徐功勛 周佳 呂德國 秦嗣軍

摘要：【目的】探究4 個(gè)具有親代遺傳關(guān)系蘋果品種的抗寒性，明確能夠反映抗寒性強(qiáng)弱的生理指標(biāo)，為寒地蘋果選育過程中優(yōu)系快速篩選及抗寒栽培管理提供理論支持?！痉椒ā恳蚤L(zhǎng)富2 號(hào)、寒富、東光和龍帥休眠期1 年生枝為試材，分別在-15、-20、-25、-30、-35 ℃低溫下處理24 h，并于4 ℃環(huán)境中緩凍24 h，測(cè)定膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、活性氧代謝和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)生理指標(biāo)，結(jié)合主成分分析綜合評(píng)價(jià)影響蘋果品種抗寒性差異的生理因素?！窘Y(jié)果】隨著處理溫度的降低，4 個(gè)蘋果品種的相對(duì)電導(dǎo)率和丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，抗寒性強(qiáng)的龍帥相對(duì)電導(dǎo)率在不同低溫處理下均低于其他品種且變化較為平穩(wěn)。相比于-15 ℃處理，長(zhǎng)富2 號(hào)枝條中的O2.-和H2O2含量在-35 ℃時(shí)分別增加了38.07%和12.63%，顯著高于其他品種?？购栽綇?qiáng)的品種抗氧化酶活性越較高，且響應(yīng)低溫的速率較快。低溫下抗寒性品種積累大量的可溶性蛋白質(zhì)、游離脯氨酸和可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，各品種蘋果枝條糖組分主要是蔗糖和山梨醇。在-25 ℃低溫脅迫下，龍帥枝條中的葡萄糖和果糖含量大幅度升高，且顯著高于其他品種。在主成分分析綜合評(píng)價(jià)中，抗寒性由強(qiáng)到弱為龍帥＞東光＞寒富＞長(zhǎng)富2 號(hào)，相對(duì)電導(dǎo)率、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性、可溶性蛋白質(zhì)和可溶性糖含量對(duì)蘋果的抗寒性影響較大?！窘Y(jié)論】蘋果1 年生枝中的相對(duì)電導(dǎo)率、SOD活性、可溶性蛋白質(zhì)和可溶性糖含量在眾多生理指標(biāo)中對(duì)低溫脅迫響應(yīng)敏感，可用于雜交后代抗寒優(yōu)系早期快速選擇；龍帥作為寒富的后代抗寒性突出，可在寒地蘋果產(chǎn)區(qū)推廣應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：蘋果；抗寒性；主成分；綜合評(píng)價(jià)

中圖分類號(hào)：S661.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980（2023）04-0669-11

蘋果（Malus domestica）是世界范圍內(nèi)被廣泛種植的溫帶落葉果樹。中國蘋果的栽培面積和產(chǎn)量均位居世界前列，已經(jīng)成為世界蘋果生產(chǎn)第一大國。目前，中國的蘋果產(chǎn)區(qū)已由傳統(tǒng)的渤海灣產(chǎn)區(qū)、西北黃土高原產(chǎn)區(qū)擴(kuò)大到西南冷涼高地、東北和新疆等特色蘋果產(chǎn)區(qū)。傳統(tǒng)蘋果產(chǎn)區(qū)的生長(zhǎng)周期氣候條件適宜，產(chǎn)量和品質(zhì)較高[1-2]；寒地產(chǎn)區(qū)以中小型蘋果為主，風(fēng)味濃郁，受當(dāng)?shù)叵M(fèi)者青睞，區(qū)域經(jīng)濟(jì)特色明顯。東北寒地栽植的寒富等品種抗寒性較強(qiáng)，但是由于全球氣候變暖出現(xiàn)延遲進(jìn)入休眠或休眠期劇烈大幅度變溫，導(dǎo)致抽條、花芽?jī)龊Φ痊F(xiàn)象經(jīng)常發(fā)生[3]。因此，有必要明確能夠反映蘋果抗寒性差異的關(guān)鍵性指標(biāo)，探討用于雜交后代抗寒優(yōu)系快速選擇的可行性方法，這對(duì)于加快優(yōu)異抗寒品種選育、建立適于寒地栽培的技術(shù)體系以及促進(jìn)區(qū)域特色果業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要意義。

