李心如,盛先杰,楊琰,安振濤,康安,李慧,葛飛

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)翰林學(xué)院附屬海安市中醫(yī)院,江蘇 南通 226600;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇 南京 210023;3.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,江蘇省中醫(yī)藥研究院,江蘇 南京 210028)

腸道菌群是一類寄居在胃腸道內(nèi)的微生物的總稱,專性厭氧菌是其中的優(yōu)勢菌群。絕大多數(shù)腸道菌群由5個門組成:擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)和疣微菌門(Verrucomicrobia)[1-2]。其中,擬桿菌門和厚壁菌門的數(shù)量最多,占腸道菌群數(shù)量的90%以上。正常情況下,腸道菌群通過反饋機(jī)制來維持菌群間的動態(tài)平衡[3],并通過產(chǎn)生代謝物和一些信號分子與宿主進(jìn)行相互作用[1]。常見的腸道菌群代謝物有短鏈脂肪酸(SCFAs)、膽汁酸(BAs)、胺類、吲哚及其衍生物等[4]。

短鏈脂肪酸又稱揮發(fā)性脂肪酸,是由腸道微生物通過降解膳食纖維等機(jī)體無法代謝的食物而生成的2～6個碳原子的飽和脂肪族有機(jī)酸,主要包括丁酸、丙酸、乙酸、異丁酸、戊酸和己酸[5]。短鏈脂肪酸可激活G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)改善宿主腸道炎癥[6],治療結(jié)直腸癌[7]以及調(diào)節(jié)胰島素分泌[8-9]。膽汁酸是由膽固醇合成的一種兩親分子,按來源可分為初級膽汁酸和次級膽汁酸2種[10]。其中,初級膽汁酸是在肝臟中由膽固醇直接合成而來,次級膽汁酸是在腸道中由腸道微生物代謝修飾而來[11]。最近研究表明,膽汁酸及短鏈脂肪酸與機(jī)體的免疫、腸道微環(huán)境等密切相關(guān)[12-13],如次級膽汁酸石膽酸和脫氧膽酸可通過激活法尼醇X受體(FXR)和G蛋白膽汁酸受體1(GPBAR1)發(fā)揮保護(hù)腸黏膜屏障和抗炎作用[14];丁酸等可通過三羧酸循環(huán)及激活編碼緊密連接成分的基因和轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)腸屏障的完整性[15],進(jìn)而改善腹痛腹瀉癥狀。這些內(nèi)源性物質(zhì)的變化與菌群密切相關(guān)。

清熱燥濕類中藥臨床上多用于治療濕熱病證,即濕熱引起的腹痛腹脹,大便稀爛熱臭,舌苔黃膩等癥。黃連、黃芩、黃柏和苦參是常見的清熱燥濕類中藥。之前的研究表明黃連、黃芩、黃柏和苦參具有多種藥理活性,可以起到抗菌的作用[16-19]并能夠調(diào)節(jié)膽汁酸的代謝。此外,黃連、黃柏、黃芩和苦參能通過改變腸道菌群、膽汁酸和短鏈脂肪酸等的代謝改善一些臨床常見病癥,如高脂血癥[20-21]和2型糖尿病[22-23]。但長期給予臨床等效劑量的藥物對正常動物體內(nèi)的腸道菌群、膽汁酸代謝和短鏈脂肪酸代謝的影響尚未見報道。本實驗擬研究黃連、黃柏、黃芩和苦參在長期臨床等效劑量下對正常小鼠腸道菌群、膽汁酸及短鏈脂肪酸的影響,為清熱燥濕類中藥的研究及其合理應(yīng)用提供科學(xué)證據(jù)。

1 材料

1.1 動物

30只SPF級Balb/c小鼠,雄性,購自于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司。飼養(yǎng)于溫度為(22±2)℃,相對濕度為50%的環(huán)境內(nèi)。飼養(yǎng)期間自由攝食、飲水,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后用于實驗。實驗動物許可證號:SCXK(京)2019-0010。經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理中心批準(zhǔn),批準(zhǔn)號:202006A034。

