張琛 劉輝 郗篤雋 駱慧楓 裴嘉博 黃康康 阮若昕 賴夢霞 樊懷福

摘要：【目的】從生理水平分析高溫對甜櫻桃相關(guān)生理指標(biāo)的影響并篩選代表性指標(biāo)，為下一步甜櫻桃對高溫響應(yīng)的生理指標(biāo)的篩選和耐熱性評價體系的建立提供參考?！痉椒ā恳蕴饳烟宜_米脫為試材，通過人工模擬高溫和自然高溫環(huán)境，探究植株葉片生理、葉綠素?zé)晒獾戎笜?biāo)變化，并通過相關(guān)性分析、主成分分析和聚類分析等方法篩選出高溫對甜櫻桃生理影響的代表性指標(biāo)?！窘Y(jié)果】高溫處理后，人工氣候箱處理A組和自然高溫處理C組的甜櫻桃葉片內(nèi)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（peroxidase，POD）、谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）、過氧化氫酶（catalase，CAT）和抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase， APX）5 種酶的活性均升高，但人工氣候箱處理B組的甜櫻桃葉片內(nèi)CAT和APX活性下降。A、B、C組脯氨酸含量分別為高溫前的3.07、4.03、2.94 倍，超氧陰離子自由基（superoxide anion，O2 ·-）產(chǎn)生速率分別為高溫前的2.37、2.48、2.25 倍。A、C組中甜櫻桃葉片的可溶性蛋白含量增加，可溶性糖含量顯著下降；而B組中可溶性蛋白含量顯著性下降，為處理前的54.18%，可溶性糖含量增加了1.32%。3 組處理中光系統(tǒng)（photosystem Ⅱ，PSⅡ）最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）、潛在光化學(xué)活性（Fv/Fo）、電子傳遞速率（electron transportrate，ETR）、非光化學(xué)淬滅（non-photochemical quenching，NPQ）4個熒光參數(shù)均出現(xiàn)不同程度下降，PSⅡ反應(yīng)中心受損活性下降。葉肉局部超顯微結(jié)構(gòu)觀察表明，高溫對甜櫻桃葉綠體、線粒體造成損傷。C組相關(guān)性分析表明，部分酶活性（CAT、APX）與部分熒光參數(shù)（ETR、Fv/Fo）之間、GR活性與多種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量（脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖）之間存在相關(guān)性，可通過聚類分析將11個具有相關(guān)性的生理指標(biāo)分為3類?！窘Y(jié)論】高溫處理使甜櫻桃受到氧化損傷，其抗氧化酶系統(tǒng)、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)均對脅迫做出響應(yīng)。APX活性、GR活性、ETR 3 個指標(biāo)可作為本試驗中高溫對薩米脫生理影響的代表性指標(biāo)，為今后甜櫻桃對高溫響應(yīng)的生理指標(biāo)的篩選和耐熱性評價體系的建立提供一定的參考。

關(guān)鍵詞：甜櫻桃；高溫；生理響應(yīng)；葉綠素?zé)晒?/p>

中圖分類號：S662.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1009-9980（2023）04-0712-12

