王婷婷?李佩?彭潔?洪建文

摘要：目的 建立注射用鹽酸頭孢吡肟中基因毒性雜質(zhì)異亞丙基丙酮的含量測定方法。方法 氣相色譜法，采用DB-WAX毛細(xì)管柱（30 m×0.53 mm，1.0 μm），程序升溫，起始柱溫45℃，維持5 min，10℃/min的速率升溫至180℃；進(jìn)樣口溫度200℃，檢測器（FID）溫度250℃，氮氣流量為5 mL/min；頂空法進(jìn)樣，頂空溫度80℃，平衡時間20 min。結(jié)果 異亞丙基丙酮與難分離物質(zhì)二甲基甲酰胺可良好分離；在濃度0.41～8.2 μg/mL范圍內(nèi)，線性良好，回歸方程y=0.2457x-0.0066，相關(guān)系數(shù)r=0.9998；平均回收率為99.1%；檢測限0.5 ppm，定量限1.5 ppm。結(jié)論 該方法專屬性及耐用性良好，準(zhǔn)確度及靈敏度高，可用于注射用鹽酸頭孢吡肟中異亞丙基丙酮雜質(zhì)的含量測定。

關(guān)鍵詞：頭孢吡肟；異亞丙基丙酮；基因毒性雜質(zhì)；含量；GC；異丙叉丙酮

中圖分類號：R978.1， R917? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Abstract? ? Objective To establish a method for the determination of the content of the genotoxic impurity mesityl oxide in cefepime hydrochloride for injection. Methods? ? Gas Chromatography was used， with a DB-WAX capillary column （30 m × 0.53 mm， 1.0 μm） and temperature programmed. The initial column temperature was 45℃， maintained for 5 min， and the temperature rose to 180℃ at the rate of 10℃/min; the inlet temperature was 200℃， the detector （FID） temperature was 250℃， and the flow rate of nitrogen was 5 mL/min. The head space temperature was 80℃ and the equilibrium time was 20 min. Results? ? Mesityl oxid could be well separated from dimethylformamide， which was difficult to separate; The linear range was 0.41～8.2 μg/mL（y=0.2457x-0.0066， r=0.9998）. The average recovery rate was 99.1%.? The limit of detection was 0.5 ppm and the limit of quantitation was 1.5 ppm. Conclusion? ? The method has good specificity， durability， accuracy， and sensitivity， and can be used for the determination of content of mesityl oxid in cefepime hydrochloride for injection.

Key words? ? Cefepime; Mesityl oxid; Genotoxic impurity; Conetent; GC; Isopropylidene acetone

鹽酸頭孢吡肟為我國仿制成功的首個第四代頭孢菌素，具有廣譜高效的抗菌活性和對細(xì)菌β-內(nèi)酰胺酶的高度穩(wěn)定性，被用于防治多種細(xì)菌感染性疾病[1]。注射用鹽酸頭孢吡肟為鹽酸頭孢吡肟與一定比例的精氨酸的混粉制劑[2]。丙酮作為鹽酸頭孢吡肟中合成中的重要溶劑[3]，在一定條件下可縮合形成異亞丙基丙酮，又稱4-甲基-3戊烯-2酮（圖1）[4]。異亞丙基丙酮為不飽和酮結(jié)構(gòu)，含有遺傳毒性致癌警示結(jié)構(gòu)[5-6]，并對咽喉、眼、皮膚等具有刺激作用[7]。國外藥典在西司他丁鈉和替考拉寧標(biāo)準(zhǔn)中已對異亞丙基丙酮的含量予以控制[8-9]。

