王銘潔 徐潮陽 黃黎明 徐峰*

乳腺癌是目前我國女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，近年來發(fā)病率快速上升［1］。非特殊型浸潤性乳腺癌占所有乳腺惡性腫瘤的70%～80%，該類癌癥分化較低，惡性程度和死亡率較高，預(yù)后較差［2］。目前，乳腺癌的治療方法為手術(shù)、放化療、內(nèi)分泌治療、靶向治療以及免疫治療，但總體預(yù)后不佳［3］。近年研究表明，HES3蛋白參與多種生物學(xué)過程，包括腫瘤發(fā)生、細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖。HES3 蛋白表達(dá)在多種人類腫瘤中失調(diào)，常見有肺癌［4］、橫紋肌肉瘤［5］。研究表明，在肺癌和橫紋肌肉瘤中，HES3 蛋白過表達(dá)與淋巴轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良相關(guān)。本研究分析HES3 蛋白表達(dá)與乳腺癌的臨床病理學(xué)參數(shù)的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2021 年11 月至2022 年12 月紹興市人民醫(yī)院乳腺癌根治術(shù)治療的114 例女性患者手術(shù)切除標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：①具有完整臨床資料并接受過乳腺癌根治術(shù)的女性患者；②病理確診斷為乳腺癌。排除術(shù)前接受過放療或化療的患者。患者年齡25～85 歲，平均56.84 歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2 方法 （1）收集患者的臨床資料，包括年齡、HES3、Ki-67、多灶、腫瘤最大徑等。（2）采用免疫組織化學(xué)（IHC）方法檢測乳腺癌組織中HES3 蛋白的表達(dá)水平。用甲醛固定標(biāo)本并包埋在石蠟中。將石蠟切片在二甲苯中脫蠟，并使用梯度乙醇（100%、95%、95%、80%、70%和50%乙醇）脫水，在室溫下洗滌5 min，然后用ddH2O 洗滌2 次。為淬滅內(nèi)源性過氧化物酶的活性，切片用0.3% H2O2甲醇溶液處理5 min。開始IHC分析前，將切片浸入95℃的10 mmol/L 檸檬酸鹽緩沖液（pH=6.1）中15 min，以回收抗原。通過用10%胎牛血清預(yù)孵育切片阻斷非特異性抗體結(jié)合（GibcoThermo Fisher Scientific，Inc.）在PBS 中與0.01%疊氮化鈉在室溫下孵育30 min，然后將切片與針對HES3 的抗體在4℃過夜。用PBS 洗滌3 次后，將切片與EnVision-HRP復(fù)合物（未稀釋；達(dá)科；Agilent Technologies，Inc.）在室溫下放置1 h。然后將切片在室溫下用二氨基聯(lián)苯胺染色25 s，并在室溫下用蘇木精復(fù)染5 min。用PBS 代替HES3 作為陰性對照。將表現(xiàn)出高水平的HES3 的肺癌組織用作陽性對照。所有IHC 分析步驟均在同一實驗室進(jìn)行。根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度評分和陽性細(xì)胞百分比評分的乘積半定量評估表達(dá)水平。染色結(jié)果由兩名獨立觀察者確定，以避免主觀偏見。染色強(qiáng)度表示染色腫瘤細(xì)胞的平均強(qiáng)度，按0（無染色）、1（弱染色）、2（中度染色）和3（強(qiáng)染色）的比例縮放，分別記0、1、2、3分。陽性細(xì)胞百分比評分：0%＜陽性率≥25%計1 分，25%＜陽性率≤50%計2 分，50%＜陽性率≤75%計3 分，75%＜陽性率≤100%計4 分。計算兩個分?jǐn)?shù)乘積以獲得最終分?jǐn)?shù)，范圍為0～12 分。在光鏡下對每份標(biāo)本隨機(jī)抽取3 個視野，采用其平均值進(jìn)行最終分析。HES3 蛋白陽性表達(dá)定義為總分≥5 分。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS25.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，用t檢驗。計數(shù)資料用n（%）表示，用χ2檢驗。多因素分析采用Logistic 回歸分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HES3 蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá) 114 例標(biāo)本中，有26 例（22.8%）HES3 蛋白在乳腺癌標(biāo)本中表達(dá)。見圖1。

圖1 HES3在乳腺癌組織中的表達(dá)

2.2 HES3 表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性 與HES3 陰性患者比較，HES3 陽性患者淋巴轉(zhuǎn)移率高（P=0.001），腫瘤較大（P＜0.001）。見表1。

表1 HES3陰性與陽性乳腺癌患者臨床病理特征

2.3 乳腺癌淋巴轉(zhuǎn)移的單因素分析 見表2。

表2 乳腺癌淋巴轉(zhuǎn)移的單因素分析

2.4 乳腺癌淋巴轉(zhuǎn)移的多因素分析 腫瘤大小和HES3 是乳腺癌淋巴轉(zhuǎn)移的獨立危險因素。見表3。

表3 乳腺癌淋巴轉(zhuǎn)移的多因素分析

3 討論

乳腺癌作為常見的惡性腫瘤之一，在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率不斷升高［6］。在乳腺癌中，淋巴轉(zhuǎn)移與癌癥預(yù)后相關(guān)，是影響乳腺癌預(yù)后的獨立危險因素［7］。然而，由于大部分患者確診時已存在淋巴轉(zhuǎn)移，乳腺癌的總體預(yù)后依然較差。因此，探索可以用于乳腺癌患者預(yù)后標(biāo)志物的新生物靶點尤為重要。HES3 的表達(dá)已經(jīng)在多種癌癥類型中得到廣泛驗證，如非小細(xì)胞性肺癌、橫紋肌肉瘤，大多數(shù)研究表明HES3 是患者預(yù)后較差的標(biāo)志物［8］。HES3 可以促進(jìn)多種人類上皮性腫瘤和神經(jīng)源性腫瘤的增殖、遷移和侵襲，是未來治療性干預(yù)的一個有前途的靶點［9］。

本研究發(fā)現(xiàn)HES3 蛋白表達(dá)與乳腺癌淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)，HES3 高表達(dá)是乳腺癌的不良預(yù)后因素，可作為指導(dǎo)乳腺癌治療和評估預(yù)后的指標(biāo)。大量研究認(rèn)為淋巴轉(zhuǎn)移是影響乳腺癌預(yù)后的獨立危險因素，而HES3 蛋白有望成為影響乳腺癌預(yù)后新的標(biāo)志物。在未來的研究中，應(yīng)繼續(xù)探索HES3 參與影響乳腺癌的分子機(jī)制和途徑。