金天姿,羅子宸,3,許偉辰,種瑩,時(shí)晨,單進(jìn)軍

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)兒科學(xué)研究所,江蘇 南京 210023;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)代謝組學(xué)中心,江蘇 南京 210023;3.南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省中藥高效給藥系統(tǒng)工程技術(shù)研究中心,江蘇 南京 210023)

非酒精性脂肪肝(NAFLD)已成為21世紀(jì)以來嚴(yán)重威脅人類健康的代謝性疾病之一,截至2020年底,NAFLD患病率高達(dá)25%,且逐年增加[1]。臨床以除酒精和其他明確的損肝因素所致的肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過度沉積為主要特征作為NAFLD診斷標(biāo)準(zhǔn),同時(shí)該病易惡化為非酒精性脂肪肝炎、肝纖維化、肝癌等[2]。NAFLD為肝系疾病,多由脾失健運(yùn),痰濁阻滯所致[3-4]。治療多以健脾疏肝、散瘀化濁降脂為主[5],輔以利濕類藥物,可健運(yùn)脾胃、疏泄肝氣,調(diào)整機(jī)體運(yùn)化狀態(tài),抑制脂質(zhì)積累[6]。

健脾利濕方為仝小林院士所創(chuàng),由山藥、茯苓、薏苡仁三味中藥組成,具有健脾、益氣、滲濕之功效。臨床研究表明,該方能夠調(diào)節(jié)糖脂代謝,抑制患者體內(nèi)脂質(zhì)積累,緩解患者虛胖表型,改善患者體內(nèi)代謝狀態(tài)[7]?，F(xiàn)采用高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD小鼠模型,進(jìn)行健脾利濕方防治NAFLD的藥效學(xué)評估,并運(yùn)用脂質(zhì)組學(xué)技術(shù)手段,從脂質(zhì)代謝角度分析其潛在作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級雄性C57BL6/J小鼠18只,8周齡,體質(zhì)量為18～20 g,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)條件:12 h晝夜循環(huán),相對濕度50%～60%,溫度(22±2)℃。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,給予高脂飲食進(jìn)行造模12周。經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會批準(zhǔn),倫理號:202103A009。

1.2 儀器

Vortex-Genie2渦旋震蕩儀(美國Scientific industries公司);RETSCH球磨儀(德國Retsch公司);5427R高速冷凍離心機(jī)、Bio Photometer蛋白核酸分析儀、Matercycler gradient PCR自動(dòng)系列化分析儀(德國Eppendorf公司);SPD1010離心濃縮揮干機(jī)、QuantStudio 7 Flex熒光定量PCR儀、UHPLC-Q-ExactiveOrbitrap/MS(美國Thermo公司);Allegra超高速冷凍離心機(jī)(美國Beckman公司);FA1004N萬分之一分析天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 藥物及試劑

山藥、茯苓、薏苡仁購自南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院;60%高脂飼料(D12492,美國Diet research公司);甲醇、乙腈、MTBE(美國Merck公司,質(zhì)譜純);異丙醇、甲酸銨、乙酸銨、甲酸(美國ROE公司,質(zhì)譜純)、TRIZOL(美國Thermo公司);甘油三酯(TG,A110-1-1)、總膽固醇(TC,A111-1-1)、高密度脂蛋白(HDL-C,A112-1-1)、低密度脂蛋白(LDL-C,A113-1-1)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST,C010-2-1)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT,C009-2-1)生化指標(biāo)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所);HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR(R323-01)、Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix(Q712-03)PCR試劑(南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司)。

2 方法

2.1 藥物制備

取山藥15 g,茯苓15 g,薏苡仁30 g,浸泡過夜,分別加入10倍、8倍超純水各煎煮1 h,過濾,減壓濃縮至生藥量1.95 g·kg-1,將藥物分裝儲存于-20 ℃冰箱備用。

2.2 分組及給藥

將18只雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為空白組(ND)、模型組(HFD)、健脾利濕方組(JPLS),每組6只?？瞻捉M小鼠給予正常飲食、自由飲水,其余2組給予高脂飲食誘導(dǎo)NAFLD模型。從造模第1天進(jìn)行連續(xù)給藥12周,給藥方式采用自主飲藥,給藥劑量按臨床等效劑量折算,約為7.8 g·kg-1·d-1。每周記錄小鼠體質(zhì)量與進(jìn)食量。12周后處死小鼠進(jìn)行樣本取材,包括摘眼球取血、摘取肝臟組織,取約200 mg肝臟放入4%多聚甲醛中固定,約200 mg肝臟液氮速凍,剩余組織保存于-80 ℃冰箱。