溫度是植物生長發(fā)育過程中重要的環(huán)境因子之一。近年來，人類活動排放的CO2等氣體增加了溫室氣體濃度，全球溫室效應(yīng)致使氣溫逐年上升。據(jù)聯(lián)合國政府間氣候變化專門委員會（IntergovernmentalPanel on Climate Change，IPCC）報告顯示，全球平均氣溫每10 a（年）將上升0.3 ℃[1]。2021 年IPCC第一工作組最新評估報告指出，通過對未來20年的平均溫度變化預(yù)計，全球溫度升高將達(dá)到或超過1.5 ℃。高溫已逐漸成為嚴(yán)重危害植物生長發(fā)育的非生物脅迫因子之一，抑制了植物的生理代謝[2]。植物熱脅迫應(yīng)對機(jī)制一直是研究關(guān)注的熱點，也是后期耐熱品種篩選的基礎(chǔ)。在生理水平上，植物活性氧（reactive oxygen species，ROS）清除系統(tǒng)相關(guān)酶活性、光合特性及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的變化等被廣泛研究；在分子水平上，與熱應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的熱休克轉(zhuǎn)錄因子（heat shock transcription factors，HSFs）和熱休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）、Ca+介導(dǎo)的信號通路亦受到高度關(guān)注[3-4]。高溫處理使葡萄葉片的過氧化物酶（peroxidase，POD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等抗氧化酶活性升高[5]，凈光合速率Pn顯著降低[6]。連續(xù)高溫顯著降低光系統(tǒng)（photosystemⅡ，PSⅡ）反應(yīng)中心活性，PSⅡ正常功能受阻[5，7]，同時，超顯微結(jié)構(gòu)觀察表明葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[8]。單粒質(zhì)量及可滴定酸、花色苷含量均顯著降低，導(dǎo)致果實品質(zhì)下降[7]。在草莓[9]、香梨[10]、越橘[11]等果樹樹種上均有類似報道。自噬相關(guān)基因MdATG18a 可通過保護(hù)葉綠體、維持高水平光合作用、清除ROS 等方面增強(qiáng)蘋果的耐熱性[12]，MYB、ERF 等基因家族在物質(zhì)合成與代謝、激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)方面的基礎(chǔ)耐熱性研究中起著關(guān)鍵作用[13-14]。甜櫻桃（Pruns avium L.）在我國集中栽培于渤海灣地區(qū)，具有較高的經(jīng)濟(jì)價值，同時南方春季升溫早，因此逐漸受以采摘游為主的南方果園青睞。浙江省夏季溫度較高，7—9 月期間40 ℃以上極端高溫天氣年均4.1 d [15]。本課題組結(jié)合杭州市氣象統(tǒng)計數(shù)據(jù)，連續(xù)多年對杭州市夏天（6—8 月）高溫天數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn)，2016—2020 年連續(xù)5 a 夏天30 ℃以上高溫天氣在55 d 以上，35 ℃以上高溫天氣在25 d以上，其中2016—2018 年連續(xù)3 a 夏天35 ℃以上高溫天氣均在35 d 以上。對于適應(yīng)于北方冷涼氣候的甜櫻桃而言，杭州地區(qū)夏季溫度過高，而高溫與雙雌蕊的發(fā)生密切相關(guān)[16]，會影響翌年坐果率[17]。由此可見，高溫是制約甜櫻桃在南方地區(qū)發(fā)展的因子之一，篩選耐高溫的品種是南方地區(qū)甜櫻桃引種適栽的研究目標(biāo)之一，也是后期耐高溫品種創(chuàng)制的基礎(chǔ)。目前，關(guān)于高溫脅迫對甜櫻桃生理生化、光合作用影響的研究較少。孟祥麗[18]以早大果為接穗，對5種不同砧木組成的砧穗組合進(jìn)行高溫處理，指出45 ℃處理對PSⅡ中心造成破壞，并通過生理和形態(tài)學(xué)指標(biāo)分析對5 種砧穗組合的耐熱性進(jìn)行排序。孟聰睿[19]通過模擬高溫測定了櫻桃組培苗葉片滲透物質(zhì)及抗氧化酶含量。吳曄[20]為探尋試管苗熱處理脫毒法的溫度條件，對10 個櫻桃砧木組培試管苗進(jìn)行耐熱性差異觀測。

吉塞拉（Gisela）系列是目前南方地區(qū)甜櫻桃栽培中最常用的砧木，為矮化/半矮化砧，具有親和性較好、適應(yīng)性強(qiáng)、抗病、提前結(jié)果等優(yōu)點，但關(guān)于品種在吉塞拉砧木上的耐熱性表現(xiàn)尚未見報道。本課題組通過多年引種進(jìn)行適應(yīng)性栽培，篩選出適合于杭州地區(qū)的甜櫻桃品種薩米脫（Summit）。該品種在本地多年適栽后，具有相對穩(wěn)定的產(chǎn)量，但在夏季溫度較高的年份有一定比例的雙雌蕊率[17]。筆者在本研究中以此為切入點，以甜櫻桃薩米脫為接穗、吉塞拉作為砧木的嫁接苗為試材，通過模擬高溫或自然環(huán)境，探究其植株在不同的高溫處理下葉片生理、葉綠素?zé)晒庵笜?biāo)的變化，以期從生理水平分析甜櫻桃對高溫的響應(yīng)機(jī)制，為下一步甜櫻桃耐熱性評價體系建立提供參考，也為今后南方地區(qū)甜櫻桃耐高溫品種（系）的篩選及育種、耐高溫栽培技術(shù)研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗于2019 年在浙江農(nóng)林大學(xué)官塘基地避雨大棚內(nèi)進(jìn)行。試材為1 年生薩米脫盆栽嫁接苗，砧木為吉塞拉6 號。

