李彧?車寶泉?李珉?孫毅坤

摘要：目的 建立高效液相色譜法測(cè)定鹽酸莫西沙星原料有關(guān)物質(zhì)。方法 采用Inertsil Phenyl柱苯基鍵合硅膠（4.0 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，以四丁基硫酸氫銨緩沖液-甲醇為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速1.3 mL/min，柱溫50℃，檢測(cè)波長(zhǎng)293 nm。結(jié)果 鹽酸莫西沙星與15個(gè)已知雜質(zhì)A～O均能良好分離。6個(gè)廠家鹽酸莫西沙星樣品測(cè)定結(jié)果顯示，已知雜質(zhì)及其他最大單個(gè)雜質(zhì)含量均小于0.05%，雜質(zhì)總含量小于0.06%。結(jié)論 本方法靈敏、專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高，可用于鹽酸莫西沙星原料藥有關(guān)物質(zhì)測(cè)定。

關(guān)鍵詞：鹽酸莫西沙星；高效液相色譜法；有關(guān)物質(zhì)；質(zhì)量控制

中圖分類號(hào)：R917文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Abstract Objective To establish an HPLC method for method for the determination of the related substances in moxifloxacin hydrochloride. Methods The determination was performed on a phenyl column（4.0 mm×250 mm， 5 ?m）. The mobile phase consisted of tetrabutyl ammonium bisulfate buffer solution and methanol with gradient elution. The flow rate was 1.3 mL/min， and the column temperature was maintained at 50℃，the detection wavelength was set at 293 nm. Results The resolutions between the peaks of moxifloxacin hydrochloride and fifteen known impurities（including impurities A～O）were good. The determination results of the six batches of moxifloxacin hydrochloride samples showed that the known impurities and the maximum single unknown impurity were less than 0.05%， and the total impurity was less than 0.06%. Conclusion The method is proved to be simple， accurate， and could be used for the determination of related substances in moxifloxacin hydrochloride.

Key words Moxifloxacin hydrochloride; HPLC; Related substances; Quality control

鹽酸莫西沙星是德國(guó)拜耳醫(yī)藥保健品公司在1999年開(kāi)發(fā)的第四代喹諾酮類廣譜抗菌藥，制劑商品名為“拜復(fù)樂(lè)”，于2001年在中國(guó)上市。與早期喹諾酮類抗菌藥相比既有良好的抗菌活性，又增強(qiáng)了對(duì)厭氧菌、革蘭陽(yáng)性菌及非典型微生物如衣原體、支原體和軍團(tuán)菌的抗菌活性，是廣譜抗菌藥。鹽酸莫西沙星的殺菌作用與其他喹諾酮類抗菌藥一樣，作用于抑制細(xì)菌DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、修復(fù)和重組所需的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ。同時(shí)安全性也優(yōu)于其他喹諾酮類藥物，降低了耐藥性，光毒性下降[1-2]。鹽酸莫西沙星臨床多用于呼吸系統(tǒng)疾病，如社區(qū)獲得性肺炎[3]、肺結(jié)核[4]和慢性支氣管炎[5]。國(guó)內(nèi)已批準(zhǔn)上市的制劑有片劑、注射劑和滴眼液。

鹽酸莫西沙星主要有兩種合成途徑[6]，一種是以7-氟莫西沙星喹啉羧酸（即雜質(zhì)I）為起始產(chǎn)物，另一種是以7-氟莫西沙星喹啉羧酸乙酯（即雜質(zhì)J）為起始產(chǎn)物（圖1）。目前，USP、BP及EP收載的鹽酸莫西沙星原料藥有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法，均采用等度洗脫法，將工藝雜質(zhì)A、B、C、D、E作為特定雜質(zhì)分別予以控制。USP還收載有片劑和滴眼液標(biāo)準(zhǔn)；片劑有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法與原料相同，僅控制了工藝雜質(zhì)（雜質(zhì)A～E），缺少對(duì)降解雜質(zhì)的控制；滴眼液標(biāo)準(zhǔn)則采用兩個(gè)不同的液相系統(tǒng)，控制工藝雜質(zhì)和四個(gè)降解雜質(zhì)。莫西沙星在氧化及光照條件下易降解形成多種降解雜質(zhì)。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[7]，雖有采用梯度洗脫法分析鹽酸莫西沙星有關(guān)物質(zhì)，但相比USP、BP等收載雜質(zhì)僅增加了雜質(zhì)F和雜質(zhì)G，缺乏其他已知雜質(zhì)研究，有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)準(zhǔn)確度低。本文在雜質(zhì)A～E的基礎(chǔ)上增加雜質(zhì)F～O（圖2），建立了既可檢測(cè)工藝雜質(zhì)，同時(shí)又可檢測(cè)降解雜質(zhì)，能更高效地控制鹽酸莫西沙星原料及其制劑有關(guān)物質(zhì)的高效液相色譜系統(tǒng)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-20AT高效液相色譜儀、Waters e2695高效液相色譜儀，DIONEX UltiMate 3000高效液相色譜儀；Mettler XS205型天平。

