韓彬?徐艷梅?周玉巖?李佳蕊?高燕霞

摘要：目的 建立頂空進(jìn)樣-氣相色譜法測(cè)定鹽酸平陽(yáng)霉素原料及其制劑中有機(jī)溶劑殘留量，同時(shí)對(duì)國(guó)產(chǎn)樣品質(zhì)量現(xiàn)狀進(jìn)行評(píng)價(jià)。方法 采用氣相色譜法，頂空進(jìn)樣；色譜柱為DB-624毛細(xì)管柱（60 m×0.53 mm， 3.0 μm），載氣為高純氮?dú)?，程序升溫，氫火焰離子化檢測(cè)器（FID），進(jìn)樣口溫度為200℃，檢測(cè)器溫度為 230℃，載氣流速為 5.0 mL/min，分流比為 10：1，進(jìn)樣量1 mL。結(jié)果 鹽酸平陽(yáng)霉素原料中可檢出甲醇、丙酮、異丙醇3種溶劑；應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)證的新方法對(duì)征集到的原料進(jìn)行測(cè)定，其中一廠家的3批產(chǎn)品批間差異非常小，提示其生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，另一廠家的產(chǎn)品檢出的丙酮含量超出國(guó)家限定值范圍。 注射用鹽酸平陽(yáng)霉素中有機(jī)溶劑殘留量遠(yuǎn)低于限度要求。結(jié)論 該方法操作簡(jiǎn)單、快速靈敏、結(jié)果準(zhǔn)確，可通過(guò)對(duì)鹽酸平陽(yáng)霉素有機(jī)溶劑殘留量的測(cè)定，對(duì)藥品生產(chǎn)的工藝控制水平進(jìn)行評(píng)估。建議我國(guó)藥品生產(chǎn)企業(yè)在內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)中增訂殘留溶劑檢查項(xiàng)，并開展周期性地檢驗(yàn)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)生產(chǎn)中的質(zhì)量波動(dòng)情況；注射用鹽酸平陽(yáng)霉素采用冷凍干燥工藝生產(chǎn)，因而不需控制殘留溶劑。

關(guān)鍵詞：鹽酸平陽(yáng)霉素；殘留溶劑；質(zhì)量分析；工藝控制

中圖分類號(hào)：R978.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Abstract Objective To establish a headspace sampling-gas chromatography method for the determination of residual organic solvents in bleomycin A5 hydrochloride， and to evaluate the quality status of domestic raw materials and powder for injections. Methods Gas chromatography and headspace injection were used. The chromatographic column was a DB-624 capillary column （60 m×0.53 mm， 3.0 μm） with high purity nitrogen as carrier gas， temperature programmed， hydrogen flame ionization detector （FID）， injection port temperature of 200℃， detector temperature of 230℃， carrier gas flow rate of 5.0 mL/min. The shunt ratio was 10：1， and the injection volume was 1 mL. Results Three solvents， methanol， acetone and isopropanol， were detected in the raw material of Bleomycin A5 hydrochloride. The new verified method was used to determine the collected raw materials. The difference between the three batches of products from one manufacturer was very small， indicating that the production process was stable. The residual amount of organic solvent in bleomycin A5 hydrochloride for injection is far below the limit requirement. Conclusion The method is simple， rapid， sensitive， and accurate. It can be used to evaluate the process control level of drug production by determining the residual organic solvent of bleomycin A5 hydrochloride. It is suggested that Chinese drug manufacturers should add residual solvent inspection items in the internal control standards， and carry out periodic inspection to discover the quality fluctuation in production in time. It is not necessary to control the residual solvent of bleomycin A5 hydrochloride for injection， which is produced by freeze drying process.