1.2 藥物與試劑

黃柏(批號:20201001)、苦參(批號:20200501)、黃連(批號:20201101)、黃芩(批號:20201201)均購自安徽桐花堂中藥飲片科技有限公司,符合《中國藥典》2020版一部及四部執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)。丙酸(PA,貨號:P0500)、異丁酸(IBA,貨號:I0103)、丁酸(BA,貨號:B0754)、戊酸(VA,貨號:V0003)、異戊酸(IVA,貨號:M0182)、乙酸(AA,貨號:A3377)均購自梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司;氘代己酸(CA-d3,貨號:489727)購自Sigma-Aldrich公司;石膽酸(LCA,貨號:B28100)、?；切苋パ跄懰?TUDCA,貨號:B20921)、甘氨鵝脫氧膽酸(GCDCA,貨號:B24724)、牛磺鵝脫氧膽酸(TCDCA,貨號:B20919)、?；敲撗跄懰徕c(TDCA,貨號:B23672)、甘氨豬去氧膽酸(GHDCA,貨號:B27133)、甘氨熊脫氧膽酸(GUDCA,貨號:B32965)、?；秦i去氧膽酸(THDCA,貨號:B26449)、甘氨膽酸(GCA,貨號:B27078)、?；悄懰?TCA,貨號:B26949)、去氧膽酸(DCA,貨號:B21032)、甘氨脫氧膽酸鈉(GDCA,貨號:B27134)、ω-鼠膽酸(ω-MAC,貨號:S22144)、?；?α-鼠膽酸(T-α-MCA,貨號:B7450)均購自于上海源葉生物科技有限公司;去氫膽酸(Dehydro-CA,貨號:30830)、熊去氧膽酸(UDCA,貨號:U5127)、豬去氧膽酸(HDCA,貨號:H3878)、膽酸(CA,貨號:C1129)、鵝去氧膽酸(CDCA,貨號:C9377)、α-鼠膽酸(α-MCA,貨號:700232P)、β-鼠膽酸(β-MCA,貨號:SML2372)均購自Sigma-Aldrich公司;內(nèi)標(biāo)為氘代甘氨膽酸(GCA-d4,貨號:SCSI-406054)購自上海賽可銳生物科技有限公司;氘代去氧膽酸(CDCA-d4,貨號:G466261)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

甲醇(色譜純)購自德國Merck公司,甲酸(色譜級)購買于阿拉丁公司,超純水(實驗室自制)。

1.3 儀器

ER-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)、Sorvall Legend Micro21R微量離心機(jī)(美國Thermo Fisher Scientific公司)、SHIMADZU LC-30AD高效液相系統(tǒng)(日本島津公司)、Triple QuadTM4500質(zhì)譜系統(tǒng)(AB Sciex)、超純水儀(美國Millipore公司)、電子分析天平(天津天馬衡基儀器有限公司)。

2 方法

2.1 黃連、黃芩、黃柏和苦參水提物的制備

稱取藥材黃芩、黃連、黃柏和苦參各100 g。分別加入10倍、8倍體積水,煎煮2次,每次1 h。合并煎液、過濾,濾液60 ℃減壓濃縮至濃度分別為生藥量1 g·mL-1,滅菌密封保存,待用。

2.2 動物分組與處理

小鼠隨機(jī)分成5組,分別為對照組(C,6只),苦參組(KS,6只),黃柏組(HB,6只),黃連組(HL,6只)和黃芩組(HQ,6只)。苦參組、黃柏組、黃連組和黃芩組分別灌胃給予2.34、3.12、1.3 g·kg-1和2.6 g·kg-1,給藥體積10 mL·kg-1,每日給藥1次,共14 d,給藥劑量均為臨床等效劑量。給藥結(jié)束后收集小鼠糞便,-80 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 膽汁酸的檢測

精密稱取LCA、UDCA、CDCA、HDCA、DCA、Dehydro-CA、CA、GUDCA、GCDCA、GDCA、GHDCA、GCA、TDCA、THDCA、TUDCA、TCDCA、TCA、α-MCA、β-MCA、ω-MAC、T-α-MCA對照品適量,用甲醇溶解,制備成濃度為約1.0 mg·mL-1的儲備液,于4 ℃儲存?zhèn)溆?。?0%乙腈稀釋配制一系列的混合標(biāo)準(zhǔn)曲線。所有樣品進(jìn)樣前均于4 ℃下保存。內(nèi)標(biāo)采用CDCA-d4,GCA-d4。

