郎亞昆 范鈺 范廷璐

肝癌是最常見的六種惡性腫瘤之一，也是全世界癌癥相關死亡的第二大原因[1]。由于其缺乏高特異性和敏感性的早期診斷生物標志物，且轉(zhuǎn)移率高，導致預后欠佳[2]。所以，尋找肝癌相關的潛在生物標志物對肝癌的診斷和治療異常重要。研究表明長鏈非編碼RNA（lncRNA）參與增殖、凋亡、侵襲和遷移等生物學行為[3]。lncRNA 在如肝癌、乳腺癌、胃癌、肺癌、前列腺癌等的發(fā)生中均有參與[4]。癌癥基因組圖譜（The cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)集的生物信息學分析已被證明是一種尋找多種惡性腫瘤診斷和預后標志物的新工具[5，6]。因此，本研究通過對TCGA 數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)進行挖掘，研究LINC02802 的表達水平在肝癌中的價值，探索LINC02802 表達水平與肝癌預后的關系，為進一步研究肝癌的發(fā)生發(fā)展提供依據(jù)。此外，我們分析了LINC02802 的表達與免疫細胞浸潤的相關性，為篩選免疫治療潛在獲益人群提供新思路。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集通過TCGA 數(shù)據(jù)庫收集424 例腫瘤組織和正常組織中LINC02802 表達水平，分析LINC02802 表達差異。

1.2 LINC02802 的表達與臨床病理學特征及預后相關性分析在TCGA 數(shù)據(jù)集中搜集到原始研究總樣本數(shù)為424 例，包括肝癌組織374 例，正常組織50 例，以LINC02802 表達量的中位數(shù)為界，分為高表達組和低表達組，進一步分析LINC02802 表達量與肝癌患者臨床病理特征及預后之間的關系。

1.3 LINC02802 表達與免疫細胞浸潤相關性分析采用R 軟件“GSVA”包對TCGA 數(shù)據(jù)庫肝癌TPM數(shù)據(jù)進行單樣本基因集富集分析（ssGSEA）[7]，得到免疫細胞類型評分，ssGSEA 免疫細胞類型的標記基因依據(jù)Bindea 等[8]的研究，評估腫瘤中的免疫細胞浸潤水平。然后進行Spearman 秩相關分析來檢測LINC02802 表達量與相應免疫細胞浸潤水平之間的關系。

1.4 統(tǒng)計學方法應用R（v.3.6.3）軟件進行統(tǒng)計學分析。采用Shapiro-Wilk normality test 對數(shù)據(jù)正態(tài)性進行檢驗，對服從正態(tài)分布的計量資料，組間比較采用t檢驗，否則應用Mann-Whitney U 或Wilcoxon 符號秩檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗或Fisher 檢驗。用Kaplan-Meier 法行生存分析，多因素分析采用Cox 回歸模型。檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1 肝癌組織和正常組織中LINC02802 的表達差異通過TCGA 分析樣本424 例，包括肝癌組織374 例，正常組織50 例。非配對分析中374 例肝癌組織中LINC02802 的表達量為0.621±0.699，50 例正常組織中LINC02802 的表達量為0.115±0.119，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）（見圖1A）。配對分析中50 例正常組織中LINC02802 的表達量為0.115±0.119，50 例肝癌組織中LINC02802 的表達量為0.406±0.329，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）（見圖1B）。相對于正常組織，LINC02802在肝癌組織中的表達量顯著增高。以正常組織為對照，做ROC 曲線，結果顯示AUC 為0.835，截尾值為0.165，敏感度和特異性分別為78.0%和78.3%（見圖1C）。

圖1 LINC02802 在肝癌組織及正常組織中的表達

2.2 LINC02802 的表達與肝癌患者臨床病理特征的關系將374 例肝癌患者以LINC02802 在肝癌組織中表達量的中位數(shù)為界值分為兩組，包括187 例低表達患者和187 例高表達患者。對LINC02802的表達與肝癌臨床病理特征進行分析，結果顯示LINC02802 的表達與組織學分級、血管浸潤及甲胎蛋白水平相關（P<0.05），見表1。

表1 LINC02802表達與肝癌患者臨床病理特征的關系[n（%）]

