莫斯柯 黃麗霞 鄭晶 魏東山 胡潤磊*

目前，我國肺癌的發(fā)病率仍居惡性腫瘤首位［1］。其治療以手術治療、化學治療以及放射治療為主，免疫治療、靶向治療及中醫(yī)中藥治療也成為肺癌研究的前沿［2-3］。磁流體熱療（magnetic fluid hyperthermia，MFH）是將磁流體通過直接注射至腫瘤部位或動靜脈注射的方式到達腫瘤區(qū)域，外加交變磁場（alternating magnetic field，AMF）作用，能夠將電場的能量集中到磁流體聚集的特定部位并升至一定溫度，從而通過變性、折疊和蛋白質(zhì)聚集等方式［4］殺死癌細胞，而周圍正常組織無磁流體的分布，不產(chǎn)生升溫效果，因而具有高度的靶向性［5］。此外，納米磁流體還可以作為靶向治療的載體［6］，通過外部磁場梯度引導其到特定的靶區(qū)域，從而實現(xiàn)藥物的靶向運輸［7］。我國率先將磁流體與肺癌一線化療藥物—紫杉醇，通過特定的方法共聚合成納米紫杉醇磁流體。本文探討納米紫杉醇磁流體熱化療治療肺癌的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料及動物 （1）主要試劑：四唑氮鹽（MTT），二甲亞砜（DMSO），胰蛋白酶，細胞培養(yǎng)基粉（RPMI1640）、TUNEL 試劑盒、流式細胞術試劑盒、注射用紫杉醇。（2）細胞株：人肺癌A549 細胞株，用含10%胎牛血清RPMI1640 培養(yǎng)液，分別加入終濃度為100U/mL 的青霉素和鏈霉素，37.0℃，5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)。（3）納米級Fe3O4紫杉醇磁流體：采用化學共沉淀法制成膠體混懸液，混懸液中，磁性粒子最終濃度為20 mg/mL，樣品粒徑范圍約為46 nm，紫杉醇在磁流體中的濃度為1.56μmoL/mL，磁飽和強度是360 GS。樣品使用前均以超聲波處理5 min，該操作確保Fe3O4顆粒分布更均勻。（4）實驗動物：4～5 周齡BALB/C 雌性裸小鼠32 只，質(zhì)量20～24 g，浙江省醫(yī)學科學院動物實驗中心提供并飼養(yǎng)，實驗動物生產(chǎn)許可證SCXK（浙）2008-0035。飼養(yǎng)于浙江省實驗動物中心實驗動物屏障系統(tǒng)，空氣潔凈度萬級，換氣次數(shù)15 次/h，溫度21～24℃，濕度75%～80%。實驗動物使用許可證SYXK（浙）2008-0113。（5）主要儀器設備：①高頻感應加熱機：型號：SP-04AC 4KW，深圳市雙平電源技術有限公司提供。頻率為100～250 KHz，感應線圈，由4 匝直徑為4 mm 的銅管平行繞成內(nèi)徑為3 cm，長為4 cm 的線圈，銅管內(nèi)通循環(huán)水。②測溫設備：光纖溫度傳感器（YF-200），西安永泰傳感有限公司提供。③流式細胞儀：FACSCalibur 型，美國BD 公司產(chǎn)品。④透射電鏡：JEM-1230 型透射電鏡，日本JEOL 公司。