1.2 采樣處理方法

試驗中高溫處理分別采用人工氣候箱、田間自然高溫2種方式，設(shè)為A、B、C共3組。其中，A、B組均使用人工氣候箱模擬高溫，C組為田間自然高溫。A、B組試驗于2019 年8 月25 日至2019 年8 月26 日進(jìn)行。A組：試材為植株盆栽苗。隨機(jī)挑取生長一致且健壯的盆栽苗6 盆，分別置于25、45 ℃的人工氣候箱內(nèi)進(jìn)行處理12 h，濕度70%，光照度12 000 lx，處理后隨機(jī)采集無病害成熟葉片，10 枚葉片為一組，3 次重復(fù)；B組：試材為植株盆栽苗離體葉片。摘取無病害成熟葉片用濕棉球包裹葉柄，基部覆以保鮮膜以保持葉柄水分，分別置于25、45 ℃的人工氣候箱內(nèi)進(jìn)行處理12 h，濕度70%，光照度12 000 lx，10枚葉片為一組，3次重復(fù)；C組：于2019年8月25日至2019年8月30日期間利用大棚內(nèi)自然高溫進(jìn)行處理。試材為植株盆栽苗。將盆栽苗移入塑料大棚內(nèi)，使用WS-TH23PRO溫濕度記錄儀記錄大棚內(nèi)的溫濕度（圖1）。分別于移入0、3（高溫后）、5 d（恢復(fù)期）時隨機(jī)采集無病害成熟葉片，10 片為一組，3 次重復(fù)。以上樣品采集后洗凈表面浮土灰塵等，液氮冷凍后置于-80℃冰箱中保存，用于生理指標(biāo)測定。將3 組處理（7 種狀態(tài)）分別標(biāo)記為：A-25 ℃（T1）、A-45 ℃（T2）、B-25 ℃（T3）、B-45 ℃（T4）、C-0 d（T5）、C-3 d（T6）、C-5 d（T7）。

1.3 測定指標(biāo)及方法

生理指標(biāo)測定方法：可溶性糖含量采用蒽酮法測定，可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250 法測定，脯氨酸含量采用茚三酮法測定，丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法測定，SOD活性采用愈創(chuàng)木酚比色法測定，POD 活性采用氮藍(lán)唑（NBT）法測定，CAT活性采用紫外吸收法測定，抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活性根據(jù)劉冬峰[10]的方法測定，谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）活性參考張騰國等[21]的方法測定，O2 ·-生成速率參照孟祥麗[18]的方法測定。采用德國Walz 公司PAM-2500 便攜式葉綠素?zé)晒鈨x測定初始熒光（Fo）、最大光化學(xué)效率（Fm）、PSⅡ最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）、非光化學(xué)淬滅系數(shù)（non- photochemicalquenching，NPQ）、表觀電子傳遞速率（electrontransport rate，ETR）。每個參數(shù)設(shè)3 次生物學(xué)重復(fù)。透射電鏡觀察方法：取A組25、45 ℃植株中部的功能葉片，于其主脈兩側(cè)部分用刀片切成1 mm×1 mm小方塊放入2 mL離心管中，使用Alfa Aesar電鏡固定液固定，并用真空泵抽氣直至沉底，室溫放置2 h后轉(zhuǎn)入4 ℃儲存。使用PBS緩沖液漂洗3次后用1%鋨酸室溫固定5 h。再次使用PBS緩沖液漂洗3次后用乙醇梯度脫水。使用丙酮和包埋劑滲透隨后包埋。Leica UC60 超薄切片機(jī)切片，采用鈾鉛雙染色，在日立HT7650 型透射電鏡下觀察拍照。采用Excel 2019 和DPS 18.10 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析和Duncan 法比較差異顯著水平（p＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫對甜櫻桃葉片抗氧化系統(tǒng)酶活性的影響

