楊 倩, 朱錦磊, 衛(wèi) 甜, 劉懷阿, 呂 敏

(江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 揚(yáng)州 225007)

稗Echinochloa crus-galli是我國(guó)水稻產(chǎn)區(qū)分布最廣泛、危害最嚴(yán)重的惡性雜草之一，嚴(yán)重威脅我國(guó)水稻的品質(zhì)和產(chǎn)量。研究表明，田間稗種群密度達(dá)到4 株/m2時(shí)，優(yōu)質(zhì)水稻減產(chǎn)率高達(dá)55.2%，稻米加工與食味品質(zhì)也嚴(yán)重下降[1-2]。江蘇省是我國(guó)糧食主產(chǎn)區(qū)之一，水稻是江蘇省最重要的糧食作物。近年來(lái)，受水稻機(jī)械化、輕簡(jiǎn)化栽培技術(shù)應(yīng)用的影響，稻田雜草群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜多變，惡性雜草發(fā)生密度不斷增加，稻田主要雜草的抗性持續(xù)上升，給水稻生產(chǎn)安全帶來(lái)嚴(yán)重威脅[3-4]。

雜草對(duì)ACCase 抑制劑類除草劑產(chǎn)生抗性的機(jī)理主要包括兩個(gè)方面：靶標(biāo)抗性和非靶標(biāo)抗性[7]。靶標(biāo)抗性是指除草劑靶標(biāo)酶基因ACCase突變，導(dǎo)致酶結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使除草劑與之親和力下降，從而雜草對(duì)除草劑產(chǎn)生抗性；或者靶標(biāo)基因過(guò)量表達(dá)合成更多的酶蛋白，從數(shù)量上彌補(bǔ)被除草劑鈍化的酶，從而補(bǔ)償除草劑抑制而產(chǎn)生抗性。目前，在ACCase 基因的CT 結(jié)構(gòu)域上，已報(bào)道了7 個(gè)保守氨基酸位點(diǎn) (Ile-1781、Trp-1999、Trp-2027、Ile-2041、Asp-2078、Cys-2088 和Gly-2096) 的突變可以導(dǎo)致雜草對(duì)ACCase 抑制劑類除草劑產(chǎn)生抗性[7,12]。左平春[13]發(fā)現(xiàn)，稗對(duì)唑酰草胺產(chǎn)生高水平抗性的主要原因是抗性稗靶標(biāo)基因ACCase上發(fā)生Ile-1781-Leu 和Trp-2027-Cys 突變。Fang 等[14]報(bào)道了安徽省稻田抗性稗種群ACCase基因上Asp-2078-Glu 的突變，對(duì)ACCase 抑制劑唑酰草胺、氰氟草酯和精唑禾草靈分別產(chǎn)生了1.7、5.7 和7.5 倍的低到中等水平抗性。非靶標(biāo)抗性是指雜草通過(guò)減少除草劑到達(dá)靶標(biāo)的量而引起的抗性，主要包括對(duì)除草劑的代謝能力增強(qiáng)、吸收和運(yùn)輸受阻以及對(duì)除草劑的隔離作用[15]。目前報(bào)道最多的是細(xì)胞色素P450 (cytochrome P450 monooxygenase，P450) 和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transferase，GST) 等代謝酶介導(dǎo)的代謝抗性[7,15]。細(xì)胞色素P450 基因CYP81A 家族參與雜草對(duì)ACCase 類除草劑的代謝抗性機(jī)制已經(jīng)在水田稗Echinochloa phyllopogon[16-18]、稗[19]和硬直黑麥草Lolium rigidum[20]等禾本科雜草中被驗(yàn)證。此外，AmGSTF1 可以介導(dǎo)大穗看麥娘Alopecurus myosuroides對(duì)光合抑制劑和細(xì)胞分裂抑制劑等不同作用機(jī)理除草劑的多抗性[21]。馬拉硫磷 (malathion)和4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并氧雜二唑 (4-chloro-7-nitro-1,2,3-benzoxadiazole，NBD-Cl) 分別是P450 和GST 活性抑制劑，可以用來(lái)抑制植物體內(nèi)相應(yīng)代謝酶的活性，提高雜草對(duì)除草劑的敏感性，在雜草抗性研究中被廣泛應(yīng)用于證實(shí)P450或GST 參與的代謝抗性[22-24]。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試稗：稗敏感種群JS8 于2018 年采自江蘇省揚(yáng)州市邗江區(qū) (119.47° E；32.49° N)，疑似抗性種群JS12 于2020 年采自揚(yáng)州市寶應(yīng)縣稻田 (119.38° E；33.34° N)，種子采集后置于陰涼處自然風(fēng)干并于4 ℃冰箱中儲(chǔ)存。