露地寒凍法和生理生化指標(biāo)測(cè)試法常用于植物的抗寒性評(píng)價(jià)[4]。其中，露地寒凍法主要根據(jù)植物在低溫下的生長(zhǎng)狀況來評(píng)價(jià)其抗寒性，適用于田間、園林等規(guī)模較大的栽培場(chǎng)地，但是該方法周期較長(zhǎng)且在自然條件下極易受到其他因素的干擾。生理生化指標(biāo)測(cè)試法是將植物或離體器官進(jìn)行人工模擬低溫處理，通過觀察、測(cè)定植物的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化特征變化，并結(jié)合數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析的方式綜合評(píng)價(jià)植物的抗寒性，具有周期短、可重復(fù)性高等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用。閆忠業(yè)等[5]對(duì)6 個(gè)蘋果新品種進(jìn)行抗寒性評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)在?20～?45 ℃的低溫處理下，抗寒性最強(qiáng)的七月鮮1 年生枝條中的丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量低且較穩(wěn)定，過氧化物酶（peroxidase，POD）活性較高。于立洋等[6]通過電導(dǎo)法和電阻抗圖譜法對(duì)8 種新疆野蘋果優(yōu)良無性系的抗寒性展開研究，發(fā)現(xiàn)M-3、M-6 和M-8 抗寒性較高，且具有較低的低溫半致死溫度和高萌芽率。張博等[7]通過主成分分析的研究結(jié)果表明，超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）活性、脯氨酸含量和相對(duì)電導(dǎo)率均可作為評(píng)價(jià)新疆野蘋果抗寒性的主要指標(biāo)。前人研究也發(fā)現(xiàn)，無論是中間砧還是基砧，抗寒性強(qiáng)的砧木具有穩(wěn)定的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，相對(duì)電導(dǎo)率與脅迫溫度之間呈負(fù)相關(guān)，并且可以積累大量的可溶性糖、游離脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，同時(shí)SOD、POD、過氧化氫酶（catalase，CAT）和抗壞血酸過氧化物酶（aseorbateperoxidase，APX）的活性也相對(duì)較高[8-11]。此外，前人也對(duì)桃[12]、梨[13]、軟棗獼猴桃[14]和櫻桃[15]等不同果樹進(jìn)行了抗寒性鑒定。由此可知，用于抗寒性評(píng)價(jià)的指標(biāo)較多，但其在不同品種中表現(xiàn)不一致，不便于直接應(yīng)用。以東光作為母本、富士作為父本選育的寒富蘋果已在遼寧、甘肅、陜西等傳統(tǒng)富士系蘋果栽植區(qū)以北的冷涼地區(qū)形成規(guī)模，栽培面積達(dá)到13.3 萬hm2[16]，以寒富為母本、金紅為父本選育的小果型品種龍帥在黑龍江等多地也有一定的發(fā)展規(guī)模[17]。筆者在本研究中以具有親代遺傳關(guān)系且因抗寒性而呈不同地理區(qū)域分布的蘋果品種東光、長(zhǎng)富2 號(hào)、寒富和龍帥為試材，比較1 年生枝條抗寒性生理指標(biāo)差異，篩選能夠反映親代與子代抗寒性差異的關(guān)鍵指標(biāo)，這對(duì)于雜交育種過程中通過測(cè)定實(shí)生后代與親代之間關(guān)鍵性抗寒指標(biāo)差異、快速選擇優(yōu)系以及針對(duì)性建立寒地栽培技術(shù)體系具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料栽植于沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)果樹栽培與生理生態(tài)團(tuán)隊(duì)科研基地（東經(jīng)123° 34′ ，北緯41°49′）。2019 年進(jìn)入休眠后采集東光、長(zhǎng)富2 號(hào)、寒富、龍帥枝條進(jìn)行沙藏備用，2020 年4 月中旬以單芽枝接的方式，將4 個(gè)品種的接穗高位嫁接（距地面60 cm）于田間4 年生平邑甜茶（Malus hupehensis）（嫁接口平均粗度為3～4 cm）上，生長(zhǎng)期間正常管理。