由圖2 可知，高溫后A組葉片內(nèi)5 種酶活性均升高。其中，SOD、POD活性升幅較大，其值較高溫前分別升高了46.14%、131.63%。B組葉片內(nèi)SOD、POD、GR活性均升高，但CAT、APX活性下降，其值分別較高溫前下降了43.00%、27.83%。C組變化趨勢與A組相同，高溫后甜櫻桃葉片內(nèi)5 種酶活性均升高。其中，CAT、APX、GR活性在高溫后顯著升高，分別為高溫前活性的1.91、2.36、1.41 倍。當(dāng)溫度降低植株進(jìn)入恢復(fù)期，除POD活性仍升高外，其余4 種酶活性顯著降低。此時，CAT、APX活性仍顯著高于處理前的水平，SOD、GR活性則低于處理前的水平。

2.2 高溫對甜櫻桃葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量和O2 ·-產(chǎn)生速率的影響

圖3 表明，高溫后A組甜櫻桃葉片內(nèi)MDA、脯氨酸含量及O2 ·-產(chǎn)生速率均升高。其中，脯氨酸含量、O2 ·-產(chǎn)生速率升高幅度較大，A、B組脯氨酸含量分別為高溫前的3.07、4.03 倍，O2 ·-產(chǎn)生速率分別為高溫前的2.37、2.48 倍?？扇苄缘鞍缀涂扇苄蕴呛孔兓煌?，A組甜櫻桃葉片的可溶性蛋白含量增加，而B組的含量下降，為處理前的54.18%；高溫后A組甜櫻桃葉片的可溶性糖含量降低，而B組的增加了1.32%。

C組各個指標(biāo)的變化趨勢與A組相同。高溫后甜櫻桃葉片內(nèi)MDA、可溶性蛋白含量少量增加，脯氨酸含量、O2 ·-產(chǎn)生速率則顯著升高，脯氨酸含量為高溫前的2.94 倍，O2 ·-產(chǎn)生速率為高溫前的2.25 倍，而可溶性糖含量降低了21.39%。當(dāng)溫度降低植株進(jìn)入恢復(fù)期，甜櫻桃葉片內(nèi)MDA、脯氨酸含量及O2 ·-產(chǎn)生速率仍呈升高趨勢，此時MDA、脯氨酸含量、O2·-產(chǎn)生速率為高溫前的1.08、10.63、6.36倍。恢復(fù)期葉片內(nèi)可溶性蛋白含量回降，顯著低于高溫前的水平，同時可溶性糖含量回升，高于高溫前的水平。

2.3 高溫對甜櫻桃葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

由圖4 可知，3 組甜櫻桃在高溫處理后，F(xiàn)v/Fm、Fv/Fo、ETR、NPQ 4 個參數(shù)值均呈現(xiàn)不同程度的下降。A組Fv/Fo下降幅度較大，其值比高溫前降低了37.00%；B組Fv/Fo、NPQ下降幅度較大，其值分別比高溫前降低了22.34%、32.04%；C 組Fv/Fo、ETR、NPQ 3 個參數(shù)值顯著降低，分別比高溫前降低了7.62%、40.90%、17.42%。恢復(fù)期內(nèi)，甜櫻桃葉片NPQ仍呈下降趨勢，而Fv/Fm、Fv/Fo、ETR 3 個參數(shù)值有所回升但仍低于處理前的水平。

