龔麗莎 向芷萱 王照 魯敏 安華明

摘要：【目的】CDPKs是植物中廣泛存在的Ca2+感受器，鑒定刺梨（Rosa roxburghii Tratt.）CDPK基因家族成員，并探索其對(duì)不同供鈣水平的表達(dá)響應(yīng)?！痉椒ā坎捎蒙镄畔W(xué)方法鑒定并分析RrCDPK基因家族，通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qRT-PCR）分析其組織表達(dá)特異性及在不同供鈣水平下的表達(dá)響應(yīng)。【結(jié)果】從刺梨基因組中共鑒定出16 個(gè)具絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶和EF-hand 結(jié)構(gòu)域的CDPK基因（命名為RrCDPK1～16），結(jié)構(gòu)分析顯示蛋白長(zhǎng)度在393～561 aa 之間，分子質(zhì)量在44.02～62.98 ku 之間，平均等電點(diǎn)6.05；家族基因結(jié)構(gòu)差別較大，外顯子數(shù)量為2～10 個(gè)，包括6 個(gè)保守基序；亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)RrCDPKs在細(xì)胞核和多種細(xì)胞器均有定位，主要定位于細(xì)胞質(zhì)；進(jìn)化分析可分為4 個(gè)亞族，且與草莓的親緣關(guān)系最近，其次是蘋果，較遠(yuǎn)為擬南芥和水稻。啟動(dòng)子順式作用元件分析表明，RrCDPKs大多含光響應(yīng)元件、多種激素響應(yīng)元件及脅迫響應(yīng)元件等。不同器官及果實(shí)發(fā)育時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示RrCDPKs 具有時(shí)空表達(dá)特異性。RrCDPKs 對(duì)供鈣水平的響應(yīng)表明，相比無鈣處理，0.5 mmol·L-1鈣水平下RrCDPK1/2/4/8 表達(dá)顯著上調(diào)，2 mmol·L-1鈣水平下RrCDPK2/4/9/10/12 表達(dá)顯著上調(diào)；RrCDPKs在葉和根中對(duì)供鈣水平及處理時(shí)間的表達(dá)響應(yīng)也不盡相同。【結(jié)論】共鑒定出16 個(gè)RrCDPK基因，在刺梨中的表達(dá)具時(shí)空特異性，且在應(yīng)對(duì)不同供鈣水平時(shí)發(fā)揮的作用不盡相同。研究結(jié)果可為深入揭示刺梨CDPK基因家族的功能及其對(duì)外界鈣水平的響應(yīng)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：刺梨；鈣依賴性蛋白激酶；供鈣水平

中圖分類號(hào)：S661.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980（2023）04-0639-14

鈣離子（Ca2+）作為第二信使，參與植物體內(nèi)許多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[1]。各種生物和非生物脅迫在內(nèi)的外部刺激均會(huì)導(dǎo)致胞質(zhì)內(nèi)的游離Ca2+濃度發(fā)生改變，而被鈣結(jié)合蛋白或鈣信號(hào)傳感器識(shí)別，從而導(dǎo)致下游表達(dá)事件的發(fā)生[2-3]。鈣依賴性蛋白激酶（calcium-dependent protein kinases，CDPKs/CPKs）作為植物中主要的Ca2+感受器之一[4]，可不依賴于鈣調(diào)素而經(jīng)EF-hand 直接與Ca2+結(jié)合，感受Ca2+濃度變化后，蛋白激酶活性恢復(fù)，將Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)為磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，這使得CDPK 具有Ca2+傳感器和應(yīng)答器的雙重功能而被廣泛研究[5-7]。

CDPKs/CPKs是植物和一些原生生物特有的一類絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr）型蛋白激酶，以其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)而聞名[8]，具有N 端可變域、Ser/Thr 蛋白激酶域、自抑制連接域和C 端具有EF-hand 結(jié)構(gòu)的類鈣調(diào)素調(diào)控域這4 個(gè)典型的結(jié)構(gòu)域[9]。目前已在多種植物中鑒定出CDPK基因，且不同物種中CDPK基因數(shù)量差異較大，如模式植物擬南芥[Arabidopsisthaliana（L.）Heynh.]中有34 個(gè)[10]，水稻（Oryza sativaL.）中有31 個(gè)[11-12]，對(duì)萼獼猴桃（Actinidia valvataDunn.）[13]、玉米（Zea mays L.）[14]、番茄（Solanum lycopersicumL.）[15]、黃瓜（Cucumis sativus L.）[16]、天藍(lán)苜蓿（Medicago lupulina L.）[17]中分別有63、40、29、17、10 個(gè)。CDPK廣泛分布于植物體中，在植物生長(zhǎng)發(fā)育和形態(tài)建成、生物及非生物脅迫應(yīng)對(duì)中發(fā)揮著重要作用，且此過程也離不開Ca2+的調(diào)控[9]。如黃玉婷[18]發(fā)現(xiàn)外源Ca2+處理能使CDPK基因大幅上調(diào)表達(dá)而提高茶樹低溫耐受力；CDPK 與Ca2+結(jié)合后活性被激發(fā)，從而調(diào)控玉米熱激蛋白的表達(dá)來提高耐性[19]；GsCPK16 可通過響應(yīng)溫度和光刺激而被提高的細(xì)胞溶質(zhì)Ca2+水平激活，從而調(diào)節(jié)龍膽花的重新開放[20]。