1.2 試驗(yàn)處理

田間取樣時(shí)期為2021 年1 月15 日，選擇40 根長(zhǎng)勢(shì)良好且均勻的1 年生枝條，并依次用蒸餾水和去離子水沖洗干凈，然后用紗布擦干，在剪口處涂抹菌清后用薄膜包裹，防止失水抽干。將采集的枝條平均分為5 組，每組8 根，分別進(jìn)行-15、-20、-25、-30和-35 ℃冷凍處理，到達(dá)設(shè)定溫度后保持24 h，然后置于4 ℃低溫冰箱中解凍24 h。通過修枝剪將各品種1 年生枝剪成0.5～1 cm的枝段，且避開芽眼，一部分用于測(cè)定相對(duì)電導(dǎo)率，另一部分在液氮中速凍后置于-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于生理生化指標(biāo)的測(cè)定。

1.3 生理指標(biāo)的測(cè)定方法

采用雷茲電導(dǎo)率儀（DDS-307）測(cè)定相對(duì)電導(dǎo)率；MDA含量采用硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）法測(cè)定；利用羥胺氧化的方法測(cè)定O2-含量；利用氯化鈦氧化的方法測(cè)定H2O2含量；用氮藍(lán)四唑光化還原法測(cè)定SOD活性，用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定POD活性，用紫外吸收法測(cè)定CAT 和APX活性；采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定可溶性蛋白質(zhì)含量；采用茚三酮顯色法測(cè)定脯氨酸含量；采用蒽酮比色法測(cè)定可溶性糖含量；用高效液相色譜（high performance liquidchromatography，HPLC）法測(cè)定蔗糖、葡萄糖、果糖和山梨醇含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Microsoft Excel 2010 和GraphPad Prism9.0 軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)并繪圖，采用SPSS Statistics26.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），利用鄧肯檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析（p＜0.05），并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理和主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對(duì)不同品種蘋果枝條膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響

2.1.1 不同溫度處理對(duì)蘋果枝條相對(duì)電導(dǎo)率的影響?如圖1-A所示，隨著溫度的逐漸降低，不同品種枝條相對(duì)電導(dǎo)率呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，變化趨勢(shì)為S 型。其中，在-15 ℃時(shí)，長(zhǎng)富2 號(hào)、寒富和東光枝條的相對(duì)電導(dǎo)率差異不顯著，而龍帥顯著低于其他品種。長(zhǎng)富2 號(hào)的枝條相對(duì)電導(dǎo)率在-25～-35 ℃迅速升高，增幅為7.64%。在-30 ℃時(shí)，長(zhǎng)富2號(hào)和寒富枝條的相對(duì)電導(dǎo)率相差最大，差值為5.75%。在-35 ℃時(shí)，各個(gè)品種枝條的相對(duì)電導(dǎo)率均達(dá)到最大值，長(zhǎng)富2 號(hào)顯著高于其他品種，龍帥與東光枝條的相對(duì)電導(dǎo)率差異不顯著。

2.1.2 不同溫度處理對(duì)蘋果枝條MDA 含量的影響?如圖1-B所示，隨著溫度的降低，各品種枝條的MDA含量不同程度增加。長(zhǎng)富2號(hào)枝條始終保持較高的MDA含量，除了在-25 ℃時(shí)長(zhǎng)富2 號(hào)與寒富枝條中MDA含量差異不顯著外，在其他溫度下長(zhǎng)富2號(hào)枝條中的MDA含量與各品種差異顯著。東光和龍帥枝條中MDA含量較低，在-20、-25、-30 ℃時(shí)兩者枝條中MDA含量無顯著差異，而在-15、-35 ℃時(shí)龍帥枝條中的MDA含量顯著低于東光。

