曾兆華，林 濤，林嶺虹，方慧玲，朱珍珍，楊 廣，游 泳*

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，福建福州350013；2.害蟲綠色防控福建省高等學(xué)校重點實驗室，福建福州350002)

丁草胺是一種酰胺類內(nèi)吸傳導(dǎo)型選擇性芽前除草劑，其除草機理是通過雜草幼芽和幼小的次生根吸收，抑制蛋白酶的活性，阻礙蛋白質(zhì)的合成，從而使雜草幼株腫大、畸形、色深綠，最終死亡(黃炳球等，1993)。主要用于稻田防除以種子萌發(fā)的禾本科雜草、一年生莎草及某些闊葉雜草，但對闊葉雜草防效較差。因此，為了擴大防治譜，丁草胺常與其他對闊葉雜草效果好的除草劑混用。丁草胺疏水性大，易被土壤膠體粒子吸附，淋溶性小，具有穩(wěn)定性強、殘留期長等特點(姚斌等，2003)。

丁草胺是水稻上使用最廣譜的三大除草劑(丁草胺、乙草胺、草甘膦)之一。1969年在美國孟山都公司開發(fā)投產(chǎn)，1982年在我國正式登記并大面積推廣應(yīng)用，由于長期單一使用，導(dǎo)致稗草對丁草胺產(chǎn)生了抗藥性，使藥效明顯下降(黃炳球等，1993)。1993年稻田稗草對丁草胺的抗藥性在我國首次報道(黃炳球等，1993)。截止2017年，全球已有252種雜草(146種雙子葉，106種單子葉)產(chǎn)生了抗藥性。其中，我國已報道了43種。全球范圍內(nèi)抗性雜草的數(shù)量還將持續(xù)不斷地增加，而具有新作用機理的除草劑開發(fā)越來越難，因此選擇不同抗性機制的藥效交替或混配使用是提高防效及延緩雜草產(chǎn)生抗藥性的有效措施，但復(fù)配后的農(nóng)藥通過漂移徑流、滲透等途徑進(jìn)入水體，對水環(huán)境中生物造成危害差異較大(耿翠敏，2015)。

目前，丁草胺在水稻上的復(fù)配制劑主要有丁草胺·乙氧氟草醚，丁草胺·丙炔噁草酮，丁草胺·吡嘧磺隆，丁草胺·敵俾，丁草胺·芐嘧磺隆等(李海怡等，2011)，對其在雜草上的毒力研究居多，對水生生物大多數(shù)都關(guān)注于單一農(nóng)藥的影響(Wanget al，2017)，而多種農(nóng)藥的聯(lián)合毒性作用研究甚少。藻類、溞類和魚類是水生生物生態(tài)系統(tǒng)中主要組成部分，是目前水生生態(tài)毒理學(xué)研究的標(biāo)準(zhǔn)測試生物，被廣泛應(yīng)用于水生生物毒性測試和評價(王翔等，2006)。因此，為進(jìn)一步掌握丁草胺及其復(fù)配劑對水生生物的毒性特點。本研究以斜生柵藻、大型溞、斑馬魚為試驗對象，按照《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則》(中國國家環(huán)境保護局，1990)和OECD“化學(xué)品測試方法”(OECD，1984a，1984b，1992)的要求，測定丁草胺及其復(fù)配劑對以上3種生物的急性毒性，為今后評估稻田除草劑對非靶標(biāo)水生生物的生態(tài)風(fēng)險提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試生物及來源

斜生柵藻(Desmodesmus subspicatus)由中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫提供。斜生柵藻在無菌條件下轉(zhuǎn)移至水生4號培養(yǎng)液中(中華人民共和國農(nóng)業(yè)部，2014c)，培養(yǎng)至對數(shù)生長期進(jìn)一步擴大培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度21～24℃；光照強度4 440～8 880 lx；連續(xù)均勻光照。試驗起始藻鏡檢濃度為5.0×103～5.0×104個·mL-1，試驗時，斜生柵藻處于同步生長階段。

