涂雅婷,王 萌,程 卉,李慶林

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,安徽 合肥 230012;2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)科研技術(shù)中心,安徽 合肥 230038;3.新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽 合肥 230038)

胃癌是常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和死亡率在全球惡性腫瘤中居于前5位[1]。目前,胃癌早期的主要治療方法是胃切除、淋巴結(jié)清掃聯(lián)合化學(xué)治療或放射治療[2],但由于胃癌早期診斷率極低,超過70%的患者發(fā)現(xiàn)時已是晚期,而針對晚期胃癌的治療方法主要是手術(shù)切除后結(jié)合傳統(tǒng)藥物輔助化學(xué)治療或放射治療,此時即使手術(shù)去除原發(fā)灶,預(yù)后仍不理想。此外,傳統(tǒng)藥物的發(fā)展遇到瓶頸,已很難進(jìn)一步提高患者的生存質(zhì)量。化學(xué)治療造成無法避免的嚴(yán)重胃損傷,在很大程度上阻礙了其臨床應(yīng)用[3]。因此,需要尋找更多對晚期胃癌轉(zhuǎn)移患者有效的藥物。

胃癌的發(fā)生、發(fā)展、擴(kuò)散及轉(zhuǎn)移與其微環(huán)境密切相關(guān)。腫瘤微環(huán)境是指實(shí)體瘤所處的局部生物環(huán)境,包括癌細(xì)胞和附近的間質(zhì)細(xì)胞[4]。腫瘤或間質(zhì)細(xì)胞分泌的可溶性因子在腫瘤微環(huán)境中含量豐富,有助于誘導(dǎo)腫瘤的異常增殖、血管生成、轉(zhuǎn)移和耐藥[5]。腫瘤微環(huán)境中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的發(fā)生與腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲密切相關(guān),EMT使靜止的貼壁細(xì)胞獲得遷移能力,是上皮細(xì)胞失去頂端-基底極性和細(xì)胞-細(xì)胞黏附,向侵襲性間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變的過程[6]。胃癌是臨床上侵襲性較強(qiáng)的腫瘤之一,因此,阻斷胃癌細(xì)胞的EMT是治療胃癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。

如何提高胃癌患者的臨床獲益是目前亟待解決的問題。中醫(yī)藥在腫瘤治療方面有一定的特色和優(yōu)勢。蟾蜍分泌物蟾酥及其干燥的蟾皮均可入藥。經(jīng)現(xiàn)代中藥成分分析,蟾酥及干蟾皮的化學(xué)成分主要有蟾蜍二烯羥酸內(nèi)酯類、蟾毒色胺類及甾醇類化合物等[7]。華蟾素(cinobufagin,CBG)注射液是由干蟾皮通過水提醇沉的方法得到的水溶性提取物[8],已納入國家基本醫(yī)保目錄作為抗腫瘤藥物進(jìn)入臨床應(yīng)用。臨床應(yīng)用[9-10]表明,CBG對多種癌癥均有明顯的治療作用。Shen等[11]研究發(fā)現(xiàn),CBG可通過調(diào)節(jié)miR-494-BAG-1軸抑制胃癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡。Xiong等[12]研究表明,抑制自噬可增強(qiáng)CBG誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡以起到抗腫瘤的作用。然而,CBG抑制胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制并不明確。本研究擬探討CBG注射液抑制胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,為CBG治療胃癌提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞 人胃腺癌細(xì)胞MGC-803購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。

1.2 藥物 CBG注射液(批號 200501)濃度為500 mg/mL,由安徽華潤金蟾藥業(yè)股份有限公司提供,成分為干蟾皮提取物,輔料為0.9%氯化鈉。

1.3 試劑 Transwell小室(貨號 14341,孔徑8.0 μm):美國Corning公司;Matrigel膠(貨號 B-P-00002-4):Biozellen公司;兔抗人E-cadherin抗體(貨號 20874-1-AP)、兔抗人N-cadherin抗體(貨號 22018-1-AP):Proteintech公司;兔抗人Vimentin抗體(貨號 R22775)、兔抗人Snail抗體(貨號 AF6032):成都正能生物技術(shù)有限責(zé)任公司;β-actin(貨號 AF5003):江蘇碧云天生物技術(shù)研究所;RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS):美國Gibco公司。

1.4 儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱、-80 ℃冰箱:日本Sanyo公司;倒置顯微鏡:日本Olympus公司;超凈工作臺:浙江蘇凈凈化設(shè)備有限公司;滅菌鍋:日本Hirayama公司;高速冷凍離心機(jī):德國Eppendorf;垂直電泳儀:上海天能科技有限公司。

2 方法

2.1 MGC-803細(xì)胞的培養(yǎng) MGC-803細(xì)胞在含10% FBS和1%青霉素-鏈霉素的1640培養(yǎng)基中,于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2 d用磷酸鹽緩沖溶液清洗細(xì)胞,并換成新鮮的完全培養(yǎng)基,待細(xì)胞密度長至80%～90%時,胰酶消化,離心,按1∶3的比例傳代培養(yǎng)。