2.2 低溫脅迫對(duì)不同品種蘋果枝條活性氧代謝的影響

2.2.1 不同溫度處理對(duì)蘋果枝條O2.-含量的影響 低溫脅迫下各品種枝條O2.-含量變化如圖2-A 所示。隨著溫度的降低，不同品種枝條中O2.-含量變化趨勢(shì)不同。長(zhǎng)富2 號(hào)和龍帥枝條中的O2.-含量呈升高趨勢(shì)，相比于-15 ℃，在-35 ℃時(shí)兩者分別增加了38.07%和32.03%。而其他品種呈先降低再升高的變化趨勢(shì)，寒富枝條中O2.-含量（w，后同）在-35 ℃時(shí)達(dá)到最大值，為25.8 μg?- 1；而東光枝條中O2.-含量在-30 ℃時(shí)達(dá)到最大值，為24.45 μg?-1。

2.2.2 不同溫度處理對(duì)蘋果枝條H2O2 含量的影響 如圖2-B所示，低溫脅迫下長(zhǎng)富2 號(hào)、寒富和東光枝條中H2O2含量始終高于龍帥。其中，龍帥與長(zhǎng)富2 號(hào)和寒富枝條中H2O2含量的差異均達(dá)到顯著水平。此外，在-15～-25 ℃的低溫處理下，長(zhǎng)富2 號(hào)枝條中H2O2含量先升高后降低，而其他品種均持續(xù)升高；在-30～-35 ℃的低溫處理下，只有龍帥枝條中H2O2含量降低，降幅為3.00%。

2.2.3 不同溫度處理對(duì)蘋果枝條SOD 活性的影響?如圖2-C所示，在-15 ℃時(shí)，不同品種枝條SOD活性雖然存在差異但不顯著。在較低程度的低溫處理下，各品種枝條SOD活性呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，而后隨著低溫脅迫程度的加深，各品種枝條SOD活性降低。在-25～-35 ℃，長(zhǎng)富2 號(hào)枝條SOD活性下降幅度最大，為20.40%；而東光下降幅度最小，為2.30%。

2.2.4 不同溫度處理對(duì)蘋果枝條POD 活性的影響?如圖2-D所示，在-15、-20和-30 ℃時(shí)，寒富枝條POD活性均顯著高于長(zhǎng)富2 號(hào)和東光，然而在-25、-35 ℃時(shí)，各個(gè)品種枝條POD 活性差異不顯著。此外，在-25～-30 ℃的低溫處理下，長(zhǎng)富2 號(hào)和東光枝條POD活性大幅度下降，降幅分別為9.7%和17.42%，而寒富和龍帥枝條POD活性大幅度升高，升幅分別為16.88%和10.97%。

2.2.5 不同溫度處理對(duì)蘋果枝條CAT 活性的影響如圖2-E所示，低溫脅迫下不同品種枝條CAT活性變化趨勢(shì)不同。長(zhǎng)富2號(hào)、東光和寒富均呈先升高后降低的趨勢(shì)，分別在-25、-30和-25 ℃下達(dá)到峰值，而龍帥枝條CAT活性為持續(xù)升高的變化趨勢(shì)，-35 ℃較-15 ℃活性升高了31.3%。此外，除了在-20 ℃時(shí)龍帥與東光枝條CAT活性差異不顯著之外，在其他低溫處理下龍帥枝條CAT活性均顯著高于各個(gè)品種。

2.2.6 不同溫度處理對(duì)蘋果枝條APX 活性的影響?如圖2-F 所示，隨著低溫脅迫程度的加深，4 個(gè)品種的APX活性均在-25 ℃達(dá)到峰值，但變化趨勢(shì)不同。長(zhǎng)富2 號(hào)呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，而東光、寒富和龍帥的變化趨勢(shì)為先降低再升高，最后又降低。各個(gè)品種枝條APX活性均在-35 ℃低溫處理下最低，并且差異不顯著。

