曾銳,康冬妮,2,王省,王紅,3,陳斌,汪晶,黃一平

(1.南京中醫(yī)藥大學附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,江蘇 南京 210028;2.寶雞市中醫(yī)醫(yī)院藥學部,陜西 寶雞 721000;3.南京腦科醫(yī)院醫(yī)學心理科,江蘇 南京 210029)

抑郁癥又稱抑郁障礙,是臨床常見的精神疾病,主要表現(xiàn)為情緒低落、思維遲緩、意志減退、精力不足、悲觀等,嚴重者可出現(xiàn)自殘、自殺,是威脅人類健康和影響生活幸福指數(shù)的嚴重疾病之一[1-2],其具體發(fā)病機制尚不明確[3]。近年來,隨著生活壓力的增加,抑郁癥的發(fā)病率越來越高。目前對于抑郁癥治療除了心理干預(yù)外,藥物治療也非常重要,抗抑郁藥雖具有抗抑郁及抗焦慮作用,但部分患者存在較為嚴重的不良反應(yīng)[4-5]。脊髓上神經(jīng)通路在抑郁癥治療中作用特殊,外耳是體表唯一既有三叉神經(jīng)又有迷走神經(jīng)分布的部位,研究表明針刺治療能夠改善患者抑郁癥狀[6-8]。如缺血性中風后抑郁患者,在給予氟西汀西藥抗抑郁治療基礎(chǔ)上,早期輔以加強揚刺百會穴治療,能進一步提高臨床療效,減輕抑郁病情,促進神經(jīng)功能恢復(fù),改善患者生活質(zhì)量,且安全可靠[9]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),在對抑郁癥患者口服選擇性5-羥色胺(5-HT)再攝取抑制劑(Selective serotonin reuptake inhibitors,SSRIs)類藥物的同時加予耳皮內(nèi)刺治療能有效提高抗抑郁藥的抗抑郁作用[10]。

抑郁癥是一種系統(tǒng)性綜合病癥,且抑郁癥發(fā)病機制可能與單胺類遞質(zhì)系統(tǒng)、下丘腦-垂體-腎上腺軸等復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)改變有關(guān)[11],可伴有氨基酸、糖和血脂代謝等多種代謝物異常[12]。代謝組學具有能夠及時、靈敏、真實地反映生物體功能對病理生理或基因修飾等刺激產(chǎn)生的動態(tài)應(yīng)答與整體調(diào)節(jié)的特點[8]。因此,本研究采用代謝組學UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)對抑郁癥患者治療前后的血漿樣本進行分析,比較藥物及針刺治療作用于抑郁癥可能的代謝途徑,以期進一步闡明其作用機制。

1 臨床資料

1.1 研究對象

選取2017年10月至2018年6月南京腦科醫(yī)院的抑郁癥患者25例,隨機分為針刺藥物組13例、藥物組12例(脫落4例)。2組患者年齡、性別以及治療前HAMD指數(shù)等方面比較無顯著性差異(P>0.05),具有可比性(表1)。本研究經(jīng)南京腦科醫(yī)院倫理委員會批準(倫理批號:NJDEZYYZJ201602)。

表1 2組患者基線資料比較Table 1 Comparison of baseline data between

1.2 西醫(yī)診斷標準

抑郁癥診斷標準主要依據(jù)《中國精神疾病分類方案與診斷標準》第3版(CCDM-Ⅲ)的抑郁診斷標準,并且符合CCDM-Ⅲ關(guān)于抑郁單次或反復(fù)發(fā)作的診斷標準[13]。主要以心境低落為主,并至少包含下列中4項:①興趣喪失、無愉快感;②精力減退或疲乏感;③精神運動性遲滯或激越;④自我評價過低,自責,或有內(nèi)疚感;⑤聯(lián)想困難或自覺思考能力下降;⑥反復(fù)出現(xiàn)想死的念頭或有自殺、自傷行為;⑦睡眠障礙,如失眠、早醒,或睡眠過多;⑧食欲降低或體重明顯減輕;⑨性欲減退。

1.3 納入標準

①符合抑郁癥診斷標準;②無其他神經(jīng)精神類疾病史;③簽署知情同意書;④未參加其他藥物臨床試驗;⑤無藥物依賴史或者物質(zhì)濫用史;⑥常規(guī)醫(yī)學檢查(血常規(guī)、尿常規(guī))無明顯異常。

1.4 排除標準

①服用非SSRIs類藥物患者;②有自殺計劃或行為者;③有躁狂、輕度躁狂或混合發(fā)作史;④已接受其他治療,可影響本研究的效應(yīng)指標檢測結(jié)果者。