刺梨（Rosa roxburghii Tratt.）屬薔薇科植物，是西南地區(qū)的特色樹種之一，在土壤交換性鈣含量（w）463～4526 mg · kg- 1 的貴州喀斯特地區(qū)生長(zhǎng)良好[21]。目前，刺梨全基因組測(cè)序已完成，但關(guān)于刺梨CDPK基因家族的分析及其對(duì)供鈣水平的響應(yīng)尚未見報(bào)道。本研究基于全基因組水平通過生物信息學(xué)方法，鑒定和分析刺梨CDPK基因家族特征和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、啟動(dòng)子順式作用元件，分析該家族的時(shí)空表達(dá)特性，并研究刺梨CDPK基因家族成員對(duì)不同供鈣水平的響應(yīng)，為后續(xù)探明CDPK家族在刺梨中對(duì)外界鈣環(huán)境的響應(yīng)機(jī)制提供相關(guān)信息。

1 材料和方法

1.1 材料

本試驗(yàn)于2021 年4 月在貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院刺梨資源圃中選取長(zhǎng)勢(shì)基本一致的刺梨貴農(nóng)5 號(hào)（R. roxburghiiTratt.‘Guinong 5）扦插苗，先用自來水沖洗除去根部泥土，再用蒸餾水培養(yǎng)，而后使用1/8 改良的Hoagland and Aron 完全營養(yǎng)液進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，每3 d更換1 次營養(yǎng)液，將水培刺梨苗置于人工氣候室內(nèi)培養(yǎng)。用去離子水將預(yù)培養(yǎng)2 個(gè)月刺梨扦插苗的根和葉沖洗干凈后饑餓24 h，轉(zhuǎn)入以下3 種不同供鈣水平的營養(yǎng)液中。經(jīng)文獻(xiàn)查找及一系列預(yù)試驗(yàn)篩選，最終試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)Ca2+濃度梯度：0、0.5、2 mmol·L-1，分別配制成無鈣、低濃度鈣及高濃度鈣的營養(yǎng)液，并在培養(yǎng)0、1、7 d 后取其水培根和葉，經(jīng)液氮處理后保存于-80 ℃?zhèn)溆?。各處理? 次生物學(xué)重復(fù)。在保持其他營養(yǎng)元素濃度不變的條件下，去掉營養(yǎng)液中所有含鈣成分，由醋酸鈣供鈣，并用40 mg · L- 1NH4NO3 補(bǔ)齊氮素差異。試驗(yàn)中所用營養(yǎng)液均用0.1 mol·L-1 NaOH和H2SO4調(diào)整pH 值為6.5，培養(yǎng)溫度20 ℃。

1.2 方法

1.2.1 刺梨CDPK基因家族成員的鑒定以及染色體定位、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和亞細(xì)胞定位分析?從NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）下載刺梨基因組文件，在Tair 數(shù)據(jù)庫（https：//www.arabidopsis.org/）下載擬南芥CDPK 家族的蛋白序列，運(yùn)用TBtoolsv1.098696 進(jìn)行本地Blast 比對(duì)（E-value ＜ 1×10-5），取bit score > 100 的結(jié)果，隨后將得到的序列在NCBI中進(jìn)行Protein Blast，結(jié)合SMART（http：//smart.embl- heidelberg.de/）及Pfam 數(shù)據(jù)庫（https：//pfam.xfam.org/），以CDPK 蛋白典型結(jié)構(gòu)域Ser/Thr 蛋白激酶區(qū)（Pfam 數(shù)據(jù)庫ID：PF00069）以及EF-手型結(jié)構(gòu)區(qū)（PF13499）進(jìn)行篩選，刪除重復(fù)值及不含上述結(jié)構(gòu)域的序列，進(jìn)而得到刺梨CDPK基因家族的成員。在刺梨基因組注釋信息GFF 文件中提取出RrCDPK基因染色體位置信息，并利用TBtools軟件[22]繪圖。根據(jù)RrCDPK在染色體上的排列順序，依次對(duì)其命名。利用在線工具ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam/）對(duì)RrCDPK蛋白的分子質(zhì)量、等電點(diǎn)等進(jìn)行分析。利用WoLF PSORT 網(wǎng)站（https：//wolfpsort.hgc.jp）預(yù)測(cè)RrCDPK蛋白的亞細(xì)胞定位信息。