在2020年的國家藥品抽檢探索性研究工作中，本課題組采用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用方法，發(fā)現(xiàn)國產(chǎn)注射用鹽酸頭孢吡肟（涉及國內(nèi)5家原料生產(chǎn)企業(yè)）及1批自購參比制劑（百時美施貴寶，Bristol-Myers Squibb）中，普遍含有一定量的異亞丙基丙酮雜質(zhì)，為該品種的共性風(fēng)險[10]。本文建立了注射用鹽酸頭孢吡肟中異亞丙基丙酮雜質(zhì)的GC定量方法。該方法不僅可為監(jiān)管部門及生產(chǎn)企業(yè)對該品種開展上市后的質(zhì)量再評價等提供檢測手段，同時也為鹽酸頭孢吡肟原料中相應(yīng)雜質(zhì)的監(jiān)管提供了數(shù)據(jù)支持。

1 儀器與試藥

儀器：Thermo trace 1300氣相色譜儀；Agilent 6890氣相色譜儀；SHIMADZU? GCMS-TQ8050 氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀；Sartorius CP225D電子天平。

試藥：異亞丙基丙酮對照品（GC級，Aladdin，E1927178，含量≥98%）；N，N二甲基甲酰胺（分析純，廣州市化學(xué)試劑廠，20151101-2）；注射用鹽酸頭孢吡肟樣品（來源：2020年國家藥品抽檢）；超純水。

2 實驗方法

2.1 GC-MS方法參數(shù)

氣相色譜條件：Agilent DB-5MS毛細(xì)管柱，30 m×

0.25 mm，1.0 ?m；頂空溫度80℃，平衡時間20 min；

起始柱溫45℃，維持5 min，以10℃/min的速率升溫至180℃，維持5 min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊電離（EI）；采集方式Q3scan；離子源溫度230℃；接口溫度250℃；掃描范圍：30～500 m/z；掃描速度：5000；溶劑延遲時間1 min。

2.2 GC定量方法參數(shù)

采用聚乙二醇為固定液的毛細(xì)管柱為色譜柱（DB-wax，30 m×0.53 mm，1.0 μm）；起始柱溫為45℃，維持5 min，再以10℃/min的速率升溫至180℃；載氣為N2，流速為5 mL/min；進(jìn)樣口溫度為200℃；檢測器溫度為250℃；頂空平衡溫度為80℃，平衡時間為20 min。

2.3 溶液的配制

2.3.1 GC-MS

供試品溶液：取1瓶供試品內(nèi)容物（約相當(dāng)于頭孢吡肟1.0 g），置頂空瓶中，加水2.5 mL使溶解，密封。

對照品溶液：精密量取異亞丙基丙酮對照品約16 mg，置100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。精密量取1 mL，置20 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，精密量取2.5 mL，置頂空瓶中，密封（8 ?g/mL）。

2.3.2 GC

系統(tǒng)適用性溶液：取異亞丙基丙酮約16 mg，置200 mL量瓶中，加水稀釋至刻度。取二甲基甲酰胺約70 mg，置100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度。分別精密量取上述溶液1 mL，置同一20 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL置頂空瓶中，密封。

供試品溶液：取本品約0.38 g，精密稱定，置頂空瓶中，精密加水5 mL使溶解，密封，搖勻。

對照品溶液：精密稱取異亞丙基丙酮約16 mg，置200 mL量瓶中，加水稀釋至刻度。精密量取此溶液1 mL，置20 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置頂空瓶中，密封。

3 試驗結(jié)果

3.1 GC-MS分析

取“2.3.1”項下待測溶液，照“2.1”項下條件，進(jìn)樣，結(jié)果顯示，注射用鹽酸頭孢吡肟供試品溶液TIC圖中，保留時間約9.726 min處未知色譜峰m/z為98.10，與異亞丙基丙酮對照品保留時間一致，質(zhì)譜信息圖一致，參考離子峰強(qiáng)度比一致，見圖2～3。同時，該組分在島津已知組分質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫中相似度檢索識別結(jié)果為異亞丙基丙酮（分子量98，CAS號141-79-7），匹配度97。