2.4 高溫對甜櫻桃葉片葉肉細(xì)胞局部超顯微結(jié)構(gòu)的影響

由圖5 可見，高溫前細(xì)胞內(nèi)胞間隙較小，葉綠體呈長橢圓形，緊貼于細(xì)胞壁，基粒排列整齊有序，可見到有少量嗜鋨顆粒分布。線粒體近圓形，多分布于2 個葉綠體之間，含有豐富的嵴。高溫后，葉綠體腫脹，部分形態(tài)扭曲呈不規(guī)則狀，逐漸向細(xì)胞中央靠攏，整個細(xì)胞中散布有淀粉粒和大量細(xì)胞碎片組成的團(tuán)塊（圖5-b）。葉綠體內(nèi)有體積較大的淀粉粒，受其擠壓類囊體片層出現(xiàn)扭曲，基質(zhì)片層明顯松散，結(jié)構(gòu)趨于紊亂。嗜鋨顆粒增大、積累并相互聚集（圖5-d）。線粒體嵴開始變得模糊，可見到明顯結(jié)晶（圖5-f）。

2.5 甜櫻桃生理指標(biāo)、葉綠素?zé)晒鈪?shù)相關(guān)性分析

對C 組中14 個生理指標(biāo)相關(guān)性分析可知，在p＜0.01 差異水平下，多個指標(biāo)之間存在極顯著相關(guān)關(guān)系（圖6）。APX活性與CAT活性表現(xiàn)出極顯著正相關(guān)，與熒光參數(shù)ETR（r=-0.807）、Fv/Fo （r=-0.922）呈極顯著負(fù)相關(guān)，且與CAT 活性相關(guān)性極強(qiáng)（r=0.951）；CAT 活性與熒光參數(shù)ETR（r=-0.862）、Fv/Fo（r=-0.906）呈極顯著負(fù)相關(guān)；GR 活性與可溶性蛋白含量（r=0.909）呈極顯著正相關(guān)，與可溶性含量（r=-0.822）呈極顯著負(fù)相關(guān)；O2 ·-產(chǎn)生速率與脯氨酸含量（r=0.988）呈極顯著正相關(guān)且相關(guān)性極強(qiáng)，與可溶性蛋白含量（r=-0.844）呈極顯著負(fù)相關(guān)；脯氨酸含量與可溶性蛋白（r=-0.874）含量呈極顯著負(fù)相關(guān)；ETR 與NPQ（r=0.832）、Fv/Fo （r=0.924）呈極顯著正相關(guān)。SOD 活性與GR 活性呈顯著正相關(guān)（r=0.716，p＜0.05），GR活性與O2 ·-產(chǎn)生速率（r=-0.758，p＜0.05）、脯氨酸含量呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.783，p＜0.05），O2 ·-產(chǎn)生速率與NPQ（r=-0.763，p＜0.05）呈顯著負(fù)相關(guān)，脯氨酸含量與NPQ（r=-0.777，p＜0.05）呈顯著負(fù)相關(guān)，可溶性蛋白含量與可溶性糖含量（r=-0.700，p＜0.05）呈顯著負(fù)相關(guān)。綜合可知，在田間試驗中，甜櫻桃葉片中部分酶活性（CAT、APX）與部分熒光參數(shù)（ETR、Fv/Fo）之間、GR活性與多種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖）含量存在相關(guān)關(guān)系，而POD活性、MDA含量、Fv/Fm與其他指標(biāo)間并無顯著相關(guān)關(guān)系。

對甜櫻桃高溫處理檢測的11 個具有相關(guān)性的生理指標(biāo)采用主成分分析法進(jìn)行因子分析。提取特征值＞1 的因子，結(jié)果表明，前2 個因子為主因子，其包含的信息量累計貢獻(xiàn)率達(dá)89.881%（表1）。因子1的方差貢獻(xiàn)率為45.929%，選擇特征向量值較大的變量作為代表性變量為APX、SOD、GR 酶活性，定義為酶活參數(shù)因子。因子2 的方差貢獻(xiàn)率為43.952%，選擇特征向量值較大的變量作為代表性變量為ETR、NPQ，定義為熒光參數(shù)因子。