試劑和儀器：馬拉硫磷 (malathion) 和98%NBD-Cl，上海阿拉丁試劑有限公司；高效植物基因組DNA 提取試劑盒、2 × Taq PCR MarkerMix、普通瓊脂糖DNA 回收試劑盒、pLB 零背景快速克隆試劑盒、大腸桿菌TOP 感受態(tài)細(xì)胞、FastQuant cDNA 第一鏈合成試劑盒 (with gDNAase) 和SuperReal 熒光定量試劑盒，北京天根生化科技有限公司；MiniBEST Plant RNA Extraction 試劑盒，寶日醫(yī)生物技術(shù) (北京) 有限公司；CFG 型智能光照培養(yǎng)箱，常州海博儀器設(shè)備有限公司；3WPSH-5000 型生測(cè)噴霧塔，南京農(nóng)業(yè)機(jī)械化研究所；TC-96 梯度PCR 儀，杭州博日科技股份有限公司；EPS-300 電泳儀，上海天能科技有限公司；ChampGel 6000 全自動(dòng)凝膠成像儀，北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司；ABI7500 Real Time PCR 擴(kuò)增儀，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.2 試驗(yàn)方法

采用SigmaPlot 12.0 軟件的雙邏輯非線性方程y=C+ {(D-C)/[1 + (x/GR50)b]}計(jì)算抑制雜草50%生長(zhǎng)所需的除草劑劑量 (herbicide rate causing growth reduction by 50%，GR50)。其中，x為除草劑劑量 (g/hm2)，y為除草劑處理組鮮重與對(duì)照組鮮重的百分比，C和D分別代表劑量反應(yīng)下限和上限，b表示在GR50處的斜率?？剐灾笖?shù) (resistance index，RI) = 抗性種群GR50/敏感種群GR50。

1.2.2 稗抗性和敏感種群ACCase基因的克隆和比對(duì) 基于1.2.1 節(jié)抗性水平測(cè)定結(jié)果，選取敏感種群和推薦劑量下存活的抗性種群各6 株，剪取葉片組織并用植物基因組DNA 試劑盒提取稗的基因組DNA。由于稗是六倍體植物，其ACCase基因有6 個(gè)拷貝。參考Yang 等[10]的引物序列，使用3 對(duì)引物 (EcACCase-F1/R1、EcACCase-F3/R3 和EcACCase-F5/R5) 分別擴(kuò)增稗ACCase基因的6 個(gè)拷貝，每對(duì)引物的擴(kuò)增區(qū)域均覆蓋了ACCase基因上7 個(gè)已報(bào)道的突變位點(diǎn)，引物由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μL，包括：25 μL 2 × Taq PCR MarkerMix，1 μL 正向引物 (10 μmol/L)，1 μL 反向引物 (10 μmol/L)，21 μL ddH2O 和2 μL cDNA模板。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，重復(fù)35 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 延伸 5 min。得到的PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測(cè)，使用普通瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒回收PCR 產(chǎn)物，將其構(gòu)建到pLB 克隆載體上，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞中，將獲得的新鮮菌液交由生工生物(上海) 股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序并拼接。測(cè)序引物為pLB-F (forward: 5′-CGACTCACTATAG GGAGAGCGGC-3′) 和pLB-R (5′-AAGAACA TCGATTTTCCATGGCAG-3′)。為了盡可能多的獲得稗ACCase基因的不同拷貝，每個(gè)DNA 樣本至少挑選12 個(gè)單克隆菌落。測(cè)序得到的核苷酸序列文本使用DNAMAN 6.0 軟件進(jìn)行序列比對(duì)，并用Chromas 2.33 軟件查看ACCase基因的測(cè)序峰圖。