稱取糞便樣品約50 mg于2 mL離心管中,于冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥后再次稱定糞便質(zhì)量,加19倍體積的50%乙腈,渦旋震蕩5 min并在4 ℃下以12 000g離心10 min。吸取上清40 μL加80 μL乙腈(內(nèi)標(biāo)濃度為375 μg·mL-1),渦旋震蕩5 min并在4 ℃下以12 000g離心10 min,吸取上清進(jìn)樣。

色譜條件:色譜柱為Thermo Fisher Hypersil Gold(100 mm×2.1 mm,3 μm);柱溫:40 ℃;流動相(A):0.1% 甲酸水溶液,流動相(B):乙腈∶甲醇∶甲酸=95∶5∶0.1;進(jìn)樣量3 μL;流速:0.4 mL·min-1;梯度洗脫:0～3 min,15%B;3～10 min,15%→28%B;10～19 min,28%→55%B;19～25 min,55%→90%B;25～27 min,90%B;27～27.5 min,90%→15%B。

質(zhì)譜條件:采用電噴霧離子源(ESI),離子源溫度(TEM)550 ℃,氣簾氣(CUR)30 psi,霧化氣(GS1)55 psi,輔助加熱氣(GS2)55 psi,離子源噴霧電壓(IS)-4 500 V。待測物及內(nèi)標(biāo)的監(jiān)測離子對、優(yōu)化去簇電壓(DP)、碰撞電壓(CE)以及碰撞室射出電壓(CXP),如表1所示。

表1 膽汁酸及內(nèi)標(biāo)的LC-MS/MS參數(shù)Table 1 LC-MS/MS parameters for bile acids and internal standard

2.4 短鏈脂肪酸檢測

精密稱取乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、異戊酸和戊酸對照品適量,配制成適量系列濃度的對照品溶液。

稱取糞便樣品約50 mg,加入19倍體積50%乙腈,渦旋振蕩至完全混勻后在12 000g,4 ℃條件下離心10 min。取40 μL上清與5 μL 1 μg·mL-1氘代己酸、20 μL 3-硝基苯肼和20 μL EDC-6%吡啶溶液混合,40 ℃反應(yīng)30 min,12 000g,離心10 min取上清,根據(jù)不同SCFAs濃度水平,稀釋不同倍數(shù)后進(jìn)樣。

色譜條件:色譜柱為Thermo Fisher Hypersil Gold(100 mm×2.1 mm,3 μm);柱溫:40 ℃;流動相:水相(A)為0.1%甲酸-水溶液,有機(jī)相(B)為乙腈;進(jìn)樣量3 μL;流速:0.35 mL·min-1;梯度洗脫:0～1 min,10%B;1～11 min,10%→35%B;11～14 min,35%→90% B;14～15.5 min, 90%B;15.5～16.5 min,10%B;16.3～18 min,10%B。

質(zhì)譜條件:采用電噴霧離子源(ESI),離子源溫度(TEM)550 ℃,氣簾氣(CUR)30 psi,霧化氣(GS1)55 psi,輔助加熱氣(GS2)55 psi,離子源噴霧電壓(IS)-4 500 V。待測物的監(jiān)測離子對信息如下:AA,194.1→137.1;PA,208.1→165.1;BA、IBA,222.1→137.1;VA、IVA,236.1→137.1。

2.5 腸道內(nèi)容物樣本采集及腸道菌群測序分析

各組小鼠脫臼處死后,取小鼠結(jié)腸內(nèi)容物樣品約0.2 g,提取糞便基因組,由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司采用Illumina MiSeq平臺(Illumina, San Diego, USA)對其16S rRNA的V3～V4高變區(qū)進(jìn)行微生物多樣性檢測。將統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)上傳至美吉生信云分析平臺進(jìn)行后續(xù)分析。