2 方法

2.1 治療方法

藥物組患者均給予SSRIs類抗抑郁藥常規(guī)治療。根據(jù)臨床用藥經(jīng)驗,大多數(shù)抗抑郁藥物初次給藥劑量為10 mg·d-1,若7 d內(nèi)患者接受度良好,劑量增加至20 mg·d-1。同時,根據(jù)患者病情與醫(yī)生診斷,劑量會隨著患者癥狀的加重增加。

針刺藥物組在藥物組治療基礎(chǔ)上進行耳內(nèi)皮刺治療。具體操作為:常規(guī)耳部皮膚消毒,使用0.18 mm×10 mm(鎮(zhèn)江皇帝牌針灸針,貨號:20161016)針灸針,在單側(cè)外耳的耳甲區(qū)選取4個位置相對固定且平坦的進針點,分別是三角窩內(nèi):對耳輪上腳和對耳輪下腳分叉處(1處);耳甲艇內(nèi):對耳輪下腳下方(1處)和對耳輪上方(1處);耳甲腔內(nèi)(1處)。采用平針(進針角度<15°)方法刺入皮膚內(nèi),將針體貫穿皮膚內(nèi)而不是皮下,不觸及耳軟骨,避免產(chǎn)生疼痛感。針畢使用膠布貼敷以隱藏針體,留針4 h,每日治療1次,每周連續(xù)治療5次,2組療程均為3周。

2.2 實驗方法

2.2.1 儀器和試劑 Micromass Q-TOF microTM四級桿-飛行時間質(zhì)譜(電噴霧離子源-Lockspray);低溫高速離心機(德國 Eppendorf公司);Vortex Genie?2 Vortex型渦旋儀(深圳安必勝公司);超低溫冰箱(-80 ℃,美國Thermo公司);Millipore純水機(美國Millipore公司);KQ-4000B型超聲清洗機(鞏義市予華儀器公司);METTLER AB135-S型電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司);N-EVAP-112氮吹儀(美國Organomation公司)。肝素鈉注射液(常州千紅生化制藥股份有限公司,貨號:151710084A,);乙腈(色譜純,美國Merck公司);甲酸(色譜純,批號:J1610006,上海阿拉丁公司)。

2.2.2 全血標本采集及血漿提取 治療前及末次治療2 h后經(jīng)肘正中靜脈采集靜脈血3 mL至肝素抗凝管中,立即顛倒混勻7～8次,靜置1 h后將全血置于4 ℃離心機內(nèi)以1 500 r·min-1離心15 min,離心結(jié)束后用移液器分別吸取150 μL上層清液(血漿)至200 μL EP管;分裝結(jié)束后,將血漿樣品迅速轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存待用。

2.2.3 血漿樣品制備及預(yù)處理 于-80 ℃冰箱中取出上述凍存的血漿樣品,將血漿樣品于4 ℃解凍,解凍后精密吸取200 μL血漿,加入800 μL的預(yù)冷乙腈溶液,渦旋混合,4 ℃靜置10 min,于4 ℃下13 000 r·min-1離心15 min,取上清液800 μL,4 ℃低溫離心吹干,凍干物用200 μL乙腈-水(8∶2,v/v)超聲復(fù)溶,渦旋,13 000 r·min-1離心15 min,取上清液進樣檢測。

2.2.4 質(zhì)控樣本的制備 等量吸取30 μL各個血漿樣本,將其混合均勻后作為質(zhì)控樣本,用于檢測儀器穩(wěn)定性和重復(fù)性。

2.2.5 色譜條件 色譜柱為Acquity UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm);柱溫30 ℃,流速0.8 mL·min-1,進樣量3 μL;流動相A為0.1%甲酸水,流動相B為乙腈溶液。樣品的洗脫條件:0～1 min,10%B;1～8 min,10%→95%B;8～9 min,95%B;9～10 min,95%→10%B;10～12 min,10%B。

2.2.6 質(zhì)譜條件 采用TOF MS-IDA-MS/MS模式,電噴霧離子(ESI),正離子模式掃描,質(zhì)量掃描范圍50～1 500m/z。正離子檢測方式:氣簾氣(CUR)40 psi,霧化氣(GS1)55 psi,輔助氣(GS2)55 psi,電噴霧電壓(ISVF)4 500 eV,離子源溫度(TEM)550 ℃,去簇電壓(DP)±100 eV;TOF MS模式下設(shè)置碰撞電壓±10 eV,IDA-MS/MS條件下設(shè)置碰撞電壓±40 eV,碰撞電壓差20 eV。

2.2.7 進樣步驟 首先進樣2針QC樣品以平衡色譜柱和系統(tǒng),接著進分析樣品。每進7個樣品,中間間隔1個QC樣品進樣,平衡因進樣次序不同影響最終結(jié)果。所有樣品按設(shè)置的進樣程序依次進樣。