2.3 葡萄糖耐量(OGTT)實(shí)驗(yàn)

于造模第11周進(jìn)行OGTT實(shí)驗(yàn),小鼠禁食14 h后,空腹?fàn)顟B(tài)下,測量小鼠血糖水平,作為基礎(chǔ)血糖,隨后灌胃2 g·kg-1的葡萄糖溶液,分別于15、30、60、120 min采用尾靜脈采血檢測小鼠血糖水平,全程禁食處理。

2.4 組織病理學(xué)分析

將固定于4%多聚甲醛中的肝臟組織進(jìn)行石蠟包埋、切片、HE染色及封片保存。將液氮速凍的肝臟組織冷凍切片、油紅染色及封片保存。最后于光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟組織病理學(xué)改變。

2.5 生化指標(biāo)檢測

離心取小鼠血清,進(jìn)行生化指標(biāo)TG、TC、LDL-C、HDL-C、ALT、AST的檢測,實(shí)驗(yàn)方法根據(jù)試劑盒操作說明進(jìn)行。

2.6 肝臟脂質(zhì)代謝指標(biāo)的檢測

稱取小鼠肝臟20 mg,采用Trizol法提取小鼠肝臟總RNA,而后將其反轉(zhuǎn)為cDNA,儲存于-20 ℃?zhèn)溆谩２捎胵PCR法進(jìn)行脂質(zhì)代謝相關(guān)基因檢測,運(yùn)用2-ΔΔCT公式計(jì)算mRNA相對表達(dá)量,引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

2.7 脂質(zhì)組學(xué)檢測

2.7.1 脂質(zhì)組學(xué)樣本前處理 以n=6進(jìn)行實(shí)驗(yàn)樣本取材,精密稱取(20±0.5) mg肝臟組織加入200 μL超純水于提前預(yù)冷的球磨儀進(jìn)行勻漿,吸取20 μL勻漿液于1.5 mL的離心管中,加入含內(nèi)標(biāo)LysoPE(17∶0),SM(17∶0)和PE(17∶0/17∶0)的冰甲醇溶液,渦旋10 s,加入750 μL冰甲基叔丁基醚(MTBE),渦旋10 s后于4 ℃振蕩10 min后加入冰超純水188 μL,渦旋20 s,于4 ℃,18 000 r·min-1下離心2 min,吸取上清液350 μL至1.5 mL的離心管中,于離心濃縮揮干機(jī)中揮干。取揮干后的樣本加入110 μL 復(fù)溶液(甲醇∶甲苯=9∶1),渦旋10 min,超聲10 min,于4 ℃,18 000 r·min-1,離心10 min,吸取60 μL上清進(jìn)樣分析[8]。

2.7.2 色譜條件 色譜柱:ACQUITY CSH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm),流速:0.6 mL·min-1,流動(dòng)相:正離子模式A為乙腈-水(6∶4)+10 mmol·L-1甲酸銨+0.1%甲酸,B為異丙醇-乙腈(9∶1)+10 mmol·L-1甲酸銨+0.1%甲酸;負(fù)離子模式A為乙腈-水(6∶4)+10 mmol·L-1乙酸銨,B為異丙醇-乙腈(9∶1)+10 mmol·L-1乙酸銨。流動(dòng)相梯度:0～2 min,15%→30%B;2～2.5 min,30%→48%B;2.5～11 min,48%→82%B;11～11.5 min,82%→99%B;11.5～12 min,99%B;12～12.1 min,99%→15%B;12.1～15 min,15%B。柱溫:65 ℃,進(jìn)樣量4 μL。

2.7.3 質(zhì)譜條件 Q-Exactive四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀,電離源:HESI源。掃描模式:正(+)/負(fù)(-)離子模式。噴霧電壓為3.5 kV(+)和3.0 kV(-),離子源溫度為306 ℃(+)和325 ℃(-),毛細(xì)管溫度為300 ℃,鞘氣和輔助氣均為氮?dú)?鞘氣流為275 kPa,輔助氣流為104 kPa,S-lens為50,掃描范圍為m/z215～1 800[8]。