1.2.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建及基因結(jié)構(gòu)、保守基序和保守結(jié)構(gòu)域分析?從Swiss- Prot（https：//www.uniprot.org/）及NCBI 數(shù)據(jù)庫下載水稻CDPK家族蛋白文件[11-12]，從Tair 數(shù)據(jù)庫下載擬南芥CDPK家族蛋白文件[10]；從GDR數(shù)據(jù)庫（https：//www.rosaceae.org）下載蘋果和草莓蛋白序列，依據(jù)上述方法得到蘋果及草莓的CDPK家族蛋白文件。使用MEGA7 軟件對(duì)水稻、擬南芥、蘋果、草莓及刺梨的CDPK家族進(jìn)行Muscle 多序列比對(duì)，采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，bootstrap 值設(shè)置為1000。使用iTOL在線工具（https：//itol.embl.de）進(jìn)行美化。使用MEME 在線工具（https：//meme- suite.org/meme/index.html）預(yù)測(cè)其蛋白序列的保守基序；通過NCBI-CDD進(jìn)行RrCDPK家族保守結(jié)構(gòu)域信息分析；根據(jù)RrCDPK家族GFF文件分析內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)；最終使用TBtools進(jìn)行可視化。

1.2.3 啟動(dòng)子順式作用元件分析?利用TBtools工具從刺梨基因組中提取出RrCDPK 編碼序列的啟動(dòng)子上游2000 bp序列，使用在線數(shù)據(jù)庫plantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預(yù)測(cè)其順式作用元件。

1.2.4 刺梨不同組織及不同果實(shí)發(fā)育時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組分析?從刺梨轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[23-24]中提取出RrCDPK 基因家族在刺梨不同組織及果實(shí)發(fā)育時(shí)期的表達(dá)數(shù)據(jù)，采用TBtools軟件繪制熱圖并進(jìn)行聚類分析。1.2.5 qRT- PCR 分析使用Primer blast（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer blast）設(shè)計(jì)qRTPCR引物，由生工生物工程股份有限公司（上海）合成（表1）。取不同供鈣水平處理的刺梨苗葉和根，用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit 總RNA提取試劑盒（大連寶生物工程有限公司）提取總RNA，純化的RNA 用TaKaRa RNA PCR KitVer.2.1 試劑盒（大連寶生物工程有限公司）合成cDNA。使用ABI ViiA7 熒光定量PCR儀（杭州博日科技有限公司）進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μL：2 μLcDNA、各0.8 μL 上下游引物、6 μL 滅菌水、10 μLTB Green Premix ExTaq Ⅱ（Tli RNaseH Plus）（2×）（大連寶生物工程有限公司）和0.4 μL ROX ReferenceDye Ⅱ，以UBQ為內(nèi)參基因校正表達(dá)量[24]。采用2?ΔΔCT法[25]分析數(shù)據(jù)。所測(cè)基因表達(dá)量為其相對(duì)表達(dá)水平，以RrCDPK 測(cè)定值/UBQ測(cè)定值表示，每個(gè)數(shù)據(jù)3 次重復(fù)，并取其平均值。1.2.6 數(shù)據(jù)處理各處理設(shè)置3 次生物學(xué)重復(fù)、3 次技術(shù)重復(fù)。使用SPSS 26 軟件進(jìn)行方差分析，用Duncan 法進(jìn)行差異顯著性分析。使用WPS進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 刺梨CDPK 基因家族成員的鑒定及基本特征分析