2.6 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié)果

3.1 黃連、黃芩、黃柏和苦參對小鼠腸道短鏈脂肪酸的影響

黃連、黃芩、黃柏和苦參組小鼠腸道短鏈脂肪酸含量如圖1所示。黃連組乙酸、戊酸、異戊酸、異丁酸、丙酸水平均有下降趨勢;黃芩組乙酸、丁酸、異戊酸和異丁酸水平均呈現(xiàn)上升趨勢,丙酸水平呈現(xiàn)下降趨勢;黃柏組乙酸、戊酸、丁酸、丙酸水平均呈現(xiàn)上升趨勢,異戊酸水平呈現(xiàn)下降趨勢;苦參組戊酸、丁酸、異戊酸、異丁酸水平均呈現(xiàn)上升趨勢,乙酸、丙酸水平呈現(xiàn)下降趨勢。但各組短鏈脂肪酸含量與正常組相比均無顯著性差異。

圖1 黃連、黃芩、黃柏和苦參組小鼠短鏈脂肪酸含量圖Fig.1 Content of short-chain fatty acids in mice of HL, HQ, HB and KS groups

3.2 黃連、黃芩、黃柏和苦參對小鼠糞便膽汁酸的影響

3.2.1 PCA分析和聚類分析 圖2是將對照組、黃連組、黃芩組、黃柏組和苦參組小鼠糞便膽汁酸做PCA分析(圖2A)和聚類分析(圖2B)。PCA結(jié)果顯示與對照組相比,各組膽汁酸變化無顯著性差異。聚類熱圖分析結(jié)果顯示,在我們所檢測的23種膽汁酸中,黃柏組有14種膽汁酸出現(xiàn)下調(diào),有9種膽汁酸出現(xiàn)上調(diào);黃連組有13種膽汁酸出現(xiàn)下調(diào),8種膽汁酸出現(xiàn)上調(diào);黃芩組有15種膽汁酸出現(xiàn)下調(diào),有8種膽汁酸出現(xiàn)上調(diào);苦參組有10種膽汁酸出現(xiàn)下調(diào),13種膽汁酸出現(xiàn)上調(diào)。

圖2 黃連、黃芩、黃柏和苦參組小鼠膽汁酸PCA圖(A)和熱圖(B)Fig.2 PCA (A) and Heatmap (B) of bile acids in mice of HL, HQ, HB and KS groups

3.2.2 差異膽汁酸分析 黃連、黃芩、黃柏和苦參組小鼠糞便中差異膽汁酸含量如圖3所示。與正常組相比,黃連組小鼠糞便中鵝去氧膽酸(P<0.05)和熊去氧膽酸(P<0.05)含量顯著降低;黃芩組小鼠糞便中去氫膽酸(P<0.05)含量顯著上升,?；秦i去氧膽酸(P<0.05)、牛磺熊去氧膽酸(P<0.01)、?；蛆Z脫氧膽酸(P<0.05)含量顯著降低;黃柏組小鼠糞便中鵝去氧膽酸(P<0.05)的含量降低;苦參組小鼠糞便中β-鼠膽酸(P<0.05)、ω-鼠膽酸(P<0.05)的含量顯著降低,而甘氨鵝脫氧膽酸(P<0.05)的含量上升。

注:*P<0.05,**P<0.01。圖3 黃連、黃芩、黃柏和苦參組小鼠糞便中差異膽汁酸含量圖Fig.3 Bile acid content differences in feces of mice in HL,HQ,HB and KS groups

3.3 黃連、黃芩、黃柏和苦參對小鼠腸道菌群的影響

3.3.1 多樣性分析 通過對對照組、黃連組、黃芩組、黃柏組和苦參組小鼠回腸微生物樣品的16S rRNA基因序列分析,確定了黃連、黃芩、黃柏和苦參對腸道微生物區(qū)系整體結(jié)構(gòu)的影響。α多樣性分析結(jié)果表明(表2),與空白組比較,苦參組腸道菌群α多樣性指數(shù)呈升高趨勢;黃柏組、黃連組和黃芩組腸道菌群α多樣性指數(shù)呈下降趨勢,且黃連組具有顯著性差異(P<0.01,P<0.000 1)。β多樣性分析結(jié)果表明(PCA和PCoA分析),每個給藥組的腸道微生物群落均存在明顯的聚集(圖4)。在長期給予正常小鼠藥效劑量的中藥后,小鼠的腸道菌群發(fā)生了顯著變化。