Key words Bleomycin A5 hydrochloride; Residual solvent; Quality analysis; Process control

鹽酸平陽(yáng)霉素，又名爭(zhēng)光霉素是我國(guó)由平陽(yáng)鏈霉菌發(fā)酵液中分離，并自主研發(fā)的抗腫瘤類抗生素[1]，制劑注射用鹽酸平陽(yáng)霉素為鹽酸平陽(yáng)霉素凍干品。臨床上主要用于治療唇癌、舌癌、齒痕癌和鼻咽癌等頸部鱗癌[2]，其主成分化學(xué)結(jié)構(gòu)與博來(lái)霉素A5組分一致，但肺毒性低于博來(lái)霉素[3]，同時(shí)本品不抑制機(jī)體的免疫功能，無(wú)常用抗癌藥物所引起的白細(xì)胞減少癥狀，且價(jià)格低廉，是優(yōu)良的進(jìn)口抗癌藥物替代品種。1994年進(jìn)入首批國(guó)家基本藥物目錄，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中國(guó)藥典》2020年版二部[4]。

鹽酸平陽(yáng)霉素發(fā)酵液中伴生多種雜質(zhì)[5]，生產(chǎn)過(guò)程需要多次提純，其工藝的穩(wěn)定性直接影響產(chǎn)品的質(zhì)量。提純中使用到的有機(jī)溶劑主要有甲醇、丙酮和異丙醇3種，然而現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中未對(duì)殘留溶劑做出要求，檢索近年文獻(xiàn)，亦無(wú)相關(guān)報(bào)道。

殘留溶劑的評(píng)估是原料生產(chǎn)過(guò)程控制的重要環(huán)節(jié)。本文根據(jù)人用藥物注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)（ICH）的相關(guān)規(guī)定和《中國(guó)藥典》2020年版四部通則 0861“殘留溶劑測(cè)定法” 的要求，采用氣相色譜法測(cè)定鹽酸平陽(yáng)霉素原料中3種有機(jī)溶劑的殘留量，進(jìn)而評(píng)估鹽酸平陽(yáng)霉素原料的生產(chǎn)工藝穩(wěn)定性，同時(shí)用建立的方法考察注射用鹽酸平陽(yáng)霉素中有機(jī)溶劑殘留情況，為檢查項(xiàng)目設(shè)置必要性提供數(shù)據(jù)支持。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

安捷倫7890B氣相色譜儀；氫火焰離子化檢測(cè)器（FID）；純水氫氣發(fā)生器（濟(jì)南浩偉實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；SGK-2LB低噪空氣泵（北京東方精華苑科技有限公司）；Open LBACDS Chem Station Edition工作站；德國(guó)梅特勒XS205電子分析天平。

1.2 藥品與試劑

鹽酸平陽(yáng)霉素原料，廠家1，批號(hào)：Y190401、Y200901、Y200902；廠家2，批號(hào)：200322。注射用鹽酸平陽(yáng)霉素，廠家1，批號(hào)：190501、200501、200801、200901；廠家2，批號(hào)：20200424、20200519。水是實(shí)驗(yàn)室自制超純水（電阻率18.2Ω）；甲醇、丙酮、異丙醇均為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Agilent DB-624毛細(xì)管色譜柱（60 m×0.53? mm，3.0 μm）；檢測(cè)器為氫火焰離子化監(jiān)測(cè)器（FID）；進(jìn)樣口溫度為200℃；檢測(cè)器溫度為230℃；采用程序升溫方式：起始柱溫為40℃，維持2 min，以5℃/min的速率升溫至100℃，維持8 min，再以20℃/min的速率升溫至200℃，維持5 min；載氣為高純N2，柱流速為5 mL/min；頂空瓶平衡溫度設(shè)定為70℃，頂空平衡時(shí)間30 min。

2.2 溶液配制

混合對(duì)照品貯備液：精密稱取甲醇1.50 g、丙酮2.50 g、異丙醇2.50 g，分置50 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻；精密量取上述3溶液各5 mL置同一50 mL量瓶中。用水稀釋至刻度，搖勻，即得含甲醇、丙酮、異丙醇分別為3、5和5 mg/mL 的混合對(duì)照品貯備液。

對(duì)照品溶液：精密量取混合對(duì)照品貯備液5 mL，置50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取2 mL置頂空瓶中，密封，即得。