2.3 低溫脅迫對(duì)不同品種蘋果枝條滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

2.3.1 不同溫度處理對(duì)蘋果枝條可溶性蛋白質(zhì)含量的影響?如圖3-A所示，在不同的低溫脅迫處理下，各品種枝條可溶性蛋白質(zhì)含量不同。長(zhǎng)富2 號(hào)枝條可溶性蛋白質(zhì)含量始終最低，除了在-30 ℃與寒富枝條可溶性蛋白質(zhì)含量差異不顯著之外，在其余低溫處理下與各品種的差異均達(dá)到顯著水平。此外，隨著溫度的降低，各品種枝條可溶性蛋白質(zhì)含量變化趨勢(shì)不同，龍帥枝條可溶性蛋白質(zhì)含量持續(xù)升高，并在-35 ℃時(shí)達(dá)到最大值，相比于-15 ℃增加了42.24%，積累速度較快。

2.3.2 不同溫度處理對(duì)蘋果枝條游離脯氨酸含量的影響?如圖3-B可所示，在不同的低溫處理下，長(zhǎng)富2號(hào)枝條始終保持較低的游離脯氨酸含量。在-15 ℃時(shí)寒富枝條游離脯氨酸含量最高，為0.28 mg?g-1；而在其他溫度處理下，東光枝條游離脯氨酸含量最高，并且在-35 ℃時(shí)達(dá)到最大值，為0.34 mg?g-1；寒富與東光相比差異性不顯著，為0.31 mg?g-1。

2.3.3 不同溫度處理對(duì)蘋果枝條可溶性糖含量的影響?如圖3-C所示，隨著低溫脅迫程度的加深，長(zhǎng)富2 號(hào)枝條可溶性糖含量始終最低，而龍帥枝條可溶性糖含量最高，并且在-30、-35 ℃時(shí)長(zhǎng)富2 號(hào)和龍帥枝條可溶性糖含量均下降，降幅分別為46.27%和4.11%。寒富與東光枝條可溶性糖含量在-30 ℃時(shí)差異顯著，而在其他溫度處理下差異不顯著。

2.4 低溫脅迫對(duì)不同品種蘋果枝條糖組分含量的影響

本研究中主要測(cè)定了可溶性糖組分中的蔗糖、葡萄糖、果糖和山梨醇含量。低溫脅迫對(duì)不同品種蘋果枝條蔗糖含量的影響如圖4-A所示。隨著溫度的降低，龍帥枝條蔗糖含量持續(xù)升高，并在-35 ℃時(shí)達(dá)到最大值，為21.46 mg· g-1，而4 個(gè)品種枝條蔗糖含量差異不顯著。在-30～-35 ℃時(shí)，寒富枝條蔗糖含量下降3.88%，而長(zhǎng)富2 號(hào)、東光和龍帥枝條蔗糖含量分別升高3.18%、9.51%和4.23%。葡萄糖和果糖含量的變化如圖4-B～C 所示，在-25 ℃時(shí)龍帥枝條葡萄糖和果糖含量急速升高，增幅分別為21.94%和52.5%，此后隨著低溫脅迫程度的加深，葡萄糖含量下降，而果糖含量變化平穩(wěn)。在低溫脅迫下，不同品種蘋果枝條山梨醇含量變化趨勢(shì)較為平穩(wěn)，在-25、-30 ℃時(shí)各品種枝條山梨醇含量差異不顯著，但是相比于其他品種，在各個(gè)溫度下龍帥枝條山梨醇含量相對(duì)較高，如圖4-D 所示。此外，低溫脅迫下各品種蘋果枝條糖組分含量主要是蔗糖和山梨醇，而葡萄糖和果糖較少。