1.2 方法 （1）細胞實驗：取對數(shù)生長的人肺癌細胞A549，將細胞調(diào)成1×105/mL 的濃度，設置對照組、磁流體熱療組、化療組及磁熱化療組。對照組小鼠不予以處理，磁流體熱療組的細胞加入3 mL（2 mg）的磁流體的培養(yǎng)液，磁場中作用30 min，溫度控制在30℃，將化療組細胞懸液按分組C1、C2、C3 順序加入納米紫杉醇的培養(yǎng)液中，使終濃度分別為3.3 mg/mL、6.6 mg/mL、13.2 mg/mL，磁熱化療組按分組D1、D2、D3 順序加入納米紫杉醇磁流體的培養(yǎng)液中，使終濃度分別為3.3 mg/mL、6.6 mg/mL、13.2 mg/mL，交變磁場作用30 min，溫度控制43℃。各組均在第0 h、12 h、24 h、48 h、72 h 取細胞，應用胰蛋白酶消化后形成單細胞懸液，倒置顯微鏡下用血細胞計數(shù)板采用盲法計數(shù)，繪制成生長曲線。比較四組的生長曲線，并用MTT 法觀察人肺癌活細胞的光密度值（OD）及殺傷率（CI），流式細胞儀檢測各組肺癌細胞的細胞周期及凋亡率；應用光學顯微鏡比較組間細胞形態(tài)差異。（2）動物實驗：提取對數(shù)生長期的人肺癌A549 細胞，應用胰蛋白酶進行消化，經(jīng)過稀釋后，在小鼠背部皮下注射0.2 mL。待注射后的荷瘤小鼠腫瘤結節(jié)長至平均直徑約5 mm 時，實驗員將其隨機分為對照組、磁流體熱療組、化療組及磁熱化療組。對照組：不做任何治療。磁流體熱療組：向裸鼠肺癌模型內(nèi)部注射20 mg 的磁流體，24 h 后在交變磁場下熱療，通過調(diào)節(jié)磁場強度將溫度控制在43℃，熱療30 min。紫杉醇化療組：向小鼠腫瘤內(nèi)部注射2 mg 紫杉醇。磁熱化療組：向腫瘤內(nèi)部注射納米紫杉醇磁流體20 mg，24 h后在交變磁場下熱療，通過調(diào)節(jié)磁場強度將溫度控制在43℃，熱化療30 min。觀察四組荷瘤小鼠的一般情況，比較治療前后瘤體重量變化，在不同時間點使用游標卡尺測量腫瘤結節(jié)的長徑（a）、短徑（b），按公式V=ab2/2，估算腫瘤近似體積，根據(jù)每日測得的腫瘤體積繪制生長曲線。此外，借助光學顯微鏡觀察各組腫瘤細胞內(nèi)部變化，從而比較各個組間的療效差異。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0 統(tǒng)計軟件分析，計量資料用（±s）表示，多組間比較用方差分析，組間兩兩比較用LSD 檢驗；計數(shù)資料用%表示，用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 納米紫杉醇磁流體一般參數(shù) 磁性粒子的終濃度為20 mg/mL 左右。用激光散射測得粒子粒徑（DLS）約在46 nm 左右，TEM 圖中粒徑為10 nm 左右，內(nèi)核磁性納米顆粒的直徑為10 nm。使用VSM 的儀器測試飽和磁化強度，包覆前的磁性粒子飽和磁化強度為70 emu/g，包覆后為39 emu/g。紫杉醇在磁流體中的濃度為1.56μmol/mL（見圖1～2）。

圖1 粒徑約46 nm左右納米紫杉醇磁流體

圖2 納米紫杉醇的飽和磁化強度

2.2 人肺癌細胞A549 的生長曲線 隨著時間延長，對照組和磁流體熱療組肺癌細胞增加明顯，磁流體熱療組比對照組細胞生長僅輕度受到抑制；化療組（C1，C2，C3）、磁熱化療組（D1，D2，D3）人肺癌細胞增長均受到明顯抑制，其抑制效果與紫杉醇濃度的增加明顯相關（見圖3）。

圖3 各組人肺癌細胞A549生長曲線比較

2.3 各組人肺癌細胞A549 的OD 及CI 化療組和磁熱化療組，隨著藥物濃度的增加，OD 值隨之減小，CI 值增大，在同等藥物濃度下，熱化療組中肺癌細胞的OD值和CI 值均與其他各組差異有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）見表1。

表1 各組人肺癌細胞A549的OD及CI比較

2.4 流式細胞儀檢測人肺癌細胞A549 的凋亡率及細胞周期 流式細胞儀檢測人肺癌細胞A549 的凋亡率顯示，磁熱化療組凋亡率均高于其他組，且與紫杉醇濃度呈現(xiàn)劑量-反應關系（見圖4）。細胞周期結果顯示，與對照組比較，在化療組中，人肺癌細胞A549 細胞在G2/M 期（合成后期/分裂期）增加；在磁流體熱療組和磁熱化療組，A549 細胞在S 期（合成期）明顯增加（P＜0.05）（見圖5）。

圖4 各組人肺癌細胞凋亡率

圖5 各組人肺癌細胞周期圖

2.5 光鏡和電子顯微鏡觀察細胞形態(tài) 在光學顯微鏡下可見對照組內(nèi)細胞大小未見明顯變化，細胞數(shù)量多、貼壁良好。磁流體熱療組細胞開始出現(xiàn)減少，開始出現(xiàn)壞死細胞；化療組（C1、C2、C3 組）隨著紫杉醇濃度的升高，其正常細胞逐漸減少、壞死細胞及細胞碎片逐漸增多、細胞貼壁逐漸減少甚至出現(xiàn)無貼壁現(xiàn)象；磁熱化療組（D1、D2、D3 組）細胞破碎現(xiàn)象更突出，在D3 組甚至只見材料而無細胞（見圖6）。電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，化療組和磁熱化療組細胞染色質(zhì)濃集、胞漿空泡化、細胞核裂解；隨著溫度的升高，細胞核呈現(xiàn)溶解，正常細胞結構消失，呈壞死表現(xiàn)（見圖7）。

圖6 光鏡觀察各組人肺癌細胞圖像

圖7 磁熱化療后肺癌細胞電鏡圖像

2.6 小鼠接種腫瘤的一般情況 將24 只裸鼠接種腫瘤，成瘤率100%，成瘤時間為細胞種植后第4～13 天，主要集中在第8～10 天。腫瘤細胞種植后第21 天，腫瘤直徑平均達6 mm。成瘤后早期裸鼠的體質(zhì)量和活動情況無明顯改變，腫瘤有效種植后逐漸增大，與此同時裸鼠逐漸出現(xiàn)精神疲軟、消瘦、活動量減少等現(xiàn)象。

