李強(qiáng) 程艷芹 苗青 劉旭

紅花為菊科植物紅花（Carthamus tinctorious L.）的干燥管狀花，又名次紅、紅藍(lán)花、紅花菜、紅花草等，味辛性溫，歸心、肝經(jīng)，具有活血通經(jīng)、散瘀止痛的功效。中藥紅花已有4 000 多年的歷史，分布較廣，在很多國家均有栽培，原產(chǎn)于埃及，在我國也多有栽培，主產(chǎn)于新疆、河南、湖南、四川、云南等地[1，2]。紅花是現(xiàn)代中藥制劑的常用藥材，在中醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，在臨床上治療冠心病、心絞痛效果較好，其有增強(qiáng)心肌收縮、輕度興奮心臟、降低冠脈阻力、增加冠脈流量的作用[3]。紅花中的羥基紅花黃色素A 具有提高動(dòng)物缺氧的耐受力，并能使冠脈擴(kuò)張，增加冠脈流量，對血管平滑肌細(xì)胞的增殖具有抑制作用。目前，紅花中已分離鑒定的化學(xué)成分有60 多種，主要分為黃酮類、木脂素類、多炔類等，成分十分復(fù)雜，其中羥基紅花黃色素A 是紅花的主要有效成分[4，5]。文獻(xiàn)資料中對紅花藥材的相關(guān)研究多以標(biāo)志性成分羥基紅花黃色素A 單一指標(biāo)為考察對象，不足以全面地反映紅花藥材的質(zhì)量。因此，建立有效的紅花藥材質(zhì)量評價(jià)方法，確保紅花藥材質(zhì)量穩(wěn)定，直接關(guān)系到紅花相關(guān)藥品和臨床處方的療效。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜（HPLC）方法，建立紅花藥材的指紋圖譜，同時(shí)對羥基紅花黃色素A、山奈酚、槲皮素3 種成分的含量進(jìn)行研究分析，為進(jìn)一步考察不同產(chǎn)地紅花藥材的質(zhì)量狀況提供圖譜信息，為其質(zhì)量評價(jià)提供新的參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑甲醇（色譜純，天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司，批號：Q/BSYZ01-2017）；磷酸（分析純，萊陽市康德化工有限公司，批號：201901）；滅菌注射用水（山東齊都藥業(yè)有限公司，批號：2A20112009）；羥基紅花黃色素A、槲皮素、山奈酚（中國食品藥品檢定研究院，批號依次為：BZP0382、BZP0083、BZP0129）；紅花藥材來源見表1。

表1 紅花藥材來源

1.2 儀器和設(shè)備液相色譜儀LC-2030 型（日本島津制作所）；超聲波儀SY2200-SB2200 型（上海必能信超聲有限公司）；電子天平Y(jié)P202N 型（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；電子天平DV215CD 型（美國奧豪斯公司）；循環(huán)水真空泵SHZ-DⅢ型（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；電熱恒溫水箱HH-W21-420 型（余姚市亞星儀器儀表有限公司）。

1.3 色譜條件色譜柱：Inertsil ODS-SP（4.6mm×150 mm，5μm)；通過對比流動(dòng)相[甲醇-0.4%磷酸溶液、乙腈-0.4%磷酸溶液、甲醇-水（每100ml 水中含1ml pH=6.0 的醋酸-醋酸銨緩沖溶液）]、檢測波長（全波長掃描）及柱溫（25℃、30℃、35℃）等色譜條件，經(jīng)過圖譜分析后篩選出流動(dòng)相：甲醇-0.4%磷酸溶液，檢測波長：254nm，進(jìn)樣量：10μl；柱溫：30℃為最優(yōu)檢測條件，所得色譜峰分離度良好，無拖尾現(xiàn)象。流動(dòng)相梯度洗脫程序[6]見表2。