供試品溶液：精密稱取供試品0.2 g，置頂空瓶中，精密加入水2 mL溶解，密封，即得。

2.3 專屬性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、空白溶液（水）和供試品溶液，照“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，記錄色譜圖（圖1）。在該色譜條件下，出峰順序依次為：甲醇（4.713 min）、丙酮（6.683 min）和異丙醇（6.896 min），各色譜峰分離度均大于1.5；理論板數(shù)均大于50000，溶劑對(duì)樣品測(cè)定無(wú)干擾，其它雜質(zhì)峰對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

2.4 檢出限及定量限測(cè)定

精密量取混合對(duì)照品溶液，逐級(jí)稀釋，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜峰高并與信噪比（S/N）比較，當(dāng)峰高約為10倍的S/N時(shí)，該供試品濃度即為定量限（LOQ）；當(dāng)約為3倍的S/N時(shí)，即為檢出限（LOD）。檢測(cè)結(jié)果見表1。

2.5 線性關(guān)系考察

精密量取混合對(duì)照品貯備液各0.1、0.5、1、2和5 mL分別置于10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，制成系列標(biāo)準(zhǔn)曲線混合對(duì)照測(cè)試溶液。精密量取2 mL置頂空瓶中，密封，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。以溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，分別得到甲醇、丙酮、異丙醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程及線性范圍，結(jié)果見表2。

2.6 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

精密量取混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液0.8、1.0、1.2置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得標(biāo)準(zhǔn)加入液（1）、（2）、（3）；精密稱取鹽酸平陽(yáng)霉素原料（批號(hào)：Y200901）0.2 g，共9份，分3組，置頂空瓶中，分別加入上述混合對(duì)照溶液2.0 mL，密封。照“2.1”項(xiàng)下測(cè)定，記錄色譜圖；以峰面積，按外標(biāo)法，測(cè)定甲醇、丙酮和異丙醇的回收率（表3），測(cè)定結(jié)果提示方法的準(zhǔn)確性良好。

2.7 精密度試驗(yàn)

2.7.1 進(jìn)樣精密度試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液注入氣相色譜儀，記錄色譜圖。重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算RSD，考察本法的儀器精密度。結(jié)果：甲醇保留時(shí)間RSD為0.01%，峰面積RSD為1.0%，丙酮保留時(shí)間RSD為0.0%，峰面積RSD為0.7%，異丙醇保留時(shí)間RSD為0.01%，峰面積RSD為0.8%，進(jìn)樣精密度良好。

2.7.2 重復(fù)性試驗(yàn)

取鹽酸平陽(yáng)霉素原料1批（批號(hào)：Y190401）和混合對(duì)照品貯備溶液，照擬定方法，平行制備6份，考察本法的重復(fù)性。結(jié)果：同一實(shí)驗(yàn)人員重復(fù)測(cè)定6次，6次測(cè)定結(jié)果比較甲醇、丙酮和異丙醇的檢出量一致。方法重復(fù)性良好。

2.8 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

按對(duì)照品溶液配制方法制備，于室溫放置0、1、2、3、4、5和6 h，取不同放置時(shí)間的上述溶液注入氣相測(cè)定，結(jié)果：室溫放置6 h，對(duì)照品溶液中甲醇、丙酮和異丙醇峰面積RSD分別為4.1%、1.6%和1.9%（n=7），對(duì)照品溶液在6 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 耐用性試驗(yàn)

分別考察了載氣流速3.0、4.0和5.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度180℃、200℃和220℃和檢測(cè)器溫度210℃、230℃和250℃，以及分流比5：1、10：1條件下3種有機(jī)溶劑的色譜保留行為，結(jié)果見表4。在各色譜條件下甲醇、丙酮和異丙醇3種溶劑分離度及理論塔板數(shù)均符合要求，提示本方法色譜條件的耐用性良好。