3.2 GC分析方法的建立

3.2.1 專屬性

異亞丙基丙酮沸點約為133℃，與二甲基甲酰胺沸點（153℃）較為接近，且國內(nèi)部分產(chǎn)品中含有微量殘留的二甲基甲酰胺，本次研究采用二甲基甲酰胺作為難分離物質(zhì)，考察方法專屬性。取“2.3.2”項下系統(tǒng)適用性溶液、供試品溶液及空白溶液，選擇3類不同極性色譜柱，同法測定，結(jié)果顯示，采用“2.2”項下方法，在聚乙二醇填料的色譜柱中，系統(tǒng)適用性溶液中異亞丙基丙酮與二甲基甲酰胺可實現(xiàn)良好分離；供試品溶液中異亞丙基丙酮與其相鄰雜質(zhì)峰均能有效分離；空白溶劑無干擾；方法專屬性良好，見圖4～5。

3.2.2 線性

精密稱取異亞丙基丙酮對照品適量，制成系列濃度溶液，按照“2.2”項下方法，頂空進(jìn)樣，以濃度（?g/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示，在0.41～8.2 ?g/mL濃度范圍內(nèi)（約相當(dāng)于供試品中頭孢吡肟0.001%～0.02%濃度水平），線性良好，線性方程y=0.2457x-0.0066，相關(guān)系數(shù)r=0.9998。

3.2.3 準(zhǔn)確度

采用加樣回收法，取已知濃度的同一批供試品9份，各約0.38 g（約相當(dāng)于頭孢吡肟0.2 g），精密稱定，置頂空瓶中，分別加入異亞丙基丙酮對照品溶液（3.2、4和4.8 ?g/mL）5 mL溶解（約相當(dāng)于供試品頭孢吡肟0.008%、0.01%及0.012%濃度水平），配制回收率測定溶液，照“2.2”項下色譜條件測定，結(jié)果表明，方法準(zhǔn)確度高，見表1。

異亞丙基丙酮在鹽酸頭孢吡肟中為微量殘留，為進(jìn)一步提高檢測方法靈敏度，本次研究嘗試提高供試品溶液濃度（2.5 mg/mL），結(jié)果顯示，由于供試品中含有較高比例精氨酸輔料，其與對照品處于不同基質(zhì)中，供試品濃度提高后，基質(zhì)效應(yīng)明顯[11]，低濃度水平回收率低于80%，不能滿足ChP2020通則9101分析方法驗證指導(dǎo)原則中回收率限度要求。采用“2.3.2”項下溶液制備方法，既能達(dá)到較高靈敏度，又可顯著降低基質(zhì)干擾，在高中低濃度范圍，平均回收率達(dá)到99.1%，方法準(zhǔn)確度較高，同時較標(biāo)準(zhǔn)加入法操作更為簡單快捷。

3.2.4 重復(fù)性

選取同批次樣品6份，重復(fù)測定，異亞丙基丙酮含量測定結(jié)果均為0.001%（以頭孢吡計），方法重復(fù)性良好。

3.2.5 耐用性

選取5批樣品，采用不同色譜柱，不同氣相色譜儀，于不同時間測定，結(jié)果基本一致，方法耐用性良好，見表2。

3.2.6 檢測限與定量限

取異亞丙基丙酮對照品溶液逐級稀釋，以3倍信噪比為檢測限，10倍信噪比為定量限，該方法最低檢測濃度0.02 ?g/mL，檢測限0.00005%（以頭孢吡肟計，約0.5 ppm），定量濃度0.06 ?g/mL，定量限0.0002%（以頭孢吡肟計，約1.5 ppm）。

3.3 樣品測定

選取48批次2020年國家藥品抽檢樣品（涉及國內(nèi)5家原料生產(chǎn)企業(yè)）及1批次參比制劑，照“2.2”項下條件測定，以頭孢吡肟標(biāo)示量計，除參比制劑異亞丙基丙酮含量測定結(jié)果為0.011%