2.7.4 脂質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)處理 將正、負(fù)離子模式下質(zhì)譜原始文件進(jìn)行Abf格式轉(zhuǎn)化,于MS-DAIL4.24軟件中進(jìn)行譜圖信息比對,完成脂質(zhì)成分鑒定。數(shù)據(jù)上傳至metaboanalyst 5.0(https://www.metaboanalyst.ca/)網(wǎng)站進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化處理;根據(jù)Fold Change>1.5或<0.67、P<0.05條件篩選差異脂質(zhì)。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠形態(tài)學(xué)比較

如圖1A所示,經(jīng)高脂飲食誘導(dǎo)12周后,與空白組比較,模型組小鼠體質(zhì)量明顯上升(P<0.001),經(jīng)12周健脾利濕方干預(yù)后,小鼠體質(zhì)量相較于模型組顯著下降(P<0.001),且進(jìn)食量無明顯差異(圖1)。

注:A.體質(zhì)量變化曲線圖;B.平均進(jìn)食量曲線圖。與空白組比較,***P<0.001;與模型組比較,###P<0.001。ND.空白組;HFD.模型組;JPLS.健脾利濕方組圖1 各組小鼠體質(zhì)量、進(jìn)食量變化曲線Fig.1 Body weight and food intake curve of mice at different group

3.2 各組小鼠OGTT變化

OGTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖2),模型組血糖曲線高于空白組,糖耐量下降(P<0.001)。健脾利濕方干預(yù)后小鼠血糖明顯下降(P<0.05,P<0.01,P<0.001),表明小鼠對葡萄糖調(diào)控能力恢復(fù)。

注:與空白組比較,*P<0.05,***P<0.001;與模型組比較,ND.空白組;HFD.模型組;JPLS.健脾利濕方組圖2 各組小鼠血糖變化比較Fig.2 The blood sugar in each group

3.3 NAFLD小鼠肝臟病理學(xué)分析

HE染色顯示(圖3),空白組小鼠肝臟細(xì)胞排列緊密,結(jié)構(gòu)完整。高脂飲食組小鼠肝臟出現(xiàn)氣球樣病變,細(xì)胞邊界模糊;健脾利濕方給藥組肝臟中脂肪空泡較少,組織損傷程度較輕。油紅染色(圖3)結(jié)果表明,高脂飲食組脂滴數(shù)目多且形狀較大。與模型組比較,健脾利濕方組脂滴數(shù)目少,且形狀較小,甘油三酯沉積明顯改善。

注:ND.空白組;HFD.模型組;JPLS.健脾利濕方組圖3 HE、油紅染色結(jié)果比較(200×,n=3)Fig.3 HE and Oil red staining results (200×,n=3)

3.4 各組小鼠血清脂質(zhì)水平比較

如表2所示,與空白組比較,模型組小鼠TG(P<0.05)、TC(P<0.001)、HDL-C(P<0.001)、LDL-C(P<0.01)含量顯著升高。與模型組比較,給予健脾利濕方干預(yù)的小鼠血清脂質(zhì)相關(guān)生化指標(biāo)含量均明顯下降(P<0.05,P<0.001),提示健脾利濕方顯著緩解了高脂飲食導(dǎo)致的脂質(zhì)沉積。

表2 各組小鼠血清脂質(zhì)水平變化比較Table 2 The serum lipid level in each group mmol·L-1, n=6)

3.5 各組小鼠肝臟損傷水平比較

如表3所示,與空白組比較,模型組血清中ALT、AST水平明顯升高(P<0.001);給予健脾利濕方干預(yù)后,血清中ALT、AST水平顯著降低(P<0.001),表明健脾利濕方可有效改善肝臟損傷。

表3 各組小鼠肝臟損傷水平比較Table 3 The liver injury in each group U·L-1, n=6)

3.6 各組小鼠肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)水平比較

由圖4所示,與空白組比較,模型組小鼠肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)基因Fasn、CD36、SCD1、Srebp1c mRNA表達(dá)均顯著增加(P<0.01,P<0.001),CPT1α mRNA水平明顯下降(P<0.001);與模型組小鼠比較,健脾利濕方組Fasn、CD36、SCD1、Srebp1c的mRNA低表達(dá)(P<0.05,P<0.01,P<0.001),CPT1α mRNA表達(dá)略增加,但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

注:與空白組比較,*P<0.05,***P<0.001;與模型組比較,ND.空白組;HFD.模型組;JPLS.健脾利濕方組圖4 各組小鼠肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)水平比較Fig.4 Comparison of liver lipid metabolism-related gene expression levels in each group