大型溞(Daphnia magna)由中國科學(xué)院水生生物所提供，實驗室自行保種繁育。試驗用溞為同一母體孤雌繁殖3代以上，出生24 h內(nèi)的非頭胎溞。溫度(20±1)℃；光照周期L∶D=16 h∶8 h。試驗期間使用標(biāo)準(zhǔn)稀釋水ISO且水質(zhì)保持穩(wěn)定(中華人民共和國農(nóng)業(yè)部，2014b)，硬度為158 mg·L-1(以CaCO3計)。

斑馬魚(Brachydonio rerio)購自福州海洋之星水族館，試驗前在實驗室預(yù)養(yǎng)7 d以上，試驗前24 h停止喂食。試驗用魚體重0.2～0.4 g，體長2.0～3.0 cm，試驗用水為經(jīng)活性炭處理、曝氣去氯24 h以上的自來水(中華人民共和國農(nóng)業(yè)部，2014a)。水質(zhì)硬度為71 mg·L-1(以CaCO3計)，光周期 L ∶D=12 h ∶12 h。

1.2 藥劑

50%丁草胺乳油、70%丁草胺·異噁草松·吡嘧磺隆乳油、75%丁草胺·噁草酮·乙氧氟草醚乳油、78%丁草胺·噁草酮乳油均由山東玥鳴生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 斜生柵藻的急性毒性試驗

基于前期急性毒性試驗結(jié)果，分別將供試農(nóng)藥用BG11培養(yǎng)基稀釋液溶解成系列梯度濃度。其中 50%丁草胺乳油為 3.240×10-3、4.966×10-3、7.601×10-3、1.164×10-2、1.780×10-2mg a.i.·L-1的處理溶液，分別量取50 mL藥液到錐形瓶內(nèi)，再接種50 mL的藻液，振蕩混勻，混合得到含1.620×10-3、2.483×10-3、3.801×10-3、5.820×10-3、8.900×10-3mg a.i.·L-1的處理藻液；70%丁草胺·異噁草松·吡嘧磺隆乳油為 2.117×10-3、3.789×10-2、6.909×10-3、1.237×10-2、2.229×10-2mg a.i.·L-1的處理溶液，混合得到含1.059×10-3、1.895×10-3、3.455×10-3、6.185×10-3、1.115×10-2mg a.i.·L-1的處理藻液；75%丁草胺·噁草酮·乙氧氟草醚乳油為1.703×10-4、2.546×10-4、3.818×10-4、5.736×10-4、8.600×10-4mg a.i.·L-1的處理溶液，混合得到含 8.515×10-5、1.273×10-4、1.909×10-4、2.868×10-4、4.300×10-4mg a.i.·L-1的處理藻液；78%丁草胺·噁草酮乳油為 3.391×10-4、8.785×10-4、2.281×10-3、5.934×10-3、1.541×10-2mg a.i.·L-1的處理溶液，混合得到含 1.696×10-4、4.393×10-4、1.141×10-3、2.967×10-3、7.705×10-3mg a.i.·L-1的處理藻液。 試驗每組濃度均設(shè) 3 次重復(fù)，并設(shè)空白對照。在溫度21～24℃、光照強度4 440～8 880 lx的人工氣候箱內(nèi)開展。在生物顯微鏡下用血球技術(shù)板準(zhǔn)確計數(shù)0、24、48、72 h的藻細(xì)胞數(shù)，并觀察其中毒癥狀。計數(shù)時，同一樣品至少計數(shù)2次，如計數(shù)結(jié)果相差大于15%，應(yīng)予以重復(fù)計數(shù)，試驗數(shù)據(jù)采用生物量比較分析和計算抑制率。