2.3 LINC02802 對肝癌患者預后的影響Kaplan-Meier 分析顯示LINC02802 表達量與肝癌患者總生存期明顯相關，與低表達患者相比，高表達患者的總生存期差（P=0.007）（見圖2）。單因素分析顯示，肝癌患者的T分期、M 分期、TNM 分期和LINC02802 表達量與預后有關。多因素Cox 回歸分析顯示，LINC02802 表達量是肝癌患者的獨立預后影響因素，且LINC02802 高表達患者的死亡風險是低表達患者的1.634 倍。見表2、3。

表2 肝癌患者預后單因素Cox 回歸分析

表3 肝癌患者預后多因素Cox 回歸分析

圖2 LINC02802 高、低表達肝癌患者總生存期曲線

2.4 LINC02802 表達與免疫浸潤細胞表面標記物的相關性分析為了確定LINC02802 表達對肝癌的影響是否與腫瘤免疫細胞浸潤有關，我們基于TCGA 數(shù)據(jù)庫中424 例肝癌患者的TPM 數(shù)據(jù)，采用ssGSEA 評估了免疫細胞浸潤和LINC02802 表達量之間的關系。Spearman 相關分析顯示，LINC02802的表達與NK CD56bright 細胞、Th2 細胞、TFH 細胞、巨噬細胞、T helper 細胞、aDC 細胞、iDC 細胞呈正相關（P<0.05），其中NK CD56bright 細胞、Th2 細胞、TFH 細胞是與LINC02802 表達呈正相關的前三種免疫細胞。LINC02802 的表達與Th17 細胞、中性粒細胞、Tcm 細胞、NK 細胞的浸潤呈負相關（P<0.05）。見圖3、表4。

表4 TCGA 數(shù)據(jù)庫分析LINC02802 與免疫浸潤細胞表面標記物的相關性

圖3 LINC02802 表達與免疫細胞浸潤水平關系

3 討論

肝癌是一種死亡率很高的常見惡性腫瘤[9]。近年來，越來越多的證據(jù)表明，異常lncRNA 參與了肝癌的發(fā)生和發(fā)展[10～13]。lncRNA 是一種長度超過200 個核苷酸的非編碼RNA[14]。多項研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA 通過不同機制在調(diào)控基因表達中發(fā)揮重要作用，如染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后加工等[15～17]。因此，lncRNAs 作為新的腫瘤標志物和治療目標具有很大的潛力。

本研究中，我們在TCGA 數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)了腫瘤相關分子LINC02802 在包括肝癌在內(nèi)的多種腫瘤中都有不同程度的表達，然而目前關于LINC02802的研究較少。我們通過TCGA 數(shù)據(jù)庫收集了肝癌患者的臨床病理特征和LINC02802 基因表達的相關數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)在肝癌組織中LINC02802 的表達水平明顯高于正常組織（P<0.001），提示LINC02802 可能是預測和治療肝癌潛在的靶點及腫瘤標志物。進一步分析LINC02802 的表達與肝癌臨床病理特征關系，提示其與組織學分級、血管浸潤及甲胎蛋白水平相關（P<0.05）。通過單因素分析發(fā)現(xiàn)患者的T 分期、M 分期、TNM 分期和LINC02802 表達與肝癌患者生存相關（P<0.05）。多因素Cox 回歸分析顯示，患者的LINC02802 表達量是肝癌患者預后的獨立影響因素，LINC02802 高表達患者的死亡風險是低表達患者的1.634 倍。

近年來，研究表明，腫瘤細胞與腫瘤微環(huán)境的相互影響在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起著關鍵作用，同時對免疫治療的療效也有重要影響[18～20]。本研究分析了LINC02802 表達量與相應免疫細胞浸潤水平之間的關系，結果顯示，LINC02802 的表達量與NK CD56bright 細胞、Th2 細胞、TFH 細胞、巨噬細胞、T helper 細胞等的浸潤水平呈正相關，與Th17 細胞、中性粒細胞、Tcm 細胞等的浸潤水平呈負相關。

綜上所述，LINC02802 的表達與肝癌的預后不良呈正相關，且與免疫細胞浸潤水平有關，為肝癌的診斷和預后提供新的生物標志物，同時對免疫治療具有重要意義。雖然本研究使用生物信息學工具對LINC02802 在肝癌中的作用進行探索，但尚存在不足，需要大量基礎實驗對本研究的預測結果進行驗證并探討其作用機制。