通過與34 個(gè)AtCDPK 基因的蛋白序列進(jìn)行比對(duì)及保守結(jié)構(gòu)域篩選，共鑒定出16 個(gè)RrCDPK基因家族成員，并基于其染色體定位（圖1），依次命名為RrCDPK1～16。16 個(gè)RrCDPK基因不均等地分布在刺梨的6 條染色體上，4 號(hào)染色體沒有成員定位，而1號(hào)和7 號(hào)染色體上數(shù)量最多，為4 個(gè)。RrCDPKs 為親水性蛋白，基因長(zhǎng)度在1496（RrCDPK6）～5524（RrCDPK14）bp 之間，編碼蛋白質(zhì)長(zhǎng)度在393（RrCDPK6）～561（RrCDPK16）aa，蛋白分子質(zhì)量介于44.02（RrCDPK6）～62.98（RrCDPK16）ku 之間，各成員的蛋白長(zhǎng)度及分子質(zhì)量差異較?。怀齊rCDPK5/8 為堿性蛋白外，其余成員的蛋白等電點(diǎn)都小于7，為酸性蛋白；RrCDPK1/4/11/12/14/15 屬于不穩(wěn)定蛋白，其他RrCDPK 成員均為穩(wěn)定蛋白（表2）。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果（表3）顯示，RrCDPKs 在細(xì)胞核、細(xì)胞骨架、細(xì)胞膜和多種細(xì)胞器中均有定位，主要定位在細(xì)胞質(zhì)中。

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化及結(jié)構(gòu)特征分析

為研究刺梨CDPK蛋白家族的進(jìn)化關(guān)系，以擬南芥、水稻、草莓和蘋果的CDPK蛋白序列為參考進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建，其中草莓及蘋果的CDPK家族是通過與RrCDPK 家族同樣的鑒定方式，分別得到36 和34 個(gè)成員。聚類結(jié)果顯示，RrCDPK家族可分為4 個(gè)亞家族（圖2）。亞家族Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中均有5個(gè)RrCDPK 成員，分別為RrCDPK6/10/11/14/15、RrCDPK1/3/4/7/12、RrCDPK2/8/9/13/16，而亞家族Ⅳ中僅包括1 個(gè)RrCDPK5 成員。進(jìn)一步觀察可知，與刺梨CDPK家族親緣關(guān)系最近的是草莓，其次是蘋果，較遠(yuǎn)的是擬南芥和水稻。

為了更直觀地了解刺梨CDPK基因家族成員的結(jié)構(gòu)特征，分析了刺梨該家族的基因結(jié)構(gòu)、保守基序和保守結(jié)構(gòu)域（圖3），結(jié)果表明，同一亞家族的成員基因結(jié)構(gòu)較為相似，外顯子數(shù)量為2～10 個(gè)，其中RrCDPK6 最少（2 個(gè)），RrCDPK5 最多（10 個(gè)）。刺梨CDPK家族成員都含有2 個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域[Pkinase（即Ser/Thr 蛋白激酶）和EF-hand 結(jié)構(gòu)域]，以及6 個(gè)保守基序（motif），且親緣關(guān)系越近的成員，結(jié)構(gòu)域及基序的數(shù)量和排列也越相似。

2.3 啟動(dòng)子順式作用元件分析

基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件影響基因的表達(dá)模式。為了解RrCDPK基因家族成員的啟動(dòng)子序列功能，對(duì)啟動(dòng)子上游2000 bp 序列進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖4 所示。RrCDPKs上游均具有大量的基本起始元件CAAT-box 和TATA-box，功能分別為啟動(dòng)子和增強(qiáng)子元件、核心啟動(dòng)子元件，符合真核生物特點(diǎn)。除RrCDPK16 啟動(dòng)子不含光響應(yīng)元件外，其余成員啟動(dòng)子都含有或多或少的光響應(yīng)元件，表明在光響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。生長(zhǎng)素（auxin，IAA）、赤霉素（gibberellin，GA）、水楊酸（salicylic acid，SA）、脫落酸（abscisic acid，ABA）以及茉莉酸甲酯（methyljasmonate，MeJA）5 種激素響應(yīng)元件在RrCDPKs 啟動(dòng)子區(qū)普遍存在但又有差異，僅RrCDPK1/2/3/8/9/11/12 啟動(dòng)子區(qū)有生長(zhǎng)素響應(yīng)元件，而RrCDPK2/3/4/6/7/8/14、6/11/16、10/13 啟動(dòng)子區(qū)分別不存在水楊酸、脫落酸及赤霉素響應(yīng)元件。RrCDPKs 還含有4種脅迫應(yīng)答元件：防御和壓力脅迫、低溫脅迫、厭氧誘導(dǎo)及缺氧特異性誘導(dǎo)的應(yīng)答元件。尤為突出的是，僅RrCDPK6/13 啟動(dòng)子無厭氧誘導(dǎo)應(yīng)答元件，RrCDPK1 啟動(dòng)子具有缺氧特異性誘導(dǎo)有關(guān)的類增強(qiáng)子元件。RrCDPKs還含有轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)：干旱誘導(dǎo)有關(guān)（不含RrCDPK1/6/8/10/16）、參與黃酮類生物合成基因調(diào)控（RrCDPK1/11）、光響應(yīng)（RrCDPK1/4/9/15/16）的MYB結(jié)合位點(diǎn)。此外，RrCDPKs含有多種與植物生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的應(yīng)答元件，其中光敏色素下調(diào)表達(dá)、種子特異性調(diào)節(jié)、參與胚乳表達(dá)的應(yīng)答元件分別為RrCDPK7、RrCDPK3、RrCDPK3/4啟動(dòng)子所特有。匯總可知，RrCDPK15 啟動(dòng)子含有的順式作用元件種類及數(shù)目均相對(duì)較多，暗示較其他成員可能參與更多的生長(zhǎng)發(fā)育過程。