圖4 黃連、黃芩、黃柏和苦參組小鼠腸道菌群PCA(A)和PCoA(B)圖Fig.4 PCA (A) and PCoA (B) of intestinal flora of mice in HL,HQ,HB and KS groups

表2 黃連、黃芩、黃柏和苦參組小鼠腸道菌群α多樣性指數(shù)比較Table 2 Comparison of intestinal flora α diversity indices of mice in HL,HQ,HB and KS

3.3.2 物種組成及差異分析 在門水平上,厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidota)是小鼠腸道的優(yōu)勢菌門,占全部微生物群的80%以上,其次是脫硫菌屬(Desulfobacterota)和疣微菌門(Verrucomicrobiota)(圖5A)。除苦參組外,黃連組、黃芩組和黃柏組小鼠厚壁菌門(Firmicutes)均呈現(xiàn)下降趨勢,擬桿菌門(Bacteroidota)均呈現(xiàn)上升趨勢,且黃連組變化更顯著。在屬水平上,不同中藥組小鼠腸道微生物群落組成存在差異(圖5B～F)。黃連組擬桿菌屬(Bacteroides)(P<0.05)等豐度上調(diào),梭菌目UCG-014(norank_f__norank_o__Clostridia_UCG-014)(P<0.05)、另枝菌屬(Alistipes)(P<0.05)和臭味桿菌屬(Oddoribacter)(P<0.05)等豐度下調(diào),且均具有顯著性差異;黃芩組理研菌科RC9菌群(Rikenellaceae_RC9_gut_group)(P<0.05)豐度上調(diào);黃柏組梭菌目UCG-014(norank_f__norank_o__Clostridia_UCG-014)(P<0.05)、norank_f__norank_o__RF39(P<0.05)、norank_f__Eggerthellaceae(P<0.01)豐度下調(diào),Anaerostipes(P<0.05)豐度上調(diào)且具有顯著性差異;苦參組顫螺旋菌科(Oscillospiraceae)(P<0.05)豐度上調(diào),norank_f__Eggerthellaceae(P<0.05)、norank_f__norank_o__Chloroplast(P<0.05)豐度下調(diào)且具有顯著性差異。

注:A.門水平物種組成圖;B.屬水平物種組成圖;C～F.黃連、黃芩、黃柏和苦參組屬水平物種差異圖。*P<0.05,**P<0.01。圖5 黃連、黃芩、黃柏和苦參組小鼠物種組成與差異分析圖Fig.5 Species composition and difference analysis of mice in HL,HQ,HB and KS groups