（110 ppm），其余國產(chǎn)制劑中異亞丙基丙酮含量均在0.001%～0.003%（10～30 ppm）之間。

4 討論

異亞丙基丙酮的常規(guī)合成途徑為：在堿性條件下丙酮縮合成二丙酮醇，二丙酮醇在磷酸條件下縮水制得[4]。推測其在頭孢吡肟中的可能引入途徑為①工業(yè)丙酮引入；②丙酮在回收再利用處理過程中縮合產(chǎn)生；③吡肟合成工藝中產(chǎn)生。本次研究結(jié)果顯示，新鮮工業(yè)丙酮中異亞丙基丙酮的含量約為4 ppm，其在生產(chǎn)中被回收利用后，異亞丙基丙酮的含量略微增至約7 ppm，而丙酮在鹽酸頭孢吡肟中總體殘留量不超過0.5%；因而推測鹽酸頭孢吡肟中的該雜質(zhì)不可能全部由丙酮引入，而可能在頭孢吡肟合成過程中產(chǎn)生。生產(chǎn)工藝研究顯示，鹽酸頭孢中間體合成中同時使用了丙酮和三乙胺等堿性化合物，而鹽酸頭孢吡肟本身酸性較強(qiáng)（pH值1.6～2.1），且丙酮作為最后一步的結(jié)晶溶媒，具備丙酮在堿性條件下縮合產(chǎn)生二丙酮醇，再遇酸性頭孢吡肟縮水產(chǎn)生異亞丙基丙酮的可能。

國外藥典在替考拉寧和西司他丁鈉標(biāo)準(zhǔn)中已將異亞丙基丙酮作為特定雜質(zhì)控制，其限度值分別為0.2%及0.4%，而注射用替考拉丁及注射用亞胺培南西司他丁鈉制劑最大日劑量分別為800 mg及4 g，參考其控制限度及日劑量進(jìn)行推算，注射用鹽酸頭孢吡肟中異亞丙基丙酮限度分別約為0.03%（267 ppm）及0.3%（2667 ppm），目前該品種中異亞丙基丙酮引入的質(zhì)量風(fēng)險總體可控。

參 考 文 獻(xiàn)

雷軍， 王浴生. 頭孢吡肟[J]. 國外醫(yī)藥抗生素分冊， 1996，? （5）： 354-358.

國家藥典委員會. 《中國藥典》（2015年版二部）[S]. 中國醫(yī)藥科技出版社， 2015： 916-917.

彭東明， 王曉紅， 劉艷飛， 等. 鹽酸頭孢吡肟的合成[J]. 中南大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）， 2015， 46（7）： 2405-2411.

戚蘊(yùn)石. 丙酮化學(xué)的發(fā)展現(xiàn)狀[J]. 石油化工， 1986， （7）： 439-445.

馬磊， 馬玉楠， 陳震， 等. 遺傳毒性雜質(zhì)的警示結(jié)構(gòu)[J]. 中國新藥雜志， 2014， 23（18）： 2106-2111.

胡紅梅， 胡彬彬， 李芳， 等. 氣相色譜法同時測定工作場所中異亞丙基丙酮和苯系物[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志， 2012， 22（9）： 2063-2065.

IPCS， International Chemical Safety Card on Mesityl oxide[DB/OL].（2006-11-01）[2022-10-27]https：//www.inchem.org/documents/icsc/icsc/eics0814.htm.

The United States Pharmacopeial Convention. The United States Pharmacopeia[S/OL].（2018-5-2）[2022-10-27].https：//online.uspnf.com.

EDQM.The European Pharmacopoeia[S/OL].（2022-4）[2022-10-27]https：//pheur.edqm.eu.

王婷婷， 肖慧， 李佩， 等. 國產(chǎn)注射用鹽酸頭孢吡肟質(zhì)量評價[J]. 中國抗生素雜志， 2022， 47（2）： 128-133.

陳丹丹， 張濤， 任麗萍. 基質(zhì)效應(yīng)在氣相色譜法測定農(nóng)藥殘留中的影響[C]. 農(nóng)藥與環(huán)境安全國際會議論文集， 2005： 257-265.