2.4RrCDPKs的時(shí)空表達(dá)特點(diǎn)

為了解刺梨CDPK基因家族成員的時(shí)空表達(dá)特點(diǎn)，繪制了RrCDPKs在刺梨不同組織（莖、葉、花、30 d的果實(shí)）和果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期（花后30、60、90 d）的表達(dá)模式熱圖。由圖5-A可知，RrCDPKs 在刺梨不同組織中有明顯的表達(dá)差異：RrCDPK2/6/16 在花中高表達(dá)，RrCDPK3/5/10/13 在莖中高表達(dá)，RrCDPK11/12 在果中高表達(dá)，RrCDPK4/8/9/15 在葉中高表達(dá)，RrCDPK1/7/14 在所測(cè)組織中的表達(dá)量均不高。由圖5-B 可知，RrCDPK1/10/12/14 在果實(shí)發(fā)育前期表達(dá)量最高，中后期表達(dá)下調(diào)；僅RrCDPK7 在果實(shí)發(fā)育中期表達(dá)量最高；RrCDPK2/8/11/15 的表達(dá)隨果實(shí)的發(fā)育而不斷上調(diào)，以至在后期表達(dá)最高；RrCDPK3/4/5/13/16 在果實(shí)發(fā)育前期和果實(shí)膨大期的表達(dá)量都較高；僅RrCDPK6/9 除在果實(shí)發(fā)育中期表達(dá)下調(diào)，其余兩個(gè)時(shí)期表達(dá)量都稍高。

以上結(jié)果表明，刺梨RrCDPK 基因的表達(dá)具有時(shí)空表達(dá)特異性，在不同組織器官和刺梨果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期發(fā)揮著重要的作用。

2.5RrCDPKs對(duì)不同供鈣水平的響應(yīng)

筆者在本試驗(yàn)中探索了所有刺梨RrCDPK基因家族對(duì)供鈣水平的響應(yīng)，結(jié)果如圖6所示，以0 mmol·L-1鈣處理為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)供鈣后，少數(shù)RrCDPKs 表現(xiàn)出明顯的上調(diào)效應(yīng)：0.5 mmol·L-1鈣水平下，培養(yǎng)1 d后，葉中2 個(gè)基因（RrCDPK4/8）表達(dá)量顯著提高（p＜0.05），培養(yǎng)7 d 后，根中2 個(gè)基因（RrCDPK1/2）表達(dá)量顯著提高；2 mmol·L-1鈣水平下，培養(yǎng)1 d 后，葉中3 個(gè)基因（RrCDPK4/10/12）、根中RrCDPK9 表達(dá)量顯著提高，培養(yǎng)7 d 后，葉中RrCDPK9、根中RrCDPK2 表達(dá)量顯著提高。表明這些基因在應(yīng)對(duì)不同供鈣水平時(shí)發(fā)揮了重要作用。此外，RrCDPKs對(duì)鈣水平的響應(yīng)隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸發(fā)生變化，如隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，RrCDPK3 在葉中的上調(diào)表達(dá)效應(yīng)增強(qiáng)，而RrCDPK5/7 在葉中的上調(diào)表達(dá)效應(yīng)減弱，RrCDPK13/15/16 在根中的上調(diào)表達(dá)效應(yīng)增強(qiáng)，而RrCDPK6/10/11/12/14 在根中的上調(diào)效應(yīng)減弱，說明在不同階段響應(yīng)鈣水平的RrCDPKs 基因不同；且比較各基因在2 種組織中的相對(duì)表達(dá)量可知，RrCDPKs 在葉和根中對(duì)鈣水平的敏感性不同，特別是RrCDPK6/16 在葉中低表達(dá)，與圖5-A 的表達(dá)模式吻合。