1.2.3 稗抗性和敏感種群ACCase基因表達(dá)量測(cè)定 將稗植株按照1.2.1 節(jié)的條件培養(yǎng)至2～3 葉期，取新鮮葉片0.1 g，按照植物RNA 提取試劑盒說(shuō)明書方法提取抗性和敏感稗植株總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得第一鏈cDNA。參照Fang 等[14]的熒光定量PCR 特異性引物F：CAAGGGAAATGGTTG GGTGG 和R：CTCATGGGAATCAAGCTGGC，以稗肌動(dòng)蛋白β-actin作為內(nèi)參基因 (F：GTG CTGTTCCAGCCATCGTTCAT；R：CTCCT TGCTCATACGGTCAGCAATA)，測(cè)定ACCase在抗性和敏感稗植株中的表達(dá)量。唑酰草胺處理劑量為120 g/hm2，分別在除草劑處理前和處理后24 h 剪取新鮮葉片樣品，用液氮冷凍并保存至-80 ℃冰箱備用，每個(gè)樣品為來(lái)自6 株稗植株葉片的總和。熒光定量反應(yīng)體系包括：10 μL 2 ×SuperReal PreMix Plus、0.4 μL 50 × ROX Reference Dye、1 μL 模板cDNA 以及10 μmol/L 的上下游引物各0.6 μL，加7.4 μL ddH2O 至終體積20 μL。熒光定量PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性15 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸32 s，循環(huán)40 次。試驗(yàn)結(jié)果采用2-△△Ct法分析ACCase基因在抗性和敏感植株中的相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)種群3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)樣本4 個(gè)技術(shù)重復(fù)。

1.2.4 P450 和GST 抑制劑增效試驗(yàn) 采用整株水平測(cè)定法[25]測(cè)定P450 抑制劑馬拉硫磷和GST 抑制劑NBD-Cl 處理后敏感和抗性稗種群對(duì)唑酰草胺的敏感性。馬拉硫磷和NBD-Cl 分別用去離子水和丙酮溶解，然后用0.2%吐溫-80 水溶液分別稀釋至1 000 和300 g/hm2[11]。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，單獨(dú)噴施上述劑量的抑制劑對(duì)稗草的生長(zhǎng)無(wú)顯著影響。將稗植株按照1.2.1 節(jié)的條件培養(yǎng)至3 葉期，分別用馬拉硫磷和NBD-Cl 提前1 h 和48 h 進(jìn)行預(yù)處理。然后按照1.2.1 節(jié)的梯度劑量和方法噴施唑酰草胺，以無(wú)抑制劑唑酰草胺處理組為對(duì)照組，于藥劑處理后21 d 剪取植株地上部分并稱量鮮重，計(jì)算各處理組抗性和敏感稗種群對(duì)唑酰草胺的抑制中量GR50。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)2 次，每個(gè)處理劑量重復(fù)3 次。

1.2.5 稗JS12 種群對(duì)ACCase 抑制劑的交互抗性測(cè)定 選取與芳氧苯氧丙酸類 (aryloxyphenoxypropionates，APPs) 的唑酰草胺相同作用機(jī)理的4 種除草劑，包括APPs 類的氰氟草酯、精唑禾草靈，環(huán)己烯酮類 (cyclohexanediones，CHDs) 的烯草酮，以及新苯基吡唑啉類 (phenylpyrazoline，DEN) 的唑啉草酯。按照1.2.1 節(jié)的方法將稗JS8 和JS12 種群培養(yǎng)至2～3 葉期進(jìn)行莖葉噴霧處理。按照每種除草劑的有效成分用量設(shè)置梯度劑量，對(duì)JS8 種群噴施氰氟草酯的劑量分別為0、1.30、3.89、11.67、35 和105 g/hm2；對(duì)JS12 種群的施藥劑量為0、3.89、11.67、35、105 和315 g/hm2；精唑禾草靈的劑量分別為0、0.26、0.77、2.3、6.9、20.7 g/hm2和0、0.77、2.3、6.9、20.7、62.1 g/hm2；烯草酮的劑量分別為0、0.30、0.89、2.67、8、24 g/hm2和0、0.89、2.6、8、24、72 g/hm2；唑啉草酯的劑量分別為0、0.56、1.67、5、15、45 g/hm2和0、1.67、5、15、45、135 g/hm2。以清水處理為對(duì)照，每處理3 個(gè)重復(fù)。于藥后21 d 剪取稗地上部分并稱量鮮重，采用SigmaPlot 12.0 軟件計(jì)算各處理的GR50，計(jì)算方法同1.2.1 節(jié)。分析JS12 種群對(duì)不同ACCase 抑制劑類除草劑的交互抗性。