3.7 脂質(zhì)組學(xué)結(jié)果

采用UPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS對NAFLD小鼠肝臟脂質(zhì)成分進(jìn)行檢測,采集正、負(fù)離子模式下總離子流圖(圖5)。負(fù)離子模式下,3組在脂肪酸(FA)水平上存在差異;正離子模式下,模型組甘油三酯(TG)水平明顯上升,健脾利濕方組TG水平相對于模型組有所下降。

圖5 總離子流圖(TIC)Fig.5 Total ion flow diagram(TIC)

通過MS-Dail 4.24軟件對脂質(zhì)成分進(jìn)行鑒定,正、負(fù)離子模式下分別鑒定出429、213種脂質(zhì)成分。主成分分析(PCA)結(jié)果顯示(圖6),正、負(fù)離子模式下空白組、模型組、健脾利濕方組3組置信區(qū)間均有較好區(qū)分,且健脾利濕方組置信區(qū)間趨于空白組,說明健脾利濕方可一定程度回調(diào)高脂飲食所致的脂質(zhì)代謝紊亂。

注:A.正離子模式PCA圖;B.負(fù)離子模式PCA圖圖6 主成分分析(PCA)圖Fig.6 Principal component analysis (PCA)

根據(jù)Fold Change≥1.5或≤0.67,P<0.05對正、負(fù)離子差異脂質(zhì)成分進(jìn)行篩分。正離子模式下,模型組/空白組共有290個(gè)差異脂質(zhì)(上調(diào)217個(gè),下調(diào)73個(gè)),健脾利濕方組/模型組共有231個(gè)差異脂質(zhì)(上調(diào)83個(gè),下調(diào)148個(gè)),共同差異脂質(zhì)184個(gè),見表4。負(fù)離子模式下,模型組/空白組共有113個(gè)差異脂質(zhì)(上調(diào)56個(gè),下調(diào)57個(gè)),健脾利濕方組/模型組共有58個(gè)差異脂質(zhì)(上調(diào)44個(gè),下調(diào)14個(gè)),共同差異脂質(zhì)43個(gè),見表5。按脂質(zhì)種類進(jìn)行富集分析,氣泡圖顯示(圖7)模型組肝臟中TG水平顯著增加,FA、DG水平上調(diào),提示NAFLD小鼠肝臟中脂肪酸攝取活動(dòng)及脂肪合成活動(dòng)增加,而PE、PI、PS等磷脂在高脂飲食誘導(dǎo)后降低。磷脂作為細(xì)胞膜主要成分之一,低細(xì)胞膜磷脂水平預(yù)示肝臟細(xì)胞膜發(fā)生損傷[9]。健脾利濕方干預(yù)后,小鼠肝臟中FA、DG、TG水平相較于模型組表達(dá)下降,提示其一定程度上抑制了中性脂肪的積聚;PC、PE、PI、PS等磷脂水平表達(dá)上升,表明健脾利濕方具有調(diào)控磷脂代謝水平的作用。

注:紅色表示上調(diào),藍(lán)色表示下調(diào);圖中對應(yīng)脂質(zhì)為:磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰絲氨酸(PS)、溶血性磷脂酰膽堿(LPC)、溶血性磷脂酰乙醇胺(LPE)、磷脂酰膽堿醚(Ether PC)、磷脂酰乙醇胺醚(EtherPE)、脂肪酸(FA)、神經(jīng)酰胺(CerHexCer)、己糖神經(jīng)酰胺(HexCer)、鞘磷脂(SM)、雙(單?；视?磷酸酯(BMP)、N-?；掖及?NAE)、甘油二酯(DG)、甘油三酯(TG)、膽汁酸(Bile Acids)、甘油三酯醚(Ether TG)、心磷脂(CL)。A.模型組(HFD)與空白組(ND)相比的差異脂質(zhì);B.健脾利濕方組(JPLS)與模型組(HFD)相比的差異脂質(zhì)圖7 差異脂質(zhì)富集分析Fig.7 Differential lipid enrichment analysis