1.2 試藥

鹽酸莫西沙星原料藥，共6個(gè)廠家001～006，每個(gè)廠家3個(gè)批號(hào)。對(duì)照品：鹽酸莫西沙星（批號(hào)：50140-202003）、雜質(zhì)A（批號(hào)：510074-212102）、雜質(zhì)B（批號(hào)：510075-201401）、雜質(zhì)C（批號(hào)：510076-202102）、雜質(zhì)D（批號(hào)：510190-202102）、雜質(zhì)E（批號(hào)：510077-201901）、雜質(zhì)F（批號(hào)：510186-201901）、雜質(zhì)G（批號(hào)：510185-202001）、雜質(zhì)H（批號(hào)：510188-202001）、雜質(zhì)I（批號(hào)：510189-202001）、雜質(zhì)J（批號(hào)：510191-202001），以上均為中檢院對(duì)照品；雜質(zhì)K（批號(hào)：17-JUN-21-25）、雜質(zhì)L（批號(hào)12-JUN-19-76：）、雜質(zhì)M（批號(hào)：16-OCT-21-66）、雜質(zhì)N（批號(hào)：15-MAR-21-70）、雜質(zhì)O（批號(hào)：21-JUN-21-44），以上均購(gòu)自北京金百環(huán)科技有限公司。

甲醇為色譜純，購(gòu)自Merck公司；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 色譜條件

采用苯基鍵合硅膠色譜柱（Inertsil Phenyl，4.0 mm×

250 mm，5 μm）；流動(dòng)相A（取四丁基硫酸氫銨1.5 g、磷酸二氫鉀1.0 g，磷酸2 mL，加水1000 mL使溶解，三乙胺調(diào)節(jié)pH值至2.5±0.1）-流動(dòng)相B（甲醇），梯度洗脫（表1）；流速1.3 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)293 nm，柱溫50℃，進(jìn)樣體積20 μL。

2.2 溶液配制

供試品溶液制備：取鹽酸莫西沙星適量，精密稱定，加流動(dòng)相A溶解并稀釋成含約0.1 mg/mL的溶液。

對(duì)照品溶液制備：取鹽酸莫西沙星對(duì)照品適量，精密稱定，加流動(dòng)相A溶解并稀釋成每1 mL中含約0.1 μg的溶液。

雜質(zhì)儲(chǔ)備液制備：分別取雜質(zhì)A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N和O適量，精密稱定，加甲醇適量，溶解并稀釋成含約0.1 mg/mL的溶液。

系統(tǒng)適用性溶液制備：取鹽酸莫西沙星對(duì)照品與雜質(zhì)儲(chǔ)備液適量，加流動(dòng)相A溶解并稀釋制成約0.1 mg/mL的溶液、雜質(zhì)各1 μg的溶液。

靈敏度溶液制備：精密量取對(duì)照品溶液適量，用流動(dòng)相A溶解并稀釋成約0.05 μg/mL的溶液。

2.3 強(qiáng)制降解試驗(yàn)

未破壞：取鹽酸莫西沙星原料藥約25 mg，置25 mL量瓶中，加流動(dòng)相A溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

酸降解：取鹽酸莫西沙星原料藥約25 mg，置于25 mL量瓶中，加1 mol/L鹽酸1 mL，置80 ℃水浴中放置24 h，放置至室溫后，加1 mol/L氫氧化鈉