表2 流動(dòng)相梯度洗脫程序

1.4 供試品溶液的制備分別考察2 種提取方法（超聲波提取和加熱回流提?。?、3 種提取溶劑（純甲醇、75%甲醇、60%甲醇）、超聲波提取時(shí)間（20min、40min、60min）對羥基紅花黃色素A、槲皮素、山奈酚3 種指標(biāo)成分含量測定的影響，結(jié)果表明以75%甲醇為提取溶劑超聲波提取40min，所得的有效成分含量較高且操作簡便。按照以上方法精密稱量紅花藥材（編號S1）粉末0.4g，置于具塞錐形瓶中，用移液管精密稱定75%的甲醇50ml 加入，超聲提?。üβ?00W，頻率50kHz）40min，放冷，再稱定質(zhì)量，用75%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，再用0.45μm 的有機(jī)微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.5 混合對照品溶液的制備精密稱取羥基紅花黃色素A、槲皮素和山奈酚對照品分別為17.8mg、1.9mg、1.8mg，置同一100ml 容量瓶中，加甲醇，超聲（功率：300W，頻率：50kHz）溶解，放冷，定容，制成每1ml 含羥基紅花黃色素A 0.178mg、槲皮素0.019mg、山奈酚0.018mg 的混合對照品溶液，備用。

1.6 單個(gè)對照品溶液的制備精密稱取羥基紅花黃色素A、槲皮素、山奈酚對照品藥物適量，分別于不同的10ml 容量瓶中加適量甲醇搖勻，超聲溶解，放冷，甲醇定容，得到羥基紅花黃色素A、槲皮素、山奈酚質(zhì)量濃度分別為1.484mg/ml、0.412mg/ml、0.432mg/ml 的單個(gè)對照品溶液，備用。

1.7 指紋圖譜的建立

1.7.1 精密度試驗(yàn) 取相同的紅花供試品溶液（編號S1），按照規(guī)定的色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6 次并記錄所得色譜圖，以羥基紅花黃色素A 峰為參照樣，計(jì)算各共有峰相對峰面積和相對保留時(shí)間，如果所得RSD 值均小于2%，則表明儀器精密度良好。

1.7.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取相同的紅花供試品溶液（編號S1），按照規(guī)定的色譜條件，在0、3、6、9、12、24h 分別進(jìn)樣分析并記錄所得色譜圖，以羥基紅花黃色素A 峰為參照樣，計(jì)算各共有峰相對峰面積和相對保留時(shí)間，如果所得RSD 值均小于2%，則表明紅花供試品溶液在24h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.7.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取相同批次的紅花樣品6 份（編號S1），分別配置供試品溶液后按照規(guī)定的色譜條件進(jìn)樣分析并記錄所得色譜圖，以羥基紅花黃色素A 峰為參照樣，計(jì)算各共有峰相對峰面積和相對保留時(shí)間，如果所得RSD 值均小于2%，則表明重復(fù)性良好。

1.7.4 指紋圖譜的測定及相似度分析[7]取6 批不同產(chǎn)地的紅花樣品按照1.4 方法制成供試品溶液，按照規(guī)定的色譜條件進(jìn)樣分析并記錄65min 色譜圖。取混合對照品溶液，按照規(guī)定的色譜條件進(jìn)樣分析并記錄65min 色譜圖。分別取3 種對照品溶液，按照規(guī)定的色譜條件進(jìn)樣分析并記錄65min 色譜圖。對6 批不同產(chǎn)地紅花藥材指紋圖譜利用“中國色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012 版）”進(jìn)行相似度分析。

1.8 含量測定

1.8.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取紅花供試品和混合對照品溶液，按照規(guī)定的色譜條件進(jìn)樣分析并記錄65min 色譜圖。

1.8.2 線性關(guān)系考察 取相同的紅花混合對照品溶液，分別精密吸取10、15、20、25、30、35μl 進(jìn)樣分析并記錄65min 色譜圖，測出羥基紅花黃色素A、槲皮素、山奈酚的峰面積，以對照品溶液進(jìn)樣量作自變量X，以生物堿相應(yīng)峰面積作因變量Y 做線性回歸分析。

1.8.3 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取同一批紅花樣品（編號S3）9 份，各0.5g，置于平底燒瓶中，按3 個(gè)濃度梯度分別加入羥基紅花黃色素A、槲皮素、山奈酚對照品，測定加樣回收率。

1.8.4 樣品測定 取紅花樣品制成的供試品溶液，按照規(guī)定的色譜條件進(jìn)樣分析并記錄65min 色譜圖，計(jì)算樣品中羥基紅花黃色素A、槲皮素、山奈酚含量。

2 結(jié)果

2.1 指紋圖譜的測定結(jié)果對比指紋圖譜，除溶劑峰外共確定10 個(gè)共有峰，經(jīng)過進(jìn)樣剖析單個(gè)對照品后獲得的色譜圖，確定其中3 個(gè)色譜峰，分別為羥基紅花黃色素A、槲皮素、山奈酚。見圖1、2。6批不同紅花藥材樣品中共有峰相對保留時(shí)間及峰面積見表3、4。