2.5 不同蘋果品種抗寒性的綜合評(píng)價(jià)v2.5.1 低溫脅迫對(duì)不同蘋果品種各指標(biāo)的主成分因子得分分析?在本研究中，通過SPSS 對(duì)-35 ℃低溫處理的各項(xiàng)抗逆生理生化指標(biāo)進(jìn)行主成分因子分析，得到主成分特征值。如表1 所示，有2 個(gè)大于1的主成分，并且解釋了全部方差的96.136%，說明提取的2 個(gè)主成分能夠代表11 個(gè)指標(biāo)信息的96.136%，所提取的主成分評(píng)價(jià)不同蘋果品種的抗寒性有一定的合理性。同時(shí)由表2 可知，主成分1 主要反映相對(duì)電導(dǎo)率、MDA含量、H2O2含量、O2.-含量、SOD活性、POD活性、CAT 活性、APX活性、可溶性蛋白含量和可溶性糖含量10 個(gè)變量的信息。其中，系數(shù)絕對(duì)值前4 位是SOD活性（0.991）、可溶性蛋白質(zhì)含量（0.989）、可溶性糖含量（0.986）和相對(duì)電導(dǎo)率（-0.986），主成分2主要反映游離脯氨酸含量的信息。2.5.2 不同蘋果品種綜合抗寒性評(píng)價(jià)通過SPSS將標(biāo)準(zhǔn)化的原始數(shù)據(jù)代入主成分表達(dá)式計(jì)算不同蘋果品種的主成分得分，進(jìn)而得出各個(gè)蘋果品種的綜合得分，分值越高則抗寒性越強(qiáng)。如表3 所示，各蘋果品種抗寒性由高到低為龍帥＞東光＞寒富＞長(zhǎng)富2 號(hào)。

3 討論

冬季低溫是影響蘋果栽培區(qū)劃的最主要環(huán)境因素。在休眠期間，長(zhǎng)期的極低溫度及早春的大幅度變溫容易導(dǎo)致蘋果發(fā)生凍害，培育抗寒品種及采取配套栽培技術(shù)體系是應(yīng)對(duì)上述問題的主要策略，其前提條件是做好品種、品系的抗寒性評(píng)價(jià)工作。

3.1 低溫脅迫與膜穩(wěn)定性的關(guān)系

植物生物膜是感受低溫的主要組織部位，同時(shí)也極易受到低溫脅迫的傷害。在低溫脅迫下生物膜的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化，膜透性增大，選擇透過性的作用降低，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)溶物外滲，細(xì)胞失水且膨壓降低，嚴(yán)重時(shí)植株死亡[18]。前人研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)電導(dǎo)率可以反映細(xì)胞膜透性的變化，并作為抗寒性評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)已在冬油菜[19]、西瓜[20]、蘋果[21]、梨[22]、棗[23]、葡萄[24]和柑橘[25]等植物上廣泛應(yīng)用。其中，由于不同植物的組織結(jié)構(gòu)和脅迫作用機(jī)制不同，其低溫處理下的相對(duì)電導(dǎo)率的變化范圍也有很大的差異。在本研究中，抗寒性最強(qiáng)的龍帥相對(duì)電導(dǎo)率在不同低溫處理下均低于其他品種，其變化范圍為47.48%～54.39%，且變化趨勢(shì)較為平緩；而抗寒性弱的長(zhǎng)富2號(hào)相對(duì)電導(dǎo)率較高，并且在-25～-35 ℃時(shí)急劇升高，說明其在-25 ℃處理時(shí)細(xì)胞膜便開始損害嚴(yán)重，穩(wěn)定性差。曹曉敏等[26]對(duì)6 個(gè)蘋果砧木進(jìn)行抗寒性評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)，抗寒性強(qiáng)的煙砧6 號(hào)在-35 ℃時(shí)的相對(duì)電導(dǎo)率為46.53%，而抗寒性弱的M9 的相對(duì)電導(dǎo)率為61.39%，此時(shí)M9 的萌芽率僅為20.41%，顯著低于煙砧6 號(hào)，由此可知相對(duì)電導(dǎo)率與枝條萌芽率呈負(fù)相關(guān)。MDA是膜脂過氧化的產(chǎn)物，其含量可以作為生物膜系統(tǒng)損傷程度的評(píng)價(jià)指標(biāo)。劉興祿等[27]發(fā)現(xiàn)在低溫處理下，抗寒性弱的M26 和T337 蘋果砧木MDA含量變化幅度大，且MDA含量相比于抗寒性強(qiáng)的SH1 較高。本試驗(yàn)結(jié)果與之一致，即抗寒性越強(qiáng)的品種，MDA含量越低，而抗寒性弱的長(zhǎng)富2 號(hào)枝條MDA含量始終高于其他品種。由此說明，相對(duì)電導(dǎo)率越高，細(xì)胞膜損害程度越深，MDA含量越高，則抗寒性越弱。