2.10 樣品測(cè)定

取鹽酸平陽(yáng)霉素原料4批（批號(hào)：Y190401、Y200901、Y200902和200322）和注射用鹽酸平陽(yáng)霉素6批（190501、200501、200801、200901、20200424和20200519），每份0.2g，按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，記錄峰面積，外標(biāo)法計(jì)算有機(jī)溶劑殘留量，結(jié)果見表5。

3 討論

3.1 色譜條件篩選

鹽酸平陽(yáng)霉素易溶于水，待測(cè)3中有機(jī)溶劑與水溶解度良好，因此選擇水為溶劑；甲醇、丙酮和異丙醇的沸點(diǎn)分別為64.8℃、56.5℃和82.4℃，沸點(diǎn)均低于水的沸點(diǎn)，因而選擇頂空進(jìn)樣。取供試品溶液，固定加熱時(shí)間30 min，分別考察50℃、60℃、70℃、80℃和90℃頂空條件下，待測(cè)組分峰面積變化及降解雜質(zhì)對(duì)測(cè)定的干擾情況。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在70℃條件下，各待測(cè)組分均有良好相應(yīng)，且降解雜質(zhì)對(duì)測(cè)定無(wú)影響，因此確定頂空溫度為70℃。取混合對(duì)照品溶液，固定頂空溫度為70℃，分別考察加熱10、20、30、40和50 min時(shí)待測(cè)溶液的氣液平衡狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，30 min后，各組分峰面積趨于穩(wěn)定，以30 min分離度最好，且檢測(cè)周期適宜，因此確定頂空條件為70℃，加熱30 min。

3.2 樣品分析

通過(guò)微生物發(fā)酵工藝或半合成過(guò)程生產(chǎn)的抗生素，組分較復(fù)雜，生產(chǎn)工藝中常用有機(jī)溶劑對(duì)粗品進(jìn)行結(jié)晶提純，如果工藝參數(shù)控制不嚴(yán)格，成品中殘留有機(jī)溶劑的量將出現(xiàn)較大變異，因此，以殘留溶劑是表征提純工藝穩(wěn)定性的重要指標(biāo)之一。對(duì)征集到的兩個(gè)廠家4批原料藥的檢測(cè)結(jié)果提示，一個(gè)廠家的樣品均符合《中國(guó)藥典》四部通則0831殘留溶劑測(cè)定[6]中的限度要求，且3批批間差異非常小，提示其生產(chǎn)工藝穩(wěn)定。另一個(gè)企業(yè)的樣品，丙酮含量超過(guò)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)限度近一倍，但由于僅有一批樣品，無(wú)法評(píng)價(jià)其工藝穩(wěn)定性。雖然在兩個(gè)企業(yè)的6批制劑中，殘留溶劑均未被檢出或殘留量較低，其原因?yàn)樽⑸溆名}酸平陽(yáng)霉素采用冷凍干燥工藝生產(chǎn)，原料中的低沸點(diǎn)溶劑在制劑過(guò)程中可以被去除。但企業(yè)內(nèi)控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中設(shè)立殘留溶劑檢查項(xiàng)，并周期性地進(jìn)行測(cè)定，對(duì)評(píng)估生產(chǎn)工藝的仍穩(wěn)定性具有重要意義。

3.3 小結(jié)

殘留溶劑與原料提純工藝密切相關(guān)。對(duì)其殘留量進(jìn)行分析，可以體現(xiàn)出藥品生產(chǎn)企業(yè)的工藝控制水平，同時(shí)也暴露出不同企業(yè)間生產(chǎn)工藝的差距。建議我國(guó)藥品生產(chǎn)企業(yè)制訂內(nèi)控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并周期性地開展檢驗(yàn)，以便及時(shí)發(fā)現(xiàn)生產(chǎn)中的質(zhì)量波動(dòng)情況，注射用鹽酸平陽(yáng)霉素殘留溶劑檢出量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于標(biāo)準(zhǔn)限度，標(biāo)準(zhǔn)中無(wú)需增加殘留溶劑檢查項(xiàng)。

參 考 文 獻(xiàn)

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