11 個具有相關(guān)性的生理指標(biāo)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換后，采用可變類平均法進(jìn)行聚類分析（圖7）。將11 個生理指標(biāo)聚為3 類：第1 類包括APX、CAT 活性，為酶活指標(biāo)；第2 類為GR活性，為酶活指標(biāo)；第3 類包括SOD活性、O2 ·-產(chǎn)生速率、脯氨酸含量、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、ETR、NPQ、Fv/Fo，為混合指標(biāo)。結(jié)合相關(guān)性分析，APX活性與CAT活性呈極顯著正相關(guān)，與ETR、NPQ、Fv/Fo呈極顯著負(fù)相關(guān)，由此可見APX活性、GR活性、ETR可作為本試驗中高溫對薩米脫生理影響較為代表性的指標(biāo)，可為今后甜櫻桃對高溫響應(yīng)的生理指標(biāo)篩選提供一定的參考。

2.6 高溫對甜櫻桃生理影響代表性指標(biāo)選擇

將聚類分析后篩選出的3 個指標(biāo)作為高溫對甜櫻桃生理影響較為代表性的指標(biāo)，采用K-均值法迭代計算對試驗中進(jìn)行的3 組處理（7 種不同狀態(tài)）的甜櫻桃進(jìn)行動態(tài)聚類。表2 結(jié)果表明，7 種不同狀態(tài)的甜櫻桃被分為3 類：第1 類包含處理T4，其對高溫響應(yīng)特征為高水平GR活性、低水平APX活性；第2 類包含處理T1、T2、T3、T5，對高溫響應(yīng)特征為高ETR指數(shù)、低水平GR活性；第3 類包含處理T6、T7，對高溫響應(yīng)特征為高水平APX 活性、低ETR 指數(shù)。結(jié)合甜櫻桃生理指標(biāo)熱圖（圖8）可知，T4 組各生理指標(biāo)值與其他處理有明顯差異，單獨為一類；T1、T3、T5 均代表各處理在高溫脅迫前的生理狀態(tài)，T2 各指標(biāo)與這三組數(shù)據(jù)相近，同屬于一類；T6、T7 為田間處理在高溫脅迫后的生理狀態(tài)，歸屬為一類。由此可知，聚類結(jié)果與7 種不同狀態(tài)下甜櫻桃生理指標(biāo)熱圖（圖8）分析結(jié)果相對應(yīng)，上述篩選的APX 活性、GR 活性、ETR 3 個指標(biāo)可作為本試驗中高溫對薩米脫生理影響較為代表性的指標(biāo)，可為今后甜櫻桃對高溫響應(yīng)的生理指標(biāo)篩選提供一定的參考。

3 討論

極端高溫天氣頻發(fā)給植物生長帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，植物對高溫的生理響應(yīng)及其分子機(jī)制的研究是耐高溫品種選育的基礎(chǔ)。正常情況下，植物體內(nèi)ROS保持在平衡狀態(tài)，高溫脅迫導(dǎo)致ROS 大量積累，對膜質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸高分子造成損傷[2]。在長期進(jìn)化過程中，植物已具備對各種非生物脅迫的適應(yīng)機(jī)制，包括ROS清除機(jī)制、滲透物質(zhì)調(diào)節(jié)、離子轉(zhuǎn)運蛋白、信號級聯(lián)和轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)[22]。ROS清除機(jī)制分為酶促和非酶促防御系統(tǒng)。SOD、POD、CAT、APX、GR均是酶促防御系統(tǒng)中的重要成員。SOD是植物體內(nèi)唯一能夠清除O2·-的酶，可有效減輕脅迫對膜系統(tǒng)的傷害，是抵御氧化脅迫的第一道防線。SOD催化光系統(tǒng)Ⅰ （photosystem Ⅰ ，PSⅠ） 中產(chǎn)生的O2 ·- 轉(zhuǎn)化為H2O2，其后在CAT 或其他還原劑參與下被APX、POD等轉(zhuǎn)化為H2O。夏黑葡萄在35、45 ℃高溫處理后POD、CAT 活性快速升高[5]。油桃在高溫環(huán)境下SOD活性緩慢升高，CAT 活性先升高后下降[23]。高溫干旱處理下，香梨葉片中SOD、CAT 活性升高，POD活性先升高隨后下降[24]。但是，高溫對北高叢越橘SOD活性影響并不大，只對POD、CAT 活性有改變[11]。本試驗中，經(jīng)歷田間高溫后C組甜櫻桃葉片中SOD、POD、CAT活性均升高，人工高溫處理后A組葉片中3種酶活性亦升高，而B組葉片中CAT活性顯著降低，這很可能與試驗材料的選擇有關(guān)。B組試驗材料為離體葉片，相對A、C組材料其代謝強(qiáng)度降低。通常認(rèn)為，CAT活性與植物抗逆性及植物代謝強(qiáng)度密切相關(guān)[25]。APX 活性也有同樣的變化趨勢。APX和GR是抗環(huán)血酸-谷胱甘肽（ASA-GSH）循環(huán)中的限速酶，該循環(huán)在清除H2O2、調(diào)控細(xì)胞H2O2水平上有重要作用。在葉綠體中，GR平衡ROS 濃度，防止膜脂過氧化以保護(hù)類囊體膜系統(tǒng)維持有效的光合作用[26]。因此，GR活性通常被認(rèn)為是機(jī)體內(nèi)抗氧化狀態(tài)的重要標(biāo)志[21]。高溫處理下，杜鵑葉片的APX、GR活性隨脅迫程度加深先升高后降低[27]，野扇花APX活性也呈現(xiàn)同樣變化[28]。本試驗中，高溫使A、C 2組中甜櫻桃葉片的APX、GR酶活性均升高，但B組葉片中APX活性降低。結(jié)合相關(guān)性分析可知，APX活性與CAT活性之間存在極顯著正相關(guān)，故B組中CAT和APX活性的變化呈現(xiàn)相同趨勢。

