 h，并將烘干后的物質(zhì)碾成粉末。分別稱(chēng)取2 種粉末1.00 g 于具塞錐形瓶中，加70%乙醇50 mL，恒溫70 ℃水浴2.5 h，冷卻至室溫，以轉(zhuǎn)速8 000 r/min 離心10 min，取上清液用70%乙醇定容至50 mL，為提取液。

1.4 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)品[14-15]，測(cè)定兩款市售苦蕎醋沉淀中黃酮的含量。將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品在真空干燥箱中干燥至恒重，并精密稱(chēng)取25.0 mg，于50 mL 容量瓶中，加70%乙醇定容，即得到0.5 mg/mL 的蘆丁儲(chǔ)備液。分別取蘆丁儲(chǔ)備液0，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0，2.5 mL 于25 mL 容量瓶中，加70%乙醇6 mL，并依次加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的NaNO2溶液1 mL，搖勻靜置6 min；質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的Al(NO3)3溶液1 mL，搖勻靜置6 min；質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%的NaOH 溶液10 mL；繼續(xù)加水至刻度線，搖勻靜置15 min 待用。將未加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的容量瓶溶液作空白，于波長(zhǎng)353 nm 處測(cè)定吸光度，并繪制吸光度與濃度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 兩款市售苦蕎醋沉淀中黃酮含量的測(cè)定

分別取兩款市售苦蕎醋沉淀提取液2.0 mL 于25 mL 容量瓶中，按照2.4 的方法配制溶液、測(cè)定吸光度，并按照蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線和公式（1） 得到兩款苦蕎醋沉淀中黃酮質(zhì)量濃度。

式中：C——根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得的黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；

V1——苦蕎醋沉淀提取液的總體積，50 mL；

V3——取提取液，2 mL；

V2——2 mL 提取液稀釋后的體積，25 mL；

m——苦蕎醋沉淀的質(zhì)量，1 g。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長(zhǎng)的確定

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液吸收光譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液吸收光譜圖

由圖1 可知，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液為300~600 nm 時(shí)的紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖，于波長(zhǎng)為353 nm 處時(shí)吸光度最大，所以試驗(yàn)過(guò)程中選擇該波長(zhǎng)作為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液和吸光度的線性關(guān)系見(jiàn)圖2。

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液和吸光度的線性關(guān)系

在0~0.05 mg/mL 范圍內(nèi)蘆丁的吸光度隨著質(zhì)量濃度的增加而增加，其線性回歸方程為Y=0.0391 2+29.176 9C（mg/mL），相關(guān)系數(shù)R2=0.998 6，吸光度與濃度呈良好的線性相關(guān)，可用于樣品的測(cè)定。

2.3 試驗(yàn)條件的優(yōu)化

從苦蕎醋沉淀中提取黃酮時(shí)，溶劑的濃度、提取溫度、提取時(shí)間對(duì)黃酮提取量（即含量） 有很大的影響，所以需要對(duì)試驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化。

2.3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的考查

不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇對(duì)黃酮質(zhì)量濃度的影響見(jiàn)圖3。

圖3 不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇對(duì)黃酮質(zhì)量濃度的影響

由圖3 可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)從50%到80%變化，70%時(shí)黃酮質(zhì)量濃度達(dá)到最大值，隨著乙醇濃度的增加，黃酮質(zhì)量濃度變化不大。因此，為節(jié)約成本，試驗(yàn)中選擇用70%的乙醇作為溶劑。

2.3.2 提取溫度的考查

提取溫度對(duì)黃酮質(zhì)量濃度的影響見(jiàn)圖4。

圖4 提取溫度對(duì)黃酮質(zhì)量濃度的影響

由圖4 可知，隨著提取溫度的升高，黃酮質(zhì)量濃度升高，當(dāng)提取溫度到達(dá)70 ℃時(shí)，黃酮質(zhì)量濃度達(dá)到最大。所以，選擇提取溫度為70 ℃。

2.3.3 提取時(shí)間的考查

提取時(shí)間對(duì)黃酮質(zhì)量濃度的影響見(jiàn)圖5。

圖5 提取時(shí)間對(duì)黃酮質(zhì)量濃度的影響

由圖5 可知，隨著提取時(shí)間的增加，黃酮質(zhì)量濃度也在隨著增加，在150 h 之后不再增加。因此，選擇150 h 為最佳提取時(shí)間。

2.4 兩款市售苦蕎醋沉淀中黃酮質(zhì)量濃度的測(cè)定

在優(yōu)化試驗(yàn)條件的基礎(chǔ)上，分別提取兩款市售苦蕎醋沉淀中的黃酮，平行測(cè)定吸光度各3 次，取平均值，并按照蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線和公式（1） 得到黃酮質(zhì)量濃度分別為0.43 mg/mL 和0.31 mg/mL。

3 結(jié)論

用醇熱法，在優(yōu)化試驗(yàn)條件的基礎(chǔ)上對(duì)兩款市售苦蕎醋沉淀中的黃酮進(jìn)行了提取，并用紫外-可見(jiàn)分光光度法進(jìn)行了定量測(cè)定。結(jié)果顯示，沉淀中均有較高水平的黃酮類(lèi)物質(zhì)。為苦蕎醋中活性物質(zhì)黃酮的的保護(hù)及生產(chǎn)工藝中黃酮類(lèi)化合物的改性研究提供了理論基礎(chǔ)。