式中，Iy表示處理組生物量增長的抑制率(%)；Ye表示空白對照組測定的藻類細(xì)胞數(shù)(個·mL-1)；Yt表示處理組測定的藻類細(xì)胞數(shù)(個·mL-1)。

1.4 大型溞的急性毒性試驗

基于前期急性毒性試驗結(jié)果，分別將供試農(nóng)藥用ISO標(biāo)準(zhǔn)稀釋水溶解成系列梯度濃度。其中 50%丁草胺乳油為 0.814、1.221、1.831、2.747、4.120 mg a.i.·L-1的溶液；70%丁草胺·異噁草松·吡嘧磺隆乳油為 1.039、1.454、2.036、2.850、3.990 mg a.i.·L-1的溶液；75%丁草胺·噁草酮·乙氧氟草醚乳油為 0.509、0.851、1.420、2.371、3.960 mg a.i.·L-1的溶液；78%丁草胺·噁草酮乳油為 0.582、1.019、1.783、3.120、5.460 mg a.i.·L-1的溶液。 分別量取 50 mL 藥液到100 mL燒杯內(nèi)，每個燒杯中加入5只幼溞，并設(shè)空白對照，重復(fù)4次。在24、48 h觀察并記錄大型溞的中毒癥狀和活動受抑制數(shù)。試驗在溫度(20±1)℃、光照周期L∶D=16 h∶8 h的人工氣候箱內(nèi)開展。

1.5 斑馬魚的急性毒性試驗

試驗采用“半靜態(tài)法”，基于前期急性毒性試驗結(jié)果，分別將供試農(nóng)藥用曝氣水稀釋溶解成系列梯度濃度。 其中50%丁草胺乳油為0.330、0.396、0.475、0.570、0.684 mg a.i.·L-1的溶液；70%丁草胺·異噁草松·吡嘧磺隆乳油為 0.168、0.286、0.485、0.825、1.403 mg a.i.·L-1的溶液；75%丁草胺·噁草酮·乙氧氟草醚乳油為 0.608、0.729、0.875、1.050、1.260 mg a.i.·L-1的溶液；78%丁草胺·噁草酮乳油為 0.608、0.729、0.875、1.050、1.260 mg a.i.·L-1的溶液。 每個魚缸中含5 L的不同濃度處理藥液。試驗每組濃度均用斑馬魚10只，重復(fù)3次，并設(shè)空白對照。試驗開始后6 h內(nèi)隨時觀察并記錄斑馬魚的中毒癥狀及死亡數(shù)，其后于24、48、72、96 h觀察并記錄斑馬魚的中毒癥狀及死亡數(shù)。試驗在水溫(23±1)℃，光周期L∶D=12 h∶12 h室內(nèi)開展。

1.6 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 19.0軟件中Probit(概率單位法)進(jìn)行統(tǒng)計計算LC50、EC50及95%置信限等參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種除草劑對斜生柵藻的急性毒性與安全性評價

50%丁草胺乳油、70%丁草胺·異噁草松·吡嘧磺隆乳油、75%丁草胺·噁草酮·乙氧氟草醚乳油、78%丁草胺·噁草酮乳油對斜生柵藻 72 h 的 EC50分別為 4.143×10-3、3.207×10-3、1.936×10-4、1.144×10-3mg a.i.·L-1(表1)，參照蔡道基(1999)建議的農(nóng)藥對藻類的毒性等級劃分標(biāo)準(zhǔn)，4種供試農(nóng)藥對斜生柵藻的毒性等級均為高毒(EC50≤0.3 mg a.i.·L-1)。

表1 丁草胺及其3種復(fù)配劑對斜生柵藻的急性毒性Table 1 Acute toxicity of the butachlor agent and its 3 joint compounds to Desmodesmus subspicatus