3.2 低溫脅迫與抗氧化系統(tǒng)的關(guān)系

當(dāng)植物受到低溫等非生物脅迫時(shí)，體內(nèi)活性氧含量的動(dòng)態(tài)平衡會(huì)被打破，從而積累大量的超氧陰離子等活性氧自由基，影響細(xì)胞膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性，降低蛋白質(zhì)活性，最終導(dǎo)致植物代謝過程紊亂[28]。其中，SOD、POD、CAT和APX是植物體內(nèi)重要的抗氧化酶，屬于酶促抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分，能夠清除活性氧自由基，維持活性氧含量的動(dòng)態(tài)平衡，保證植物正常的生命活動(dòng)，進(jìn)而增強(qiáng)植物的抗寒性[29]。田景花等[30]探究低溫逆境對(duì)不同核桃品種抗氧化系統(tǒng)的影響，發(fā)現(xiàn)抗寒性強(qiáng)的哈特雷葉片中O2.-含量最低，葉片沒有明顯的冷害癥狀。在本研究中，雖然隨著溫度的降低，各品種O2.-含量總體上呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，但是比較分析可知，抗寒性更強(qiáng)的龍帥升高幅度較小。此外，在-35 ℃低溫處理下，龍帥枝條中H2O2含量變化趨勢(shì)與各品種相反，呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，這可能與龍帥枝條中的POD 和CAT 活性升高有關(guān)。

SOD是植物酶促抗氧化系統(tǒng)的第一道防線，能將O2.-轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O2和O2，產(chǎn)生的過氧化氫會(huì)被POD、CAT、APX 協(xié)同清除，進(jìn)而維持活性氧平衡[31]。范宗民等[32]在葡萄砧木的抗寒性研究中發(fā)現(xiàn)，SOD、POD和CAT 活性變化趨勢(shì)不同，隨著溫度的降低，SOD 活性不穩(wěn)定，呈現(xiàn)M型的變化趨勢(shì)，POD活性則先升高后下降，而CAT 活性持續(xù)升高，進(jìn)而清除細(xì)胞內(nèi)過量的活性氧，保證細(xì)胞代謝穩(wěn)定。孟詩原等[33]探究衛(wèi)矛屬植物對(duì)低溫脅迫的生理響應(yīng)，指出抗寒性強(qiáng)的植物具有較高的抗氧化酶活性。本研究結(jié)果表明，隨著低溫脅迫程度的加深，抗寒性強(qiáng)的龍帥SOD 活性顯著高于其他品種，CAT 活性持續(xù)升高，對(duì)低溫響應(yīng)劇烈，然而對(duì)于POD 和APX 而言，在-35 ℃ 時(shí)4 個(gè)品種的酶活性差異不顯著，并且APX 活性在-35 ℃時(shí)大幅度下降，這與趙一航等[34]對(duì)紫花苜蓿的研究結(jié)果相似，分析認(rèn)為當(dāng)溫度降低至植物承受的最低溫度時(shí)，抗氧化酶活性會(huì)受到抑制，不再隨著溫度的降低而發(fā)生改變，也就是植物抗氧化酶活性在閾值內(nèi)外存在差異。