3.3.3 相關(guān)性分析 將黃連、黃芩、黃柏和苦參組小鼠屬水平腸道菌群與短鏈脂肪酸(圖6A)和膽汁酸(圖6B)做相關(guān)性分析。在短鏈脂肪酸水平上,乙酸水平與Lachnoclostridium(P<0.05)呈負(fù)相關(guān)且具有顯著性差異;丁酸水平與Eubacterium_fissicatena_group(P<0.01)水平呈正相關(guān),與Streptococcus(P<0.01)水平呈負(fù)相關(guān)且具有顯著性差異;丙酸水平與norank_f__norank_o__Clostridia_vadinBB60_group(P<0.05)呈正相關(guān),與norank_f__Eubacterium_coprostanoligenes_group(P<0.05)、Streptococcus(P<0.05)呈負(fù)相關(guān);戊酸水平與Christensenellaceae_R-7_group(P<0.05)、norank_f__norank_o__RF39(P<0.05)呈正相關(guān)且均具有顯著性差異;異丁酸水平與Candidatus_Saccharimonas(P<0.05)、Christensenellaceae_R-7_group(P<0.05)、norank_f__norank_o__RF39(P<0.05)呈正相關(guān),與Bacteroides(P<0.05)、Streptococcus(P<0.05)呈負(fù)相關(guān)且均具有顯著性差異;異戊酸與Christensenellaceae_R-7_group(P<0.01)、norank_f__norank_o__RF39(P<0.05)呈正相關(guān),與Parabacteroids(P<0.05)呈負(fù)相關(guān);在膽汁酸水平上,鵝去氧膽酸水平與Bacteroides(P<0.05)呈負(fù)相關(guān),與norank_f__noranl_o_Clostridia_UCG-014(P<0.001)、Christensenellaceae_R-7_group(P<0.05)、norank_f__norank_o__RF39(P<0.001)呈正相關(guān),且均具有顯著性差異;熊去氧膽酸水平與Bacteroide(P<0.01)呈負(fù)相關(guān),與norank_f__noranl_o_Clostridia_UCG-014(P<0.001)、norank_f__norank_o__RF39(P<0.001)呈正相關(guān),且均具有統(tǒng)計學(xué)差異;去氫膽酸水平與Alloprevotella(P<0.05)、Prevotellaceae_UCG-001(P<0.05)呈負(fù)相關(guān),與Bifidobacterium(P<0.05)呈正相關(guān),且均具有統(tǒng)計學(xué)差異;?；秦i去氧膽酸水平與Desulfovibrio(P<0.05)呈負(fù)相關(guān),與Muribaculum(P<0.05)、Colidextribacter(P<0.05)、Anaeroplasma(P<0.05)呈正相關(guān);?；切苋パ跄懰崴脚cEubacterium_fissicatena_group(P<0.05)呈負(fù)相關(guān),與Lachnoclostridium(P<0.05)、Streptococcusc(P<0.01)、norank_f__Ruminococcaceae(P<0.05)呈正相關(guān),且均具有顯著性差異;?；蛆Z去氧膽酸水平與Desulfovibrio(P<0.05)呈負(fù)相關(guān)、與Streptococcus(P<0.05)呈正相關(guān),且均具有顯著性差異;β-鼠膽酸水平和Alloprevotella(P<0.05)、Anaeroplasma(P<0.01)呈負(fù)相關(guān),與GCA-900066575(P<0.05)呈正相關(guān),且均具有顯著性差異;ω-鼠膽酸水平和Alloprevotella(P<0.05)、Anaeroplasma(P<0.05)呈負(fù)相關(guān),與GCA-900066575(P<0.01)呈正相關(guān),且均具有顯著性差異;甘氨鵝去氧膽酸水平與Erysipelatoclostridium(P<0.01)、Alloprevotella(P<0.01)、Lachnoclostridum(P<0.01)等呈負(fù)相關(guān),與Christensenellaceae_R-7_group(P<0.01)、Ruminococcus(P<0.001)、norank_f__Oscillospiraceae(P<0.01)等呈正相關(guān),且均具有顯著性差異。

注:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。圖6 黃連、黃芩、黃柏和苦參組小鼠屬水平腸道菌群與短鏈脂肪酸(A)和膽汁酸(B)相關(guān)性熱圖Fig.6 Heatmap of correlation between intestinal flora at genus level and short-chain fatty acids (A) or bile acids (B)

4 討論

本實驗選取Balb/c小鼠作為研究對象,在長期臨床等效劑量下給予清熱燥濕類中藥黃連、黃柏、黃芩和苦參后對腸道菌群進(jìn)行16S rRNA分析。各組小鼠給藥后腸道微生物均存在明顯的聚集,腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化。除苦參組外,黃連組、黃芩組和黃柏組小鼠厚壁菌門(Firmicutes)均呈現(xiàn)下降趨勢,擬桿菌門(Bacteroidota)均呈現(xiàn)上升趨勢,且黃連組變化更顯著。但在屬水平上,4種清熱燥濕類中藥對正常小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出不同的調(diào)節(jié)作用。黃連組有11種屬水平腸道菌群出現(xiàn)顯著性差異,其中有2種顯著性上調(diào),9種顯著性下調(diào);黃芩組有1種屬水平腸道菌群出現(xiàn)顯著性差異,并表現(xiàn)為顯著性上調(diào);黃柏組有4種屬水平腸道菌群出現(xiàn)顯著性差異,其中有1種顯著性上調(diào),3種顯著性下調(diào);苦參組有3種屬水平腸道菌群出現(xiàn)顯著性差異,其中1種顯著性上調(diào),2種顯著性下調(diào)。