2.7 磁流體在腫瘤內(nèi)部升溫情況 實驗過程順利，瘤體內(nèi)部的溫度迅速升高至43.0℃，通過控制磁場強度將溫度穩(wěn)定在43.0℃左右，并維持30 min，而小鼠肛門的溫度則穩(wěn)定在32.0℃左右。見圖8。

圖8 瘤體內(nèi)部和小鼠肛門溫度變化

2.8 組織學變化 （1）大體觀察：治療后，對照組腫瘤呈進行性增長，呈橢圓形，體積隨時間增長，且表面無異常；磁流體熱療組大部分瘤體表面破潰后結痂，2～3 d 后出現(xiàn)局部壞死，壞死脫落后表面潰爛，腫瘤生長緩慢；化療組腫瘤表面無明顯變化，生長明顯減慢；磁熱化療組瘤體生長基本停滯，且腫瘤表面較磁流體熱療組破潰面積大，并出現(xiàn)表淺潰瘍，愈合結痂時間延長。（2）光鏡觀察：對照組瘤體生長旺盛，細胞核濃染，偶而可見核分裂象，腫瘤中心部位可見少量壞死的組織。磁流體熱療組、化療組以及磁熱化療組的瘤體出現(xiàn)大量呈凋亡形態(tài)的腫瘤細胞，表現(xiàn)為細胞核縮小、發(fā)生凝聚，染色質(zhì)邊聚；部分區(qū)域出現(xiàn)凝固性壞死的征象，表現(xiàn)為嗜酸性增強，失去正常細胞結構，出現(xiàn)核碎裂、核溶解等壞死樣表現(xiàn)；同時在一些區(qū)域偶可見出血灶。光鏡下可見磁流體主要積聚于凋亡和壞死的區(qū)域中。細胞大量凋亡壞死的現(xiàn)象在熱化療組中最明顯。散在的磁流體在一定范圍內(nèi)分布于腫瘤細胞之間（見圖9）。

圖9 各組瘤體病理學變化（HE×100）

2.9 各組小鼠治療效果 治療后2 周，與對照組比較，化療組和磁熱化療組體積變化差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與對照組比較，化療組和磁熱化療組瘤體重量差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。表2。

表2 熱療后2周各組小鼠瘤體體積和質(zhì)量

3 討論

20 世紀70 年代以來，較多的臨床前研究已經(jīng)證實熱療相關作用，其機制包括直接細胞毒作用、熱誘導腫瘤微環(huán)境的改變、熱與輻射和藥物的協(xié)同作用等［8］，其中和藥物的協(xié)同作用也已在多種癌癥相關的臨床研究中得到證實，較為典型的有異環(huán)磷酰胺聯(lián)合熱療治療晚期軟組織肉瘤［9］、熱灌注加用美法侖治療黑色素瘤［10］等，多種熱療的形式聯(lián)合化療藥物在臨床上有較好的應用。

本研究結果顯示，在細胞實驗中，磁流體熱療組、化療組、磁熱化療組細胞生長曲線及凋亡率與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義，表現(xiàn)為明顯的抑制，其中磁熱化療組的抑制作用最明顯，且隨著紫杉醇的增加，其聯(lián)合抑制作用更明顯。在小鼠實驗中，測量腫瘤內(nèi)部溫度和肛門溫度，發(fā)現(xiàn)磁流體加熱過程中，兩者溫度差異有統(tǒng)計學意義，可見磁流體熱療可以實現(xiàn)局部加熱，而周圍未注射磁流體的區(qū)域升溫不明顯，本實驗通過測量腫瘤體積及質(zhì)量以及光鏡下組織學改變，進一步證實磁流體熱化療對腫瘤生長較強的抑制作用。

磁流體熱化療可能存在多種機制，作者認為，升溫可以增加化療藥物的細胞毒性作用，同時也可以增加腫瘤部位的局部血流，增加腫瘤對化療藥物的攝取，升溫甚至可能使某些DNA 聚合酶降低活性或失去活性，可以更好抑制腫瘤細胞的修復作用［11］。

綜上所述，磁流體熱化療是應用磁流體熱療與化療藥物的聯(lián)合，這種技術不僅能局部靶向加熱腫瘤，同時借助磁流體更好的靶向運輸化療藥物，比傳統(tǒng)意義上的熱化療（如熱灌注化療等）有了一定的進步。磁流體熱化療殺傷腫瘤細胞有較大的價值，但離真正應用于臨床尚有一定的距離，如磁流體的劑量、濃度及國際標準問題，磁流體熱化療對于人體安全性的問題，實現(xiàn)人體磁流體熱化療的具體措施問題還需要更多的研究。