2.2 CCK-8檢測CBG注射液對MGC-803細(xì)胞活力的影響 取對數(shù)生長期的MGC-803細(xì)胞,按每孔5×103接種于96孔板中,每組6個復(fù)孔,待細(xì)胞貼壁后,用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋含500 mg/mL CBG注射液的原液,分別給予細(xì)胞不同濃度(0、1、2、4、6、8、10 mg/mL)的CBG注射液(0 mg/mL即為空白對照組),24 h后每孔加入CCK-8溶液10 μL,30 min后用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測吸光值。

2.3 倒置顯微鏡下觀察CBG注射液對MGC-803細(xì)胞形態(tài)的影響 取對數(shù)生長期的MGC-803細(xì)胞,消化和收集,將細(xì)胞密度調(diào)整為每毫升5×104,接種于含1640培養(yǎng)基(含10% FBS和1%青霉素-鏈霉素)的25 cm2培養(yǎng)瓶中,于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后,更換為含有CBG注射液的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,倒置顯微鏡下(10×10倍)觀察細(xì)胞并拍照。

2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測CBG注射液對胃癌細(xì)胞劃痕愈合能力的影響 將MGC-803細(xì)胞接種于6孔板中(每孔1×106),每組3個復(fù)孔,待細(xì)胞貼壁后用槍頭在每孔的培養(yǎng)瓶底部劃橫線后,PBS洗去劃下的細(xì)胞,給藥后0、24 h在顯微鏡下觀察細(xì)胞在劃痕處的愈合情況。應(yīng)用Image J軟件分析愈合面積。劃痕愈合率=(0 h劃痕面積-24 h劃痕面積)/0 h劃痕面積×100%。

2.5 Transwell小室檢測CBG注射液對胃癌細(xì)胞遷移能力的影響 將MGC-803細(xì)胞接種于上室(放置在24孔板中,每孔2×104),下層24孔板加入含10%胎牛血清的800 μL培養(yǎng)基。孵育24 h后,用4%多聚甲醛將下室細(xì)胞固定,結(jié)晶紫染色30 min后,用棉簽輕輕擦拭小室內(nèi)部未穿膜過的細(xì)胞,光學(xué)顯微鏡下拍照統(tǒng)計(jì)遷移細(xì)胞數(shù)量。細(xì)胞遷移率=CBG注射液組細(xì)胞數(shù)/空白對照組細(xì)胞數(shù)×100%。

2.6 Transwell小室檢測CBG注射液對胃癌細(xì)胞侵襲能力的影響 將Matrigel膠加入小室(放置在24孔板中)。處理24 h后每孔加入20 000個細(xì)胞,下層24孔板加入含10% FBS的800 μL培養(yǎng)基。孵育24 h后,固定下室細(xì)胞,結(jié)晶紫染色30 min后,棉簽擦拭掉小室內(nèi)部未穿過的細(xì)胞,光學(xué)顯微鏡下拍照(10×20倍),然后統(tǒng)計(jì)侵襲細(xì)胞數(shù)量。細(xì)胞侵襲率=CBG注射液組細(xì)胞數(shù)/空白對照組細(xì)胞數(shù)×100%。

2.7 Western blot檢測CBG注射液對人胃癌細(xì)胞MGC-803中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和Snail表達(dá)水平的影響 用含PMSF的RIPA裂解液將MGC-803細(xì)胞裂解。使用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度,每孔加20 μg總蛋白。樣品經(jīng)8%～12% Bis-Tris PAGE電泳分離,轉(zhuǎn)移至PVDF膜檢測。用含5%脫脂牛奶的TBST室溫封閉2 h后,一抗孵育過夜。用TBST洗滌3次后,在IgG-HRP標(biāo)記的二抗(1∶10 000)中室溫孵育2 h。采用化學(xué)發(fā)光法檢測抗原,使用Image J軟件進(jìn)行條帶定量。

3 結(jié)果

3.1 CBG注射液對MGC-803細(xì)胞活力的影響 CBG注射液能抑制胃癌細(xì)胞MGC-803細(xì)胞的增殖活性,細(xì)胞存活率隨著CBG注射液濃度的增加和時間的延長呈現(xiàn)下降趨勢(P<0.05),其中7 mg/mL CBG注射液作用24 h后細(xì)胞存活率趨近IC50時存活率。因此,選擇CBG注射液作用時間為24 h進(jìn)行下一步研究。見圖1。

注:與24 h空白對照組比較,*P<0.05;與48 h空白對照組比較,#P<0.05圖1 CBG注射液對MGC-803細(xì)胞存活率的影響

3.2 CBG注射液對MGC-803細(xì)胞形態(tài)的影響 光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),處理細(xì)胞24 h后,空白對照組細(xì)胞形態(tài)正常,貼壁良好,折光性強(qiáng),而給予CBG注射液的各組細(xì)胞皺縮變圓,體積變小,細(xì)胞折光性明顯變?nèi)?貼壁較差,并且呈一定的劑量依賴性。見圖2。