1.2.6 稗抗性和敏感種群對(duì)水稻田其他除草劑的敏感性測(cè)定 選取與唑酰草胺不同作用機(jī)理的4 種除草劑，包括乙酰乳酸合成酶 (acetolactate synthase，ALS) 抑制劑類的五氟磺草胺、合成激素類除草劑二氯喹啉酸和氯氟吡啶酯，以及對(duì)-羥苯基丙酮酸雙氧化酶 (4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenas，HPPD) 抑制劑類的三唑磺草酮。按照1.2.1 節(jié)的方法培養(yǎng)幼苗至3 葉期時(shí)，分別按照每種除草劑田間最高和最低兩個(gè)有效成分推薦劑量為處理劑量噴施。五氟磺草胺的處理劑量為15 和30 g/hm2，二氯喹啉酸的劑量為337.5 和450 g/hm2，氯氟吡啶酯的劑量為18 和36 g/hm2，三唑磺草酮的劑量為103.5 和135 g/hm2。于藥劑處理后21 d 統(tǒng)計(jì)各處理稗死亡數(shù)并稱量地上部分鮮重，分別按公式 (1) 和 (2) 計(jì)算死亡率 (Rm) 和鮮重抑制率 (I)。

式中：Rp表示植株死亡數(shù)；n表示植株總數(shù)；mt表示處理組鮮重；mc表示對(duì)照組鮮重。

1.3 數(shù)據(jù)分析

分別使用Excel 2010 和SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及單因素方差分析，采用最小顯著差數(shù)(LSD) 法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 稗JS12 種群對(duì)噁唑酰草胺的抗性水平

圖1 稗抗性和敏感種群對(duì)唑酰草胺的劑量-反應(yīng)曲線Fig.1 Dose-response curve of susceptible and resistant Echinochloa crus-galli populations to metamifop

2.2 稗抗性和敏感種群的ACCase 基因序列分析

利用3 對(duì)引物 (EcACCase-F1/R1、EcACCase-F3/R3 和EcACCase-F5/R5) 從抗性種群JS12 和敏感種群JS8 中均成功擴(kuò)增到目的片段。測(cè)序結(jié)果顯示獲得了稗ACCase基因的6 個(gè)拷貝，BLAST比對(duì)結(jié)果表明與NCBI 上已公開(kāi)的稗ACCase基因核苷酸序列 (LC006070、LC006071、LC006072、LC006073、LC006074 和LC006075) 的同源性均大于99%。對(duì)比抗性種群JS12 和敏感種群JS8 的ACCase序列片段發(fā)現(xiàn)，兩者在目前已報(bào)道的7 個(gè)保守位點(diǎn)處的核苷酸序列并無(wú)差異 (圖2)，說(shuō)明靶標(biāo)基因ACCase突變不是導(dǎo)致稗種群JS12 對(duì)唑酰草胺產(chǎn)生抗性的原因。

圖2 稗抗性種群JS12 的ACCase1 基因在7 個(gè)已知抗性突變位點(diǎn)處的測(cè)序峰圖Fig.2 Sequence chromatograms of ACCase1 at seven target mutation sites in JS12 population of E. crus-galli

2.3 稗抗性和敏感種群的ACCase 基因表達(dá)量分析

未用藥處理時(shí)，稗敏感種群JS8 和抗性種群JS12 的ACCase基因表達(dá)量基本一致；唑酰草胺處理24 h 后，抗性和敏感稗草的ACCase基因表達(dá)量均有所下降，分別降低了10%和29%，但敏感種群的表達(dá)量仍顯著高于抗性種群 (圖3)。由此說(shuō)明，靶標(biāo)基因ACCase過(guò)量表達(dá)不是導(dǎo)致稗種群JS12 對(duì)唑酰草胺產(chǎn)生抗性的原因。除草劑處理后ACCase基因表達(dá)量下降可能與唑酰草胺處理劑量過(guò)高，抑制了基因表達(dá)有關(guān)。

圖3 噁唑酰草胺處理前后稗抗性和敏感種群的ACCase 基因相對(duì)表達(dá)量Fig.3 Relative expression of ACCase gene in susceptible and resistant E. crus-galli populations before and after metamifop treatment