MDA含量和O2 ·-產(chǎn)生速率是衡量膜脂過氧化、植物氧化脅迫程度的重要指標(biāo)。高溫脅迫下，油桃MDA含量則呈微增-減少-增加趨勢[23]。本試驗中，高溫使得3 組甜櫻桃葉片MDA含量升高，O2 ·-產(chǎn)生速率較處理前顯著升高，這與前人在櫻桃中的研究結(jié)果相同[18-19]。在C組中，即使后期溫度下降，葉片內(nèi)MDA含量和O2 ·-產(chǎn)生速率仍呈升高趨勢，表明高溫對甜櫻桃造成損傷，膜脂過氧化程度較高。在正常狀態(tài)下，葉綠體中O2 ·-產(chǎn)生速率約為240 μmol·s-1，但在逆境條件下速率為240～720 μmol · s-1[10]。本試驗數(shù)據(jù)表明，甜櫻桃正常狀態(tài)下葉片中O2 ·-產(chǎn)生速率＜100 μmol · s- 1，但高溫脅迫后速率升高至100～300 μmol · s- 1。除抗氧化酶系統(tǒng)外，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖等）通過調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透平衡來抵制外界脅迫對植物造成的傷害[2]。研究表明，耐熱性強(qiáng)的品種脯氨酸含量更高，在高溫干旱處理下，香梨葉片中可溶性蛋白含量下降，可溶性糖含量逐漸增加[24]。本試驗C組中，高溫使甜櫻桃葉片內(nèi)可溶性糖含量降低，可溶性蛋白含量升高。A組葉片內(nèi)同樣指標(biāo)亦呈相同變化，但B組葉片中則呈相反趨勢，這很可能與葉片離體后源庫關(guān)系改變有關(guān)。

葉綠體是植物細(xì)胞中對熱脅迫較敏感的細(xì)胞器。研究表明，高溫脅迫會使葉綠體性狀趨于圓形并向細(xì)胞中央轉(zhuǎn)移，被膜出現(xiàn)不同程度的斷裂，類囊體片層松散并隨機(jī)分布著大量嗜鋨顆粒。嗜鋨顆粒的大小和數(shù)量通常與膜脂過氧化程度密切相關(guān)[8]，顆粒體積變大并積累預(yù)示細(xì)胞老化和解體。光合作用的一部分同化產(chǎn)物以淀粉形式在植物體內(nèi)積累。高溫脅迫下植物韌皮部胼胝體增多導(dǎo)致維管束堵塞，從而影響同化產(chǎn)物在韌皮部的運輸，淀粉粒逐漸積累[29]。本試驗中，高溫后甜櫻桃葉綠體和線粒體受到不同程度損傷，表現(xiàn)為葉綠體外形膨脹變圓、類囊體片層扭曲、基質(zhì)片層明顯松散、結(jié)構(gòu)趨于紊亂、淀粉粒及嗜鋨顆粒增大并積累和線粒體嵴開始變得模糊等。葡萄、越橘在高溫脅迫后葉綠體中出現(xiàn)大量巨型淀粉粒及大量嗜鋨顆粒[8，11]，與本試驗中研究結(jié)果一致。