圖1 紅花藥材指紋圖譜

圖2 紅花混合對照品

表3 6 批紅花藥材樣品中共有峰相對保留時(shí)間

表4 6 批紅花藥材樣品中共有峰相對峰面積

2.2 指紋圖譜相似度分析6 批紅花藥材與對照圖譜（SR）相似度分別為0.976、0.922、0.953、0.981、0.943、0.992。提示6 種不同產(chǎn)地的紅花藥品指紋圖譜差異較小。見圖3。

圖3 6 批紅花藥材指紋圖譜

2.3 各試驗(yàn)結(jié)果及樣品測定系統(tǒng)適用性試驗(yàn)分析結(jié)果表明，3 種成分的分離度均大于1.5，提示適用性較好。線性關(guān)系考察結(jié)果顯示對照品溶液進(jìn)樣量與以生物堿相應(yīng)峰面積均具有良好的線性關(guān)系。精密度試驗(yàn)測出3 種成分的峰面積RSD 值均小于2%，表明儀器精密度良好。穩(wěn)定性試驗(yàn)測出3 種成分的峰面積所得RSD 值均小于2%，表明紅花供試品溶液在24h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。重復(fù)性試驗(yàn)測出3 種成分的峰面積所得RSD 值均小于2%，表明重復(fù)性良好。通過線性關(guān)系考察發(fā)現(xiàn)，羥基紅花黃色素A、槲皮素、山奈酚三者均具有良好的線性關(guān)系，見表5。加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果顯示，羥基紅花黃色素A、槲皮素、山奈酚的平均加樣回收率分別為100.6%、99.5%、101.2%，其RSD 分別為0.8%、1.9%、1.2%，見表6。樣品測定羥基紅花黃色素A、槲皮素、山奈酚的含量穩(wěn)定見表7。

表5 3 種有效成分線性關(guān)系

表6 3 種成分加樣回收率

表7 6 批紅花藥材3 種有效成分含量（mg/g,n=6）

3 討論

3.1 指紋圖譜方法學(xué)驗(yàn)證及相似度分析本實(shí)驗(yàn)建立了紅花藥材HPLC 指紋圖譜，并考察比較了6 個(gè)不同產(chǎn)地紅花藥材的指紋圖譜相似度。本研究色譜條件及樣品提取條件優(yōu)化后經(jīng)過方法學(xué)驗(yàn)證，該HPLC 方法精密度高、重復(fù)性好、穩(wěn)定準(zhǔn)確、特征突出、可行性好。

本實(shí)驗(yàn)所采用的紅花來自我國河南、四川、新疆等地，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，指紋圖譜共成功匹配10 個(gè)共有峰，共有峰基本特征均一致，為紅花藥材的質(zhì)量控制提供了相對全面的參考信息，對紅花藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定具有一定的借鑒意義[8]。指紋圖譜比較后發(fā)現(xiàn)，6 批不同產(chǎn)地的紅花藥材指紋圖譜相似度基本一致，經(jīng)單個(gè)對照品對比共確定3 種有效成分，其中羥基紅花黃色素A 為紅花的標(biāo)志性成分且含量較高，因此選為指紋圖譜的參照峰，研究表明羥基紅花黃色素A 具有抗缺血、抗癌、降血糖、改善認(rèn)知等多重功效[9]。槲皮素與山奈酚結(jié)構(gòu)相似，同屬黃酮類化合物，構(gòu)效關(guān)系研究表明這兩種化合物具有較好地心血管保護(hù)作用和抗癌活性[10]，這兩種有效成分與標(biāo)志性成分羥基紅花黃色素A 一起更能充分體現(xiàn)紅花藥材的質(zhì)量。

3.2 展望紅花藥材成分復(fù)雜，產(chǎn)地較多，不同產(chǎn)地之間地理位置相距較遠(yuǎn)，因此藥材含量不太穩(wěn)定，難以檢測。故本實(shí)驗(yàn)僅選用了紅花藥材中3 種相對穩(wěn)定、含量較高的指標(biāo)成分進(jìn)行質(zhì)量控制。如果條件允許，未來將進(jìn)一步研究更具有代表性的不同產(chǎn)地不同批次的紅花藥材，采用更多的有效成分作為評判指標(biāo)，使該研究能更加全面客觀地反映不同產(chǎn)地紅花藥材之間的質(zhì)量差異，為臨床合理使用紅花藥材提供參考。