1 mL，加流動(dòng)相A稀釋至刻度，搖勻，即得。

堿降解：取鹽酸莫西沙星原料藥約25 mg，置于25 mL量瓶中，加1 mol/L氫氧化鈉1 mL，置80℃水浴中放置24 h，放置至室溫后，加1 mol/L鹽酸

1 mL，加流動(dòng)相A稀釋至刻度，搖勻，即得。

氧化降解：取鹽酸莫西沙星原料藥約25 mg，置于25 mL量瓶中，加30%過(guò)氧化氫1 mL，常溫放置

24 h，加流動(dòng)相A稀釋至刻度，搖勻，即得。

高溫降解：取鹽酸莫西沙星原料藥約25 mg，置于25 mL量瓶中，于105℃下放置24 h，放置至室溫后，加1 mol/L鹽酸1 mL，加流動(dòng)相A稀釋至刻度，搖勻，即得。

紫外光降解：取鹽酸莫西沙星原料藥約25mg，置于25 mL量瓶中，加水1 mL，于254 nm、365 nm光照條件下放置48 h，加流動(dòng)相A稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4 有關(guān)物質(zhì)測(cè)定

系統(tǒng)適用性要求：系統(tǒng)適用性溶液色譜圖（圖3）中各峰分離度均大于1.5，靈敏度溶液色譜圖中，莫西沙星峰峰高的信噪比應(yīng)大于10。

測(cè)定方法：精密量取供試品溶液和對(duì)照品溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。供試品溶液中如有雜峰，按加校正因子的主成分外標(biāo)法計(jì)算其含量。

3 結(jié)果

3.1 色譜方法建立

USP鹽酸莫西沙星原料藥中收載有關(guān)物質(zhì)方法為等度洗脫，無(wú)法有效分離諸降解雜質(zhì)；在USP鹽酸莫西沙星滴眼液有關(guān)物質(zhì)梯度洗脫方法的基礎(chǔ)上，改變四丁基硫酸氫銨濃度、pH值進(jìn)行優(yōu)化。此系統(tǒng)中，雜質(zhì)K與雜質(zhì)D和雜質(zhì)E為難分離雜質(zhì)，以此為優(yōu)化對(duì)象，得到理想分離結(jié)果（圖3）。

在優(yōu)化過(guò)程中，增加四丁基硫酸氫銨濃度可有效增加分離度， 而流動(dòng)相pH對(duì)其影響不明顯。色譜柱對(duì)分離亦影響顯著，采用ZORBAX Eclipse XDB-Phenyl、Waters XBridge Shield RP18苯基柱，雜質(zhì)K完全包含在雜質(zhì)D中，且雜質(zhì)C和雜質(zhì)D分離度僅有0.93；采用Inertsil Phenyl苯基柱，各峰最小分離度大于1.5，且采用不同批號(hào)（批號(hào)：SH5-6313、SH5-5823）色譜柱均可得到相同結(jié)果，故選定Inertsil Phenyl苯基柱作為分析色譜柱。

3.2 方法學(xué)考察

吸取“2.2”項(xiàng)下系統(tǒng)適用性溶液20 μL，記錄色譜圖（圖3），各雜質(zhì)分離良好。

3.2.1 專屬性考察

吸取上述6種強(qiáng)制降解溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖?？梢?jiàn)，本品對(duì)酸、堿、氧化、光照不穩(wěn)定，高溫較穩(wěn)定（圖4）。

各強(qiáng)制降解產(chǎn)生的雜質(zhì)均與主成分莫西沙星峰分離度良好，證明該系統(tǒng)色譜測(cè)定鹽酸莫西沙星有關(guān)物質(zhì)專屬性強(qiáng)；采用二極管列陣檢測(cè)器（PDA）對(duì)強(qiáng)制降解色譜圖主峰與各雜質(zhì)峰檢測(cè)，各色譜峰純度指數(shù)均大于0.99（純度閾值均大于純度角度），說(shuō)明主成分峰與各雜質(zhì)峰均為單一峰，不包含其他雜質(zhì)。同時(shí)，在該系統(tǒng)色譜條件下，主成分峰與強(qiáng)制降解雜質(zhì)均在293 nm下有最大吸收，因此采用293 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)為最檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2.2 線性關(guān)系考察