3 討論

鈣依賴性蛋白激酶（CDPKs）作為植物中廣泛存在的一類絲氨酸/蘇氨酸型蛋白激酶，具有Ca2+傳感器和應(yīng)答器的雙重功能，可調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育并誘導(dǎo)對(duì)環(huán)境脅迫的保護(hù)性反應(yīng)[5-6]。其由多基因家族編碼，首次被Hetherington 等[26]發(fā)現(xiàn)于豌豆（Pisumsativum）中，迄今已在多種植物中被鑒定。筆者在本研究中通過生物信息學(xué)方法，在刺梨基因組中鑒定出16 個(gè)RrCDPKs 成員。本研究中亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)RrCDPKs 表現(xiàn)出多樣化亞細(xì)胞分布，包括細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、細(xì)胞骨架、細(xì)胞膜和多種細(xì)胞器，與Harper 等[27]的研究一致。此外，有證據(jù)表明一些CDPK基因可以改變位置以響應(yīng)壓力，如在冰植物（Mesembryanthemum crystallinum）葉中表達(dá)的Mc-CPK1 的異構(gòu)體顯示出從質(zhì)膜到細(xì)胞核定位的明顯轉(zhuǎn)變，以應(yīng)對(duì)鹽脅迫或脫水脅迫[28]。本研究顯示RrCDPKs的內(nèi)含子數(shù)目較多，除RrCDPK6 僅1 個(gè)內(nèi)含子外，其他成員均含5個(gè)內(nèi)含子以上。趙娟等[29]發(fā)現(xiàn)，更多內(nèi)含子的存在可能會(huì)通過可變剪接和外顯子重排而增加CDPK基因的功能多樣性。因此推測(cè)亞細(xì)胞分布的多樣性及較多的內(nèi)含子數(shù)目會(huì)使RrCDPKs功能增多。CDPK有4 個(gè)典型的結(jié)構(gòu)域，保守的激酶結(jié)構(gòu)域是Ser/Thr蛋白激酶的典型特征[30]。鈣傳感器主要依賴于Ca2+與EF-hand 基序的結(jié)合，該基序高度保守，且蛋白質(zhì)中EF-hand基序?qū)Φ拇嬖谀軌蛟鰪?qiáng)對(duì)鈣的穩(wěn)定性和親和力[31]。本研究表明RrCDPKs都含有2個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域：Pkinase（即Ser/Thr蛋白激酶）和EF-hand 結(jié)構(gòu)域，以及6 個(gè)保守基序，且RrCDPKs的結(jié)構(gòu)域和基序在組成及排列順序上基本一致，這表明RrCDPKs在進(jìn)化上相對(duì)保守。

本研究的系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示RrCDPKs 與眾多植物[10-17]一樣可歸為4 個(gè)亞家族，表明物種之間仍存在一定共性。其中亞家族Ⅳ僅包括1 個(gè)成員RrCDPK5，與其他植物Ⅳ亞族中成員數(shù)量少的特征一致，如28 個(gè)薄殼山核桃和25 個(gè)山核桃CDPKs中Ⅳ亞族均僅2 個(gè)[29]。靳燕等[16]發(fā)現(xiàn)，CDPK最早存在于衣藻中，隨著基因組的擴(kuò)張，逐步出現(xiàn)于裸子植物、被子植物中，衣藻的2 個(gè)CDPK基因都位于Ⅳ亞族，Ⅳ亞族的CDPKs內(nèi)含子個(gè)數(shù)明顯多于其他族，是最早擴(kuò)張出的。因此，可通過內(nèi)含子與外顯子的分布情況來分析CDPK基因進(jìn)化的先后順序。本研究中Ⅳ亞族的外顯子數(shù)最多，與前人研究結(jié)果[16]一致，推測(cè)為進(jìn)化最早的RrCDPK 基因。茶樹CsCDPK17 與AtCDPK17 的同源關(guān)系最近，能夠不同程度地響應(yīng)低溫、干旱、滲透脅迫[32]，而本試驗(yàn)中RrCDPK1 和AtCDPK17 也同屬于一個(gè)分支，且RrCDPK1 啟動(dòng)子含有低溫響應(yīng)元件和缺氧特異性誘導(dǎo)有關(guān)的類增強(qiáng)子元件，說明RrCDPK1 可能參與低溫響應(yīng)。CDPK家族是植物有效響應(yīng)和增強(qiáng)對(duì)非生物和生物脅迫的抵抗力的基本組成部分之一[33]。據(jù)報(bào)道，二穗短柄草中CDPK14 基因參與了植物的抗旱反應(yīng)[34]。Li等[35]研究發(fā)現(xiàn)，ShCDPK家族成員在冷、干旱脅迫下的表達(dá)變化顯著，用VIGS 技術(shù)（病毒誘導(dǎo)的基因沉默）使ShCDPK6 和ShCDPK26 基因沉默的植物對(duì)寒冷和干旱脅迫的抗逆性降低，筆者推測(cè)可能是因?yàn)槠鋯?dòng)子中存在大量與防御和干旱脅迫相關(guān)的順式作用元件。刺梨CDPK家族成員是否參與調(diào)控植物對(duì)抗生物和非生物脅迫尚未可知。因此，筆者在本研究中分析了RrCDPKs啟動(dòng)子的順式作用元件，發(fā)現(xiàn)RrCDPKs 含有防御和壓力脅迫、低溫脅迫、厭氧誘導(dǎo)及缺氧特異性誘導(dǎo)的應(yīng)答元件，這表明刺梨CDPK可能響應(yīng)逆境脅迫。此外，還發(fā)現(xiàn)激素響應(yīng)元件在RrCDPKs 中普遍存在，特別是脫落酸及赤霉素。有研究表明，AtCPK10 通過ABA和Ca2+信號(hào)通路參與氣孔運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)，可能在植物響應(yīng)干旱脅迫中發(fā)揮重要作用[36]。Li 等[37]研究表明，CDPKs 參與了多種激素的串?dāng)_，并且同源基因參與了甘薯及其兩個(gè)二倍體近緣種的不同激素通路。因此，RrCDPKs也可能通過激素信號(hào)途徑和Ca2+信號(hào)通路以響應(yīng)環(huán)境脅迫。