2.4 馬拉硫磷和NBD-Cl 對(duì)稗抗噁唑酰草胺種群抗性水平的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，代謝酶抑制劑能夠顯著提高抗性稗種群JS12 對(duì)唑酰草胺的敏感性，對(duì)敏感種群JS8 無(wú)顯著性影響 (表1)。相比于唑酰草胺直接處理，噴施馬拉硫磷和NBD-Cl 后，JS12 種群的GR50從227.90 g/hm2分別下降為77.51 和137.93 g/hm2；抗性指數(shù)由原來(lái)的13.71 倍分別降低到4.30 和9.03 倍，降幅分別為69%和34% (表1)。圖4 也表明，在唑酰草胺推薦劑量120 g/hm2下，代謝酶抑制劑馬拉硫磷和NBD-Cl 可以顯著逆轉(zhuǎn)稗JS12 種群對(duì)唑酰草胺的抗性水平。

表1 稗抗性和敏感種群在代謝酶抑制劑處理下對(duì)噁唑酰草胺的抗性水平Table 1 Resistance levels to metamifop under metabolic inhibitors pretreatment of tested E. crus-galli populations JS12 and JS8

圖4 馬拉硫磷和NBD-Cl 對(duì)稗抗噁唑酰草胺JS12 種群抗性水平的影響Fig.4 Effects of malathion and NBD-Cl on resistance levels of metamifop in E. crus-galli JS12 population

2.5 稗抗噁唑酰草胺種群JS12 對(duì)ACCase 抑制劑類除草劑的交互抗性

圖5 稗抗噁唑酰草胺種群JS12 對(duì)ACCase 抑制劑類除草劑的交互抗性Fig.5 Cross-resistance of metamifop-resistant population JS12 to ACCase-inhibiting herbicides

2.6 稗抗性和敏感種群對(duì)水稻田其他除草劑的敏感性

稗敏感種群JS8 在噴施低推薦劑量和高推薦劑量的五氟磺草胺、二氯喹啉酸、氯氟吡啶酯和三唑磺草酮后死亡率均為100%，鮮重抑制率均大于90% (表2)。對(duì)于稗抗性種群JS12，五氟磺草胺在低推薦劑量下對(duì)其防效為0，鮮重抑制劑率低于50%；在高劑量下死亡率也僅有22.22%，鮮重抑制劑率為64.48%；二氯喹啉酸在低和高推薦劑量下均不能完全殺死JS12 種群，死亡率分別為83.34%和89.45%；氯氟吡啶酯和三唑磺草酮在低推薦劑量下，死亡率分別為76.39% 和76.71%，在高推薦劑量下死亡率均為100%。由此說(shuō)明，稗JS12 種群對(duì)ALS 抑制劑類除草劑五氟磺草胺和激素類除草劑二氯喹啉酸均產(chǎn)生了不同程度的多抗性，其中對(duì)五氟磺草胺的抗性程度高于二氯喹啉酸，田間按推薦劑量施用這兩種除草劑已經(jīng)不能控制其抗性種群的生長(zhǎng)；而對(duì)新型除草劑氯氟吡啶酯和三唑磺草酮的抗性仍在發(fā)展階段，可以通過(guò)適當(dāng)提高施藥量來(lái)防治該抗性種群。

表2 稗敏感種群JS8 和抗性種群JS12 對(duì)其他除草劑的敏感性Table 2 Sensitivities to other herbicides in susceptible population JS8 and resistant population JS12 of E. crus-galli