2.2 4種除草劑對大型溞的急性毒性與安全性評價

50%丁草胺乳油、70%丁草胺·異噁草松·吡嘧磺隆乳油、75%丁草胺·噁草酮·乙氧氟草醚乳油、78%丁草胺·噁草酮乳油對大型溞 48 h 的 EC50分別為 1.576、2.165、1.284、1.595 mg a.i.·L-1(表2)，參照《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則》(中國國家環(huán)境保護局，1990)中農(nóng)藥對溞類的毒性等級劃分標(biāo)準(zhǔn)，4種供試農(nóng)藥對大型溞的毒性等級均為中毒(1.0 mg a.i.·L-1＜EC50≤10.0 mg a.i.·L-1)。中毒后的大型溞表現(xiàn)出游動不積極、反應(yīng)遲鈍、沉底的現(xiàn)象。

2.3 4種除草劑對斑馬魚的急性毒性與安全性評價

由“半靜態(tài)法”試驗結(jié)果(表3)可知，50%丁草胺乳油、70%丁草胺·異噁草松·吡嘧磺隆乳油、75%丁草胺·噁草酮·乙氧氟草醚乳油、78%丁草胺·噁草酮乳油對斑馬魚96 h的LC50分別為0.440、0.407、0.871、0.445 mg a.i.·L-1，參照《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則》(中國國家環(huán)境保護局，1990)中農(nóng)藥對魚類的毒性等級劃分標(biāo)準(zhǔn)，4種供試農(nóng)藥對斑馬魚的毒性等級均為高毒(0.1 mg a.i.·L-1＜LC50≤1.0 mg a.i.·L-1)。中毒后的斑馬魚表現(xiàn)出側(cè)游、游動緩慢、身體發(fā)黑的現(xiàn)象。

表2 丁草胺及其3種復(fù)配劑對大型溞的急性毒性Table 2 Acute toxicity of the butachlor agent and its 3 joint compounds to Daphnia magna

表3 丁草胺及其3種復(fù)配劑對斑馬魚的急性毒性Table 3 Acute toxicity of the butachlor agent and its 3 joint compounds to Brachydanio rerio

3 討論與結(jié)論

試驗結(jié)果表明，4種供試農(nóng)藥對斜生柵藻的急性毒性均為高毒，毒性排序為：50%丁草胺乳油＜70%丁草胺·異噁草松·吡嘧磺隆乳油＜78%丁草胺·噁草酮乳油＜75%丁草胺·噁草酮·乙氧氟草醚乳油。丁草胺復(fù)配劑對斜生柵藻的毒性明顯高于單劑，而復(fù)配劑之間的毒性又存在差異，其原因可能與不同除草劑之間存在著協(xié)同增效或拮抗作用有關(guān)(韋小燕等，2004)。藻類的毒性因農(nóng)藥品種和藻類的不同而不同，主要是對藻類細(xì)胞生物膜、光合作用、呼吸作用、和藻類生化成分等4個方面的影響。而且農(nóng)藥對藻類的影響在很大程度上表現(xiàn)為“低激高抑”的濃度相關(guān)性(歐曉明，2009；黃健，2017)。

4種供試農(nóng)藥對大型溞的急性毒性均為中毒，其中70%丁草胺·異噁草松·吡嘧磺隆乳油的EC50＞50%丁草胺乳油，其原因可能是異噁草松和吡嘧磺隆原藥對大型溞的48 h的EC50分別為12.7和700 mg a.i.·L-1，皆為低毒(IUPAC)，兩者低毒性的除草劑與丁草胺復(fù)配后降低了丁草胺的毒性。因此為了降低多元復(fù)配劑對水生生物造成嚴(yán)重性危害，可以復(fù)配低毒性的除草劑來降低單一成分的毒性(游泳等，2018)。78%丁草胺·噁草酮乳油EC50＞50%丁草胺乳油EC50＞75%丁草胺·噁草酮·乙氧氟草醚乳油EC50，表明乙氧氟草醚增加了丁草胺·噁草酮復(fù)配劑的毒性。乙氧氟草醚是觸殺性除草劑，Ibrahimet al(2019)研究表明乙氧氟草醚能夠引起蝸牛抗氧化系統(tǒng)的改變，消化腺中的組織病理學(xué)變化，包括消化細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷。因此，復(fù)配后的乙氧氟草醚是否對大型溞造成一定的生理毒性有待進(jìn)一步探究。