精密稱取鹽酸莫西沙星對(duì)照品與雜質(zhì)A～O對(duì)照品適量，加溶劑溶解并逐步稀釋制成10、5、2、1、0.4、0.2和0.1 μg/mL的系列溶液，搖勻。取上述溶液，分別進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積。以濃度對(duì)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程和相關(guān)系數(shù)；以各雜質(zhì)線性方程中斜率除以主成分線性方程中斜率得各雜質(zhì)校正因子（表2）。結(jié)果表明各成分在0.1～10 μg/mL的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.2.3 檢測(cè)限和定量限考察

用線性溶液逐步稀釋，以信噪比S/N=9.20對(duì)應(yīng)莫西沙星濃度0.04 μg/mL為定量限，以信噪比S/N=3.71對(duì)應(yīng)莫西沙星濃度0.01 μg/mL為檢測(cè)限。

3.2.4 溶液穩(wěn)定性考察

對(duì)照品溶液穩(wěn)定性：取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液在室溫下放置，在不同時(shí)間進(jìn)樣，以第一針對(duì)照品溶液進(jìn)樣時(shí)間為0h點(diǎn)，考察12h內(nèi)對(duì)照品溶液穩(wěn)定性，主峰峰面積RSD值為1.4%，無(wú)明顯變化趨勢(shì)，說(shuō)明對(duì)照品溶液穩(wěn)定。

供試品溶液穩(wěn)定性：取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液在室溫下放置，在不同時(shí)間進(jìn)樣，以第一針對(duì)照品溶液進(jìn)樣時(shí)間為0點(diǎn)，考察12 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性。采用面積歸一法計(jì)算各雜質(zhì)的百分含量，各雜質(zhì)及雜質(zhì)總量變化均小于0.01%，主峰峰面積RSD值為0.04%，無(wú)明顯變化趨勢(shì)，說(shuō)明供試品溶液穩(wěn)定。

3.2.5 精密度考察

對(duì)照品溶液精密度：取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次記錄色譜圖，主峰保留時(shí)間RSD值為0.09%，主峰峰面積RSD值為1.1%，證明對(duì)照品溶液精密度良好。

供試品溶液重復(fù)性：取鹽酸莫西沙星原料藥

10 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，用溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，平行制備6份，采用加校正因子的主成分外標(biāo)法測(cè)定各雜質(zhì)的百分含量。6份供試品溶液測(cè)定結(jié)果顯示，雜質(zhì)數(shù)量無(wú)變化，雜質(zhì)含量差異小于0.03%，說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。

3.2.6 中間精密度考察

取鹽酸莫西沙星原料藥10 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，用溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻。實(shí)驗(yàn)員1采用DIONEX UltiMate3000液相色譜儀，色譜柱Inertsil Phenyl柱（4.0 mm×250 mm，5 μm，批號(hào)：SH5-6313），實(shí)驗(yàn)員2采用Waters e2695液相色譜儀，色譜柱Inertsil Phenyl柱（4.0 mm×250 mm，

5 μm，批號(hào)：SH5-5823），在不同日期進(jìn)行試驗(yàn)，每人平行制備6份供試品溶液，分別測(cè)定有關(guān)物質(zhì)（表3）。結(jié)果可見(jiàn)，12份樣品中雜質(zhì)數(shù)量相同，雜質(zhì)含量差異小于0.04%，證明該方法精密度良好。

3.2.7 耐用性考察

取“2.2”項(xiàng)下系統(tǒng)適用性溶液照有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法，在改變流速、柱溫和流動(dòng)相比例等條件下，分別取系統(tǒng)適用性溶液20μL注入液相色譜儀，考察系統(tǒng)適用性變化情況（表4）。結(jié)果表明，流速、柱溫、pH值等微弱變化對(duì)系統(tǒng)適用性無(wú)顯著影響，說(shuō)明系統(tǒng)耐用性良好。

3.3 樣品測(cè)定

按照“2.2”項(xiàng)下制備鹽酸莫西沙星供試品、對(duì)照品溶液、系統(tǒng)適用性溶液及靈敏度溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析，對(duì)6個(gè)廠家的鹽酸莫西沙星原料藥進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)檢查，將每個(gè)廠家3個(gè)批號(hào)取平均值，檢查結(jié)果見(jiàn)表5。