CDPKs 廣泛存在于各種植物組織中。本研究中利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析了RrCDPKs 在刺梨不同組織（莖、葉、花、30 d 的果實(shí)）和果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期（花后30、60、90 d）的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)在刺梨的莖、葉、花、不同發(fā)育時(shí)期的果實(shí)中都可檢測(cè)到RrCDPKs的表達(dá)，且各有不同，表明其成員不同程度地參與刺梨營養(yǎng)生長(zhǎng)及生殖生長(zhǎng)。Frattini 等[38]研究發(fā)現(xiàn)水稻OsCDPK2 在葉片對(duì)光的響應(yīng)中起作用，OsCDPK2蛋白在暴露于光的綠葉中幾乎檢測(cè)不到，但轉(zhuǎn)移到黑暗時(shí)水平急劇上升。本試驗(yàn)中RrCDPK1/4 基因的啟動(dòng)子都包含光響應(yīng)元件和光響應(yīng)的MYB結(jié)合位點(diǎn)，且都與OsCDPK2 位于Ⅱ亞族，RrCDPK1 在葉中表達(dá)量不高，RrCDPK4 在葉中高表達(dá)，因此，RrCDPK1/4 可能協(xié)同參與應(yīng)對(duì)外界的光變化。Martins 等[39]近幾年研究發(fā)現(xiàn)鈣對(duì)類黃酮的產(chǎn)生有顯著影響，能促進(jìn)槲皮素類黃酮醇的含量增加；外源鈣處理的花生中類黃酮含量增加[40]。RrCDPK11 啟動(dòng)子包含參與黃酮類生物合成基因調(diào)控的MYB結(jié)合位點(diǎn)，且在果實(shí)發(fā)育后期高表達(dá)，與類黃酮化合物的積累趨勢(shì)[41]一致。因此，筆者推測(cè)RrCDPK11 參與了刺梨調(diào)控類黃酮化合物的合成，且其機(jī)制可能與Ca2+信號(hào)有關(guān)。