表4 正離子模式肝臟差異脂質(zhì)Table 4 Liver differential lipids in positive ion mode

表5 負(fù)離子模式肝臟差異脂質(zhì)Table 5 Liver differential lipids in negative ion mode

4 討論

健脾利濕方為仝小林院士所創(chuàng),由山藥、茯苓、薏苡仁三味藥物組成,山藥和茯苓配伍增加健脾益氣,佐以薏苡仁兼能化濕,全方具有健脾、益氣、滲濕之功效[10-12]。本研究結(jié)果顯示健脾利濕方能夠有效改善高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肥胖表型,降低血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C、AST、ALT水平,有效調(diào)節(jié)機(jī)體脂質(zhì)代謝,減輕肝臟細(xì)胞脂質(zhì)沉積與損傷。qPCR檢測結(jié)果表明,健脾利濕方可有效抑制肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)基因Fasn、CD36、SCD1、Srebp1c mRNA表達(dá)水平。提示健脾利濕方可能通過促進(jìn)Fasn泛素化及蛋白酶體降解,有效防止肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積[13]。Srebp1c為胰島素激活的關(guān)鍵脂質(zhì)性轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)控肝臟糖異生[14],同時(shí),Srebp1c可受NF-κB P50亞基調(diào)控,從而減輕肝臟脂肪變性[15]。

脂質(zhì)種類及含量變化與疾病的發(fā)生存在密切的關(guān)系,脂質(zhì)組學(xué)為代謝組學(xué)重要分支之一[16]。本次肝臟脂質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果表明健脾利濕方干預(yù)后小鼠TG、TC、FA水平下降,磷脂水平(PC、PE、PI、PG等)升高。肝臟中飽和脂肪酸的積聚可通過激活Fasn/Srebp1c/HMG-CoA信號,誘導(dǎo)膽固醇合成增加,進(jìn)一步導(dǎo)致TG、LDL-C的升高[17]。文獻(xiàn)研究表明飽和脂肪酸可通過模仿LPS的作用促進(jìn)機(jī)體釋放大量致炎性細(xì)胞因子[18],如棕櫚酸(FA 16∶0)通過激活肝臟細(xì)胞死亡受體5(DR5),促進(jìn)肝臟細(xì)胞釋放細(xì)胞外囊泡,誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥表型[19]。細(xì)胞磷脂水平與細(xì)胞膜完整性有關(guān),適當(dāng)提高磷脂水平有助于維護(hù)磷脂雙分子層水油平衡,提高細(xì)胞膜穩(wěn)定性。文獻(xiàn)研究表明,過高或過低的磷脂水平都會導(dǎo)致TG水平的增多,低水平的PC可能會誘導(dǎo)肝臟中TG水平的增高,高水平的PC會升高DG含量促進(jìn)TG合成。臨床上,通過補(bǔ)充多烯磷脂酰膽堿促進(jìn)肝組織再生,治療肝臟損傷類疾病[20-21]。S-腺苷甲硫胺酸(SAM)與NAFLD、NASH的發(fā)生密切相關(guān)。SAM作為PC合成的關(guān)鍵甲基供體,為肝臟輸出VLDL所必需的,同時(shí)SAM可以通過磷脂酰乙醇胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶途徑參與脂質(zhì)合成,該酶缺乏會導(dǎo)致SAM積累,導(dǎo)致組蛋白和主要磷酸酶PP2A甲基化,促進(jìn)機(jī)體活性氧ROS積聚,誘發(fā)機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)[22]。磷脂組成多樣,并非所有磷脂均可發(fā)揮抗非酒精性脂肪肝作用,如L-α-溶血性磷脂酰肌醇(LPI)可作為G蛋白偶聯(lián)受體GPR55內(nèi)源性配體,在NASH患者肝臟中表達(dá)上升,促進(jìn)肝臟脂肪酸從頭合成,降低脂肪酸β氧化,誘導(dǎo)乙酰輔酶A羧化酶(ACC)表達(dá)上升,促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的激活并提高肝臟脂質(zhì)含量[23]。氧化應(yīng)激而產(chǎn)生的氧化磷脂(OxPLs)可促進(jìn)ROS積累誘發(fā)肝細(xì)胞線粒體功能障礙,具有促炎和促動(dòng)脈粥樣硬化作用。通過靶向抑制OxPLs可改善NASH肝臟脂肪變性、炎癥,纖維化、肝細(xì)胞死亡特征,抑制其進(jìn)展為肝細(xì)胞癌[24]。

綜上所述,健脾利濕方有助于調(diào)控脂質(zhì)代謝紊亂,從而達(dá)到防治NAFLD的作用。脂質(zhì)組學(xué)可全面描繪機(jī)體脂質(zhì)代謝狀態(tài),為疾病的治療提供了一定的思路。