4種供試農(nóng)藥對斑馬魚的急性毒性均為高毒，其中75%丁草胺·噁草酮·乙氧氟草醚乳油、78%丁草胺·噁草酮乳油毒性低于50%丁草胺乳油，可能是因為藥劑復(fù)配后丁草胺含量低，且藥劑生產(chǎn)過程中使用的助劑對斑馬魚的毒性較低；Guo et al(2010)通過丁草胺暴露于比目魚(牙鲆)鰓、肝、腎的組織病理學(xué)研究表明，鰓是丁草胺的靶器官。魚鰓可直接、大面積接觸水中的毒性物質(zhì)造成損傷，從而干擾正常的呼吸、分泌和排泄功能，引起魚體代謝紊亂、窒息、甚至死亡。而噁草酮和乙氧氟草醚皆為觸殺型除草劑在與內(nèi)吸型除草劑丁草胺復(fù)配后是否存在降解丁草胺作用于靶器官的毒性有待進(jìn)一步探究。

本試驗測定的4種供試農(nóng)藥對斜生柵藻、大型溞、斑馬魚的急性毒性等級分別為高毒、中毒、高毒，這4種供試農(nóng)藥對3種水生生物的急性毒性不同可能與生物種群、農(nóng)藥作用方式和機制不同有關(guān)。有研究表明丁草胺對陸生生物的毒性低，其中鵪鶉急性經(jīng)口LD50＞10 000 mg a.i.·L-1，蜂經(jīng)口LD50＞100 mg a.i.·L-1(殷立成，2007)，但對魚類及水生生物毒性大。以魚為最敏感，魚種又略高于魚苗，而對水溞的毒性卻偏低(李鳳珍等，1989)，這與本研究結(jié)果相一致。范立民等(2005)測定了丁草胺對白鰱的96 h的EC50為0.134 mg a.i.·L-1，屬高毒農(nóng)藥，同時又分析了黃鱔腹腔注射染毒前后微核率的變化，其結(jié)果表明，丁草胺對魚具有致突變性。有人研究發(fā)現(xiàn)22種除草劑能夠通過改變藻類的生長和蛋白質(zhì)合成模式從而改變環(huán)境。其中，丁草胺對林克式念株藻的毒性也認(rèn)為是抑制蛋白質(zhì)的合成(張雪嬌，2008)。丁草胺及其復(fù)配劑對大型溞的毒性顯著低于斜生柵藻和斑馬魚。可能是因為丁草胺主要通過干擾植物光合作用、植物激素或植物分子合成發(fā)揮毒性效應(yīng)，從而導(dǎo)致其對大型溞的生理系統(tǒng)難以發(fā)生反應(yīng)性毒性效應(yīng)。而除草劑對大型溞的急性毒性機理主要與化合物疏水性程度和離子化程度有關(guān)(閆俐辰等，2018)。

綜上所述，50%丁草胺乳油、70%丁草胺·異噁草松·吡嘧磺隆乳油、75%丁草胺·噁草酮·乙氧氟草醚乳油、78%丁草胺·噁草酮乳油4種供試農(nóng)藥對大型溞的安全風(fēng)險性較低，但對斜生柵藻和斑馬魚的安全風(fēng)險性很高，因此在施用農(nóng)藥時，應(yīng)注意其對藻類的危害；避免在雨天或魚類敏感水區(qū)及保護區(qū)附近施用，防止含有農(nóng)藥的稻田水流入水中；在稻田養(yǎng)魚的農(nóng)業(yè)模式中，要在農(nóng)藥完全降解或達(dá)到安全濃度以后再進(jìn)行養(yǎng)殖。