4 討論與結(jié)論

目前，在EP與USP收載的鹽酸莫西沙星原料藥有關(guān)物質(zhì)方法色譜條件一致，流動(dòng)相比例相同，均為等度洗脫；雜質(zhì)A、B、C、D、E的限度均為0.1%，其他單個(gè)雜質(zhì)不得過(guò)0.1%，雜質(zhì)總量不得過(guò)0.3%及0.5%；上述方法無(wú)法有效控制雜質(zhì)F～O。多批檢測(cè)結(jié)果表明，在鹽酸莫西沙星原料藥中含有雜質(zhì)F、雜質(zhì)G及雜質(zhì)O。本文新優(yōu)化的方法可控制多達(dá)15個(gè)雜質(zhì)，在原有雜質(zhì)基礎(chǔ)上引入雜質(zhì)F～O，雜質(zhì)F～O定量限滿足ICH雜質(zhì)限度（0.1%）控制的要求，且進(jìn)行了校正因子研究，更適合對(duì)鹽酸莫西沙星產(chǎn)品的質(zhì)量控制。

強(qiáng)制降解試驗(yàn)結(jié)果表明，雜質(zhì)N、O為酸降解產(chǎn)物，雜質(zhì)F、M、K為堿降解產(chǎn)物，雜質(zhì)G、I、L、J為氧化降解產(chǎn)物，雜質(zhì)G、D、C、E為紫外光降解產(chǎn)物。在生產(chǎn)過(guò)程中，無(wú)法避免使用鹽酸與氫氧化鈉，對(duì)鹽酸莫西沙星原料藥的有關(guān)物質(zhì)分析結(jié)果表明，主要雜質(zhì)包括C、F、G、O，因此提示在合成工藝及儲(chǔ)存中應(yīng)注意酸、堿、氧化及光照對(duì)產(chǎn)品的影響。

本文建立了一種新的鹽酸莫西沙星有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法，本方法不僅可檢測(cè)已知的工藝雜質(zhì)，還可有效檢測(cè)出酸、堿、氧化、光照等降解條件下的降解雜質(zhì)。經(jīng)過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證，該方法靈敏、專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高，可有效用于鹽酸莫西沙星產(chǎn)品的質(zhì)量控制。

參 考 文 獻(xiàn)

王夕靜， 常春， 溫秀紅， 傅強(qiáng). HPLC法測(cè)定鹽酸莫西沙星的有關(guān)物質(zhì)[J]. 藥物分析雜志， 2020， 40（11）： 2048-2055.

李林梅， 宋太發(fā)， 索成林， 等. HPLC法測(cè)定鹽酸莫西沙星片中光降解雜質(zhì)的含量[J]. 邵陽(yáng)學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2020， 17（5）： 52-58.

任明霞， 趙皖京. 清咳平喘顆粒聯(lián)合莫西沙星治療成人輕中度社區(qū)獲得性肺炎臨床觀察[J]. 中草藥， 2022， 53（11）： 3410-3414.

張伯鵬， 趙艷， 張建偉. 莫西沙星治療耐多藥肺結(jié)核病臨床效果觀察[J]. 臨床肺科雜志， 2014， 19（6）： 1126-1128.

楊慶璽， 倪慶， 姬光東， 等. 羧甲司坦口服溶液聯(lián)合莫西沙星治療慢性支氣管炎急性發(fā)作的臨床研究[J]. 現(xiàn)代藥物與臨床， 2022， 37（9）： 2035-2039.

邵杰， 楊玉東， 朱紅強(qiáng)， 等. 鹽酸莫西沙星治療呼吸系統(tǒng)感染的有效性和安全性評(píng)價(jià)[J]. 當(dāng)代醫(yī)學(xué). 2016， 22（9）： 142-143.

楊成鈺. 鹽酸莫西沙星合成及相關(guān)雜質(zhì)分析的研究[D]. 杭州： 浙江工業(yè)大學(xué)， 2016.

崇小萌， 田冶， 王立新， 等. 鹽酸莫西沙星原料及片劑有關(guān)物質(zhì)及穩(wěn)定性分析[J]. 中國(guó)新藥雜志， 2022， 31（15）： 1531-1541.