大量研究表明，CDPK 通過EF-hand 結(jié)構(gòu)感知Ca2+濃度的變化，解除自我抑制，激活激酶結(jié)構(gòu)域，進(jìn)而傳遞信息調(diào)節(jié)植物的生理變化，廣泛參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育和形態(tài)建成[7，30]。由于EF-hand 基序數(shù)量和氨基酸序列的變化，CDPK對(duì)Ca2+的親和力可能不同[42]。而本研究經(jīng)結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)RrCDPKs 所含EF-hand 結(jié)構(gòu)域數(shù)目相差無幾。因此，筆者進(jìn)一步研究了刺梨CDPKs對(duì)鈣離子的響應(yīng)，與楊婳若等[43]處理相似，但經(jīng)過前期試驗(yàn)摸索發(fā)現(xiàn)實(shí)生苗比扦插苗耐受更高濃度的hoagland 營養(yǎng)液和鈣水平，因此本試驗(yàn)所選供鈣水平適宜于后續(xù)試驗(yàn)及分析。同樣，取樣時(shí)間的選擇也至關(guān)重要，本試驗(yàn)參考前人研究[18，44-45]發(fā)現(xiàn)響應(yīng)金屬離子的文獻(xiàn)中取樣時(shí)間有長(zhǎng)有短，短期的多數(shù)為1 d，長(zhǎng)期的多數(shù)為7 d。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)RrCDPKs 對(duì)鈣的響應(yīng)隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸發(fā)生變化，表明RrCDPKs對(duì)長(zhǎng)期和短期的鈣處理的響應(yīng)機(jī)制不同，這與張習(xí)敏[17]的研究討論一致，也進(jìn)一步驗(yàn)證了取樣時(shí)間的合理性。本研究以0 mmol·L-1鈣處理為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)供鈣后，少數(shù)RrCDPKs表現(xiàn)出明顯的上調(diào)效應(yīng)，分析可知，葉中RrCDPK4/8、根中RrCDPK1/2，葉中RrCDPK4/9/10/12、根中RrCDPK2/9 分別在0.5、2 mmol·L-1鈣水平下表現(xiàn)出顯著的上調(diào)表達(dá)響應(yīng)，表明這些基因在應(yīng)對(duì)不同供鈣水平時(shí)發(fā)揮了重要作用。周衛(wèi)等[46]研究發(fā)現(xiàn)植物主要通過根系吸收鈣，通過葉片的蒸騰拉力將鈣運(yùn)輸至地上部提供營養(yǎng)。本研究結(jié)果表明，刺梨RrCDPKs 家族可響應(yīng)外界缺鈣脅迫和鈣濃度變化，可能通過誘導(dǎo)植株對(duì)鈣吸收及運(yùn)輸以維持植株正常的生理功能，但其具體機(jī)制還有待研究。進(jìn)一步分析可知，RrCDPKs 在葉和根中對(duì)鈣水平的敏感性不同，如RrCDPK6/16 在葉中低表達(dá)，與其組織表達(dá)模式相吻合，這一定程度上說明RrCDPKs基因表達(dá)屬于器官依賴型，與其他物種的研究結(jié)論一致[17]。也有研究總結(jié)，盡管目前所有被發(fā)現(xiàn)的CDPK都含有與Ca2+結(jié)合的EF-hand 結(jié)構(gòu)域，但并不是每個(gè)CDPK的激酶活性都完全受Ca2+調(diào)控。如，擬南芥中至少有6 個(gè)成員（CPK7/8/10/13/25/30）的激酶活性基本上不受Ca2+調(diào)控，研究發(fā)現(xiàn)在沒有Ca2+存在時(shí)，它們就已有較高的激酶活性；CPK32 的活性部分受Ca2+調(diào)控[47]。由本研究可知刺梨RrCDPK1/2 基因?qū)θ扁}的敏感性不如其他成員，尤其RrCDPK1 與擬南芥CPK7/8 同屬于一個(gè)進(jìn)化分支，推測(cè)其激酶活性基本不受Ca2+調(diào)控。因此，這些鑒定的刺梨鈣依賴性蛋白激酶在響應(yīng)不同供鈣水平時(shí)發(fā)揮的作用不盡相同，為后續(xù)探明刺梨對(duì)外界鈣環(huán)境的響應(yīng)機(jī)制提供了相關(guān)信息。

4 結(jié)論

在刺梨全基因組中，共鑒定出16 個(gè)刺梨RrCDPK家族成員，所有成員均具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶和EF-hand 結(jié)構(gòu)域。通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，獲得4 個(gè)亞家族，亞族內(nèi)成員間具有高度保守性，而各亞族成員間的序列和結(jié)構(gòu)特征存在一定差異，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)與刺梨CDPK家族親緣關(guān)系最近的是草莓，其次是蘋果，較遠(yuǎn)的為擬南芥和水稻。各基因成員啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)它們大多含有光響應(yīng)元件、多種激素響應(yīng)元件及脅迫響應(yīng)元件等。不同器官及果實(shí)發(fā)育時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示RrCDPKs 具有時(shí)空表達(dá)特異性。RrCDPKs 對(duì)不同供鈣水平的表達(dá)響應(yīng)試驗(yàn)表明，以0 mmol·L-1無鈣處理為對(duì)照，0.5 mmol·L- 1鈣水平下RrCDPK1/2/4/8 表達(dá)顯著上調(diào)，2 mmol·L-1鈣水平下RrCDPK2/4/9/10/12 表達(dá)顯著上調(diào)；RrCDPKs在葉和根中對(duì)供鈣水平及處理時(shí)間的表達(dá)響應(yīng)也不同。研究結(jié)果為后續(xù)探明CDPK家族在刺梨對(duì)外界鈣環(huán)境的響應(yīng)機(jī)制提供了相關(guān)信息。

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