在各組上調(diào)菌屬中,Bacteroides[14-15]、Rikenellaceae_RC9_gut_group[24]、Anaerostipes[25]、Oscillospiraceae[26-27]等均為有益菌且參與膽汁酸與短鏈脂肪酸的代謝。膽汁酸與短鏈脂肪酸為腸道菌群主要的代謝產(chǎn)物,除此之外常見的腸道菌群代謝產(chǎn)物還有吲哚類化合物。有研究表明清熱燥濕類中藥可調(diào)控脂多糖滲漏[28]及調(diào)節(jié)吲哚類化合物[29]的含量,但多發(fā)生在特定病例下,如糖尿病模型中,其是否能參與清熱燥濕尚不明確。故本次實驗以膽汁酸和短鏈脂肪酸為主要研究對象,探索了藥物對正常小鼠腸道菌群、膽汁酸及短鏈脂肪酸的影響。結(jié)果顯示黃連、黃柏、黃芩和苦參給藥后對正常小鼠的短鏈脂肪酸水平的影響較小;黃連給藥后有2種非結(jié)合型膽汁酸(鵝去氧膽酸、熊去氧膽酸)含量降低;黃芩給藥后有1種非結(jié)合型膽汁酸(去氫膽酸)含量升高,3種結(jié)合型膽汁酸(?；秦i去氧膽酸、牛磺熊去氧膽酸、?；蛆Z脫氧膽酸)含量降低;黃柏給藥后有1種非結(jié)合型膽汁酸(鵝去氧膽酸)含量降低;苦參給藥后有1種結(jié)合型膽汁酸(甘氨鵝脫氧膽酸)含量升高,2種非結(jié)合型膽汁酸(β-鼠膽酸、ω-鼠膽酸)含量降低。

有研究表明,腸道微生物可以產(chǎn)生多種代謝酶,與短鏈脂肪酸和膽汁酸的代謝息息相關(guān)。在膽汁酸代謝中,Lactobacillus、Bifidobacterium、Enterococcus、Clostridiumspp.和Bacteroidesspp.產(chǎn)生膽鹽水解酶(BSHs)對初級膽汁酸進(jìn)行酶解;ClostridiumclustersXIVa、IV、XI產(chǎn)生羥基類固醇脫氫酶(HSDHs)將膽汁酸3,7,或12環(huán)位氧化生成氧-膽汁酸[14]。在短鏈脂肪酸代謝中,丙酸由Bacteroidetes、Firmicutes介導(dǎo)的琥珀酸途徑及Lachnospiraceae介導(dǎo)的丙二醇途徑生成;丁酸則大部分由Faecalibacteriumprausnitzii,Eubacteriumrectale和Eubacteriumhallii通過丁酸輔酶A或小部分由Coprococcuscomes和Coprococcuseutactus通過丁酸激酶生成[15]。本研究結(jié)果顯示,牛磺熊去氧膽酸水平與Lachnoclostridium、Streptococcusc豐度呈顯著性正相關(guān),這與Zhao等[30]的研究結(jié)果相一致;熊去氧膽酸與norank_f__noranl_o_Clostridia_UCG-014呈正相關(guān),有文獻(xiàn)指出熊去氧膽酸由Clostridium產(chǎn)生[31],這與我們的研究結(jié)果一致。此外,有報道稱熊去氧膽酸還可以抑制直腸癌中的COX-2表達(dá),并抑制NF-κB和AP-1的DNA結(jié)合發(fā)揮抗癌作用[32]。在本實驗中,清熱燥濕類中藥降低了熊去氧膽酸的水平,這可能與小鼠所處的狀態(tài)不同有關(guān),且小鼠和人體的生理狀態(tài)存在一定差異,后續(xù)還需要進(jìn)一步的實驗說明清熱燥濕類中藥在疾病狀態(tài)下對腸道菌群和膽汁酸的影響。

綜上所述,常見的清熱燥濕類中藥在長期給予臨床等效劑量情況下可增加部分有益菌的水平,進(jìn)而調(diào)節(jié)膽汁酸的代謝,但對小鼠腸道短鏈脂肪酸含量無明顯影響。而清熱燥濕類中藥在疾病狀態(tài)下對膽汁酸和短鏈脂肪酸的代謝調(diào)控尚需進(jìn)一步的實驗研究。以上結(jié)果補充了清熱燥濕類中藥對正常狀態(tài)下動物腸道菌群介導(dǎo)的膽汁酸和短鏈脂肪酸變化的數(shù)據(jù)資料,為清熱燥濕類中藥在疾病的預(yù)防和治療中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。