PSⅠ和PSⅡ反應(yīng)中心是ROS產(chǎn)生的主要位點，脅迫條件下PSⅠ比PSⅡ穩(wěn)定，PSⅡ?qū)Ω邷孛舾衃30]。葉綠素?zé)晒饪煽焖贌o損收集PSⅡ性能相關(guān)數(shù)據(jù)，是對類囊體膜功能變化情況的定量檢測。Fv/Fm、Fv/Fo是鑒定植物是否遭受高溫脅迫的重要熒光參數(shù)，其中最大光化學(xué)量子產(chǎn)率Fv/Fm，是植物PSⅡ系統(tǒng)初始光能轉(zhuǎn)換效率的標(biāo)志指標(biāo)，通常認(rèn)為該值與植物的耐熱性具有良好一致性[31]，是耐熱性鑒定的重要指標(biāo)。高溫脅迫下快白菜Fv/Fm降低[32]，同樣的變化在草莓、葡萄、越橘[7，9，11，31]等多個樹種上都有報道。葉綠體結(jié)構(gòu)和光合性能密切相關(guān)。本試驗中，高溫處理使葉綠體結(jié)構(gòu)受損，F(xiàn)v/Fm、Fv/Fo、ETR、NPQ 均出現(xiàn)不同程度下降，表明高溫抑制了甜櫻桃光能轉(zhuǎn)化效率，PSⅡ反應(yīng)中心活性下降，同化力（NADPH、ATP）形成受阻，對碳固定同化造成了影響，熱耗散的能量降低。PSⅡ的最大效率與積累的ROS之間存在線性關(guān)系[33]，這在本試驗中相關(guān)性分析中也被證實。

主成分分析是考察多個變量間相關(guān)性的常用多元統(tǒng)計方法之一，在植物抗逆性鑒定與評價研究中廣泛應(yīng)用[31，34]。田間栽培是果樹引種適應(yīng)性栽培過程中各種性狀考察的主要場所，在田間具有優(yōu)良性狀和較高抗性的品種才具備推廣的價值。本研究對C組各個指標(biāo)，通過主成分分析將具有相關(guān)性關(guān)系的生理指標(biāo)降維及系統(tǒng)聚類分析，篩選出3 個指標(biāo)作為高溫對甜櫻桃生理影響的代表性指標(biāo)。利用篩選出的3 個代表性指標(biāo)將試驗中3 組處理7 種狀態(tài)進(jìn)行動態(tài)聚類分析，分類結(jié)果與實際測得各狀態(tài)間指標(biāo)差異情況吻合。由此可知，上述篩選的APX活性、GR活性、ETR 3 個指標(biāo)可作為本試驗中高溫對薩米脫生理影響的代表性指標(biāo)，為今后甜櫻桃對高溫響應(yīng)的生理指標(biāo)篩選提供一定的參考。

4 結(jié)論

高溫處理使甜櫻桃受到氧化損傷，葉綠體、線粒體結(jié)構(gòu)受損，抗氧化酶系統(tǒng)、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)均對脅迫做出響應(yīng)，以維持抗氧化酶系統(tǒng)的穩(wěn)定，降低膜透性損害。APX活性、GR活性、ETR 3 個指標(biāo)可作為高溫對薩米脫生理影響的代表性指標(biāo)，為今后甜櫻桃對高溫響應(yīng)的生理指標(biāo)篩選提供一定的參考。參考文獻(xiàn)References：

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