3 討論

靶標(biāo)基因突變是雜草對(duì)ACCase 抑制劑類除草劑報(bào)道最多的抗性機(jī)制[7]，但在本研究中，抗性稗種群的6 個(gè)ACCase基因拷貝均未發(fā)生氨基酸的改變，并且唑酰草胺處理后，敏感種群JS8 的ACCase基因表達(dá)量顯著高于抗性種群JS12，這與其對(duì)唑酰草胺的抗性表型相反，說(shuō)明ACCase基因突變和表達(dá)量變化并不是導(dǎo)致稗JS12 種群對(duì)唑酰草胺產(chǎn)生抗性的原因。因此，稗JS12 種群對(duì)唑酰草胺產(chǎn)生抗性的原因很可能是非靶標(biāo)抗性機(jī)制。不同于靶標(biāo)抗性機(jī)制可以通過(guò)單個(gè)基因的改變來(lái)降低雜草對(duì)除草劑的敏感性，非靶標(biāo)抗性機(jī)制通常是多個(gè)基因家族共同積累、協(xié)同作用的結(jié)果，因此其機(jī)理更加復(fù)雜也很難在分子水平上進(jìn)行鑒定[15,36]。左春平等[34]發(fā)現(xiàn)，在噴施細(xì)胞色素P450 抑制劑殺草強(qiáng)后，2 個(gè)抗性稻稗種群對(duì)唑酰草胺的GR50值分別由600 和297 g/hm2降至375 和134 g/hm2，證明稻稗對(duì)唑酰草胺的抗性與P450 活性增強(qiáng)有關(guān)。在本研究中，P450 抑制劑馬拉硫磷和GST 抑制劑NBD-Cl 均可提高抗性種群JS12 對(duì)唑酰草胺的敏感性，其中馬拉硫磷效果更顯著，說(shuō)明JS12 種群對(duì)唑酰草胺的抗性機(jī)制是P450 和GST 等代謝酶系介導(dǎo)的代謝抗性，且P450 在其中發(fā)揮主要作用。此外，抗性稗JS12 種群對(duì)芳氧苯氧丙酸類、環(huán)己烯酮類和新苯基吡唑啉類等ACCase 抑制劑類除草劑均產(chǎn)生了低水平的交互抗性，這與代謝抗性機(jī)制會(huì)導(dǎo)致雜草對(duì)除草劑產(chǎn)生廣譜抗性的結(jié)論是一致的[36]。

本研究結(jié)果顯示，稗JS12 種群不僅對(duì)ACCase抑制劑產(chǎn)生了抗性，對(duì)ALS 抑制劑類除草劑五氟磺草胺和激素類除草劑二氯喹啉酸也產(chǎn)生了多抗性，這可能與五氟磺草胺和二氯喹啉酸在江蘇稻田的常年使用有關(guān)。五氟磺草胺和二氯喹啉酸是中國(guó)水稻產(chǎn)區(qū)防除稻田雜草的主要除草劑，在江蘇省使用年限較久，關(guān)于稗屬雜草對(duì)其產(chǎn)生抗性的報(bào)道很多[37-38]。由于JS12 種群對(duì)五氟磺草胺的抗性程度遠(yuǎn)高于二氯喹啉酸，所以，該種群很可能是先對(duì)五氟磺草胺產(chǎn)生了抗性，輪換使用唑酰草胺和二氯喹啉酸后又逐漸對(duì)三者產(chǎn)生了多抗性。此外，水稻田新型除草劑氯氟吡啶酯和三唑磺草酮在高推薦劑量下對(duì)抗性稗種群有較好的抑制效果，但相比于敏感種群，這兩種除草劑在低劑量下仍不能完全殺死抗性稗種群，說(shuō)明JS12 種群對(duì)這兩種除草劑的抗性已經(jīng)處于早期發(fā)展階段，若不注意控制，遲早會(huì)發(fā)展成明顯的抗性。研究表明，經(jīng)多年除草劑選擇壓存活下來(lái)的雜草抗性具有遺傳性，其抗性基因在停止使用該除草劑后仍然可以保留下來(lái)并遺傳給下一代，導(dǎo)致多抗性種群的產(chǎn)生[39]。因此，在治理抗性雜草時(shí)，應(yīng)避免簡(jiǎn)單的輪換其他類型的除草劑或單純的加大用藥量，防止多抗性種群的產(chǎn)生和快速發(fā)展，以免最終面臨無(wú)藥可用的困境。大量研究表明，采用多樣化的除草策略對(duì)田間雜草管理尤其是抗性雜草治理更加有效和經(jīng)濟(jì)[40]。除采用化學(xué)藥劑防除稻田雜草外，農(nóng)藝學(xué)和生態(tài)學(xué)措施，如不同類型農(nóng)作物輪作、加強(qiáng)稻田精整細(xì)作以及用網(wǎng)打撈雜草種子等方式[40-41]，均可以有效提高農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)多樣性和降低田塊中雜草種子庫(kù)基數(shù)，達(dá)到綜合防治雜草的目的。因此，在雜草治理過(guò)程中，應(yīng)采取綜合的管理體系，通過(guò)化學(xué)和非化學(xué)措施結(jié)合的方法，以減少對(duì)某一種或某一類除草劑的依賴性，延緩雜草抗性特別是多抗性的發(fā)展，保障農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的多樣性和可持續(xù)性發(fā)展。