3.3 低溫脅迫與滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的關(guān)系

可溶性蛋白質(zhì)、游離脯氨酸和可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)是植物響應(yīng)非生物脅迫的重要物質(zhì)，含量的積累與抗寒性呈顯著正相關(guān)[35-37]。李清亞等[38]在豆梨響應(yīng)低溫脅迫的研究中發(fā)現(xiàn)，抗寒性強(qiáng)的克利夫蘭在較低溫度下能夠積累更多的可溶性蛋白質(zhì)，本試驗(yàn)結(jié)果與之一致。筆者研究發(fā)現(xiàn)，抗寒性弱的長(zhǎng)富2 號(hào)枝條中可溶性蛋白質(zhì)含量低，而抗寒性強(qiáng)的龍帥枝條可溶性蛋白質(zhì)含量隨著溫度的降低而持續(xù)升高，高水平的可溶性蛋白質(zhì)含量能夠增強(qiáng)細(xì)胞的持水能力，降低細(xì)胞冰點(diǎn)，并且低溫誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗凍蛋白與植物的抗寒性密切相關(guān)[39]。因此，推測(cè)可溶性蛋白質(zhì)含量的差異直接影響品種的抗寒性。游離脯氨酸能夠維持生物膜和酶蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，而且作為非酶促抗氧化物質(zhì)清除逆境下大量生成的活性氧，增強(qiáng)植物的抗寒性[40]。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)游離脯氨酸含量與蘋果的抗寒性呈正相關(guān)，即枝條游離脯氨酸含量越高，抗寒性越強(qiáng)，這與郭艷蘭等[41]對(duì)6 個(gè)葡萄砧木品種抗寒性評(píng)價(jià)的研究結(jié)果一致?？扇苄蕴堑姆e累可以提高胞液濃度，增強(qiáng)保水能力，防止低溫下胞間結(jié)冰，并增強(qiáng)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，同時(shí)也可以參與活性氧的清除[42]。劉勝元等[43]對(duì)不同花椒的抗寒性研究發(fā)現(xiàn)，低溫處理下積累的可溶性糖含量與抗寒性呈正相關(guān)。在本研究中，抗寒性弱的長(zhǎng)富2 號(hào)枝條可溶性糖含量始終低于其他品種，并在-35 ℃大幅下降，低溫脅迫下積累較少的可溶性糖含量可能是長(zhǎng)富2 號(hào)抗寒性弱的原因之一。此外，本研究還分析了不同品種枝條中蔗糖、果糖、葡萄糖和山梨醇含量在低溫下的積累狀況，試驗(yàn)結(jié)果表明，蔗糖和山梨醇含量在各品種中較高，且變化較為平穩(wěn)。但是，在-25 ℃時(shí)，龍帥枝條中的葡萄糖和果糖含量大幅度升高，并顯著高于其他品種，而后隨著低溫脅迫程度的加深，葡萄糖含量輕微下降，而果糖含量變化平穩(wěn)。因此，較高含量的葡萄糖和果糖可能是龍帥具有抗寒性的原因之一。這與Zhao 等[44]發(fā)現(xiàn)抗寒性強(qiáng)的山葡萄在越冬期間積累大量的葡萄糖和果糖的結(jié)果一致。

4 結(jié)論

根據(jù)綜合得分評(píng)價(jià)各蘋果品種抗寒性為龍帥＞東光＞寒富＞長(zhǎng)富2 號(hào)。分析發(fā)現(xiàn)相對(duì)電導(dǎo)率、SOD活性、可溶性蛋白質(zhì)和可溶性糖含量對(duì)低溫脅迫響應(yīng)敏感，這些指標(biāo)可用于雜交后代抗寒優(yōu)系早期快速選擇。龍帥作為寒富的后代抗寒性突出，可在寒地蘋果產(chǎn)區(qū)推廣應(yīng)用。

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