注:A.空白對照組;B.2 mg/mL CBG注射液組;C.4 mg/mL CBG注射液組;D.6 mg/mL CBG注射液組圖2 光學(xué)顯微鏡觀察CBG注射液對MGC-803細(xì)胞形態(tài)的影響(10×10倍)

3.3 CBG注射液對MGC-803細(xì)胞劃痕愈合能力的影響 與空白對照組比較,CBG注射液各給藥組細(xì)胞的劃痕愈合變慢,并且呈現(xiàn)劑量依賴性(P<0.05)。結(jié)果表明,CBG注射液可以抑制MGC-803細(xì)胞的遷移能力。見圖3、表1。

表1 各組MGC-803細(xì)胞劃痕愈合率比較

圖3 光學(xué)顯微鏡下觀察CBG注射液對MGC-803細(xì)胞劃痕愈合能力的影響(10×4倍)

3.4 CBG注射液對MGC-803細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響 與空白對照組比較,CBG注射液可以顯著抑制MGC-803細(xì)胞遷移率和侵襲率(P<0.05),并且呈劑量依賴性,表明CBG注射液可抑制MGC-803的遷移和侵襲。見圖4、表2。

表2 各組MGC-803細(xì)胞遷移率和侵襲率比較

圖4 CBG注射液對MGC-803細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響(結(jié)晶紫染色,10×20倍)

3.5 CBG注射液對MGC-803細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響 與空白對照組比較,CBG注射液能上調(diào)MGC-803細(xì)胞E-cadherin蛋白的表達(dá)水平(P<0.05),下調(diào)N-cadherin、Vimentin和Snail蛋白的表達(dá)水平(P<0.05),且具有劑量依賴性。見圖5。

注:A.空白對照組;B.2 mg/mL CBG組;C.4 mg/mL CBG組;D.6 mg/mL CBG組;與空白對照組比較,*P<0.05;與2 mg/mL CBG注射液組比較,#P<0.05;與4 mg/mL CBG注射液組比較,△P<0.05圖5 各組MGC-803細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

4 討論

盡管過去幾十年來,針對胃癌的臨床療法在化學(xué)治療和靶向治療方面取得了重大進(jìn)展,但轉(zhuǎn)移仍然是胃癌患者有效治療的關(guān)鍵障礙[13]。尋找參與細(xì)胞遷移和侵襲的潛在分子機(jī)制有助于深入了解癌癥轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移是引起胃癌患者死亡的重要原因[14]。有研究[15]表明,EMT在癌癥進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過程中起著關(guān)鍵作用。在EMT過程中,上皮細(xì)胞失去其特征,重新編碼基因表達(dá)并獲得間質(zhì)特性,這使得侵入性表型得以進(jìn)化,并促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移[16]。因此,EMT一直被視為癌細(xì)胞侵襲行為的充分條件。

近年來多項(xiàng)研究[17]表明,CBG在胃癌的臨床治療中發(fā)揮作用。為了探究CBG抑制胃癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,本研究首先通過CCK-8實(shí)驗(yàn)、劃痕愈合實(shí)驗(yàn)以及Transwell小室的細(xì)胞遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)對藥效進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果表明,CBG注射液可以抑制胃癌細(xì)胞MGC-803的增殖、遷移與侵襲,且抑制效果呈劑量依賴性和時間依賴性。

EMT的共同特征是E-cadherin表達(dá)的下調(diào)甚至缺失,伴隨著N-cadherin表達(dá)的上調(diào)。這種變化增加了腫瘤細(xì)胞侵入和轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)端的能力。N-cadherin的表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞從原位脫落,甚至克服了E-cadherin的腫瘤抑制作用[18]。Snail是Snail轉(zhuǎn)錄因子家族的成員,其可以被TGF-β、Wnt、NOTCH等信號通路激活,從而抑制E-cadherin,誘導(dǎo)EMT并促進(jìn)細(xì)胞遷移[19]。Vimentin是一種重要的Ⅲ型中間絲蛋白,與其他細(xì)胞骨架成分(如微絲和微管)一起在細(xì)胞結(jié)構(gòu)的支撐、附著、遷移和信號傳導(dǎo)等動態(tài)過程中起重要作用[20]。在癌癥轉(zhuǎn)移過程中,總是能觀察到Vimentin的過表達(dá),因此Vimentin被普遍認(rèn)為是EMT的典型分子標(biāo)志物[21]。本研究通過Western blot法探究CBG注射液抑制胃癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制是否與EMT有關(guān)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),CBG注射液可以上調(diào)上皮標(biāo)志蛋白E-cadherin的表達(dá)水平,下調(diào)間充質(zhì)標(biāo)志蛋白N-cadherin以及與EMT密切相關(guān)的Vimentin和Snail的表達(dá)水平,表明CBG注射液可以抑制胃癌細(xì)胞MGC-803的EMT。

綜上所述,CBG注射液能明顯抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,其機(jī)制可能與改善胃癌細(xì)胞的EMT過程有關(guān)。但本研究僅從細(xì)胞層面進(jìn)行了探究,對于CBG注射液體內(nèi)抗胃癌的作用及分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。