2.3 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 UPLC-Q-TOF-MS/MS分析

采用UPLC-Q-TOF-MS/MS對各組血漿樣本進行檢測,正離子模式下各組血漿樣本總離子流圖(TIC)見圖1。從PCA、PLS-DA圖(圖2)中可以看出各組治療前后,針刺藥物組治療后與藥物組治療患者的血漿樣本代謝輪廓存在明顯差異。針刺藥物組和藥物組進行PLS-DA分析,模型驗證圖即置換檢驗圖可以用于判定PLS-DA模型是否過擬合,設(shè)定檢驗次數(shù)為200,得到模型驗證結(jié)果如(圖3)所示,左側(cè)所有Q2值低于右側(cè)原始點或Q2的回歸線與縱軸相交數(shù)值<0,證明PLS-DA模型有效[15]。同時,利用PLS-DA對所有治療前的患者代謝輪廓進行檢驗,2組患者雖有明顯區(qū)分,但其左側(cè)所有Q2沒有低于右側(cè)原始點,證明此PLS-DA模型為過度擬合,2組患者在治療前無差異。

注:A.針刺藥物組;B.藥物組圖1 正離子模式下各組血漿樣本總離子流圖(TIC)Fig.1 Total ion chromatogram of plasma samples from each group in positive ion mode

注:AB.針刺給藥前;ab.針刺給藥后;DE.給藥前;de.給藥后;①③⑤⑦.PCA圖;②④⑥⑧.PLS-DA圖圖2 PCA圖及PLS-DA圖Fig.2 PCA and PLS-DA scores plot of each group

注:①.針刺藥物組;②.藥物組;③.治療前對比;④.治療后對比圖3 PLS-DA置換檢驗圖Fig.3 Permutation test of PLS-DA model

分別建立針刺藥物前后的判別模型、單純給藥前后的判別模型,模型評價參數(shù)(R2Y,Q2)列于表2,R2Y,Q2越接近于1,表明模型越穩(wěn)定可靠,通過本實驗表明針刺藥物組、藥物組模型穩(wěn)定可靠。

表2 各組間PLS-DA模型參數(shù)表Table 2 Evaluation parameter of PLS-DA in each group

3.2 潛在生物標志物的篩選

基于針刺藥物組、藥物組的PLS-DA圖中的VIP值,按從大到小的順序排序所有檢測的質(zhì)譜值,挑選VIP>1的代謝物,VIP越大說明對該疾病的貢獻越大,定為差異成分;在針刺藥物組、藥物組中跟蹤上述的差異成分,篩選出有顯著性差異的成分(t檢驗),挑選P<0.05的這些差異代謝物最終被選定為結(jié)構(gòu)鑒定的對象;采用AB Sciex的MarkerView軟件進行峰識別,對照METLIN、HMDB、Chemspider等化合物在線數(shù)據(jù)庫,綜合篩選了針刺藥物組、藥物組的潛在生物標志物,針刺藥物組有16個潛在生物標志物,藥物組有9個潛在生物標志物,結(jié)果分別見表3～4。

表3 針刺藥物組抑郁癥患者的潛在生物標志物Table 3 Potential biomarkers of depressed patient in acupuncture-drug group

表4 藥物組抑郁癥患者的潛在生物標志物Table 4 Potential biomarkers of depressed patient in drug group

3.3 差異代謝物生物功能分析

對差異性代謝物歸一化后的數(shù)據(jù)進行聚類分析,所得針刺藥物組熱圖結(jié)果見圖4,藥物組熱圖見圖5。由圖4可見,針刺藥物組針刺給藥后與針刺給藥前相比,有3-羥基苯甲酸、二十二碳六烯酸、L-賴氨酸、L-纈氨酸等8個代謝物上調(diào),有N-甲基乙內(nèi)酰脲、L-組氨酸、棕櫚酸、異丁酸等8個代謝物下調(diào)。由圖5可見,藥物組給藥后與給藥前相比,有乙酰磷酸酯、對黃嘌呤、氨己烯酸等5個代謝物上調(diào),有順式丙烯酸乙酰酯、4-羥基肉桂酸、甘油醛等4個代謝物下調(diào)。

圖4 針刺藥物組顯著性差異代謝物層次聚類結(jié)果Fig.4 The hierarchical clustering results of significantly potential metabolites in acupuncture-drug group

圖5 藥物組顯著性差異代謝物層次聚類結(jié)果Fig.5 The hierarchical clustering results of significantly potential metabolites in drug group

3.4 代謝通路分析

將針刺藥物組16個差異代謝物、藥物組9個差異代謝物輸入到MetPA(http://www.metaboanalyst.ca/)數(shù)據(jù)庫中進行通路分析,通過Impact>0.1篩選得到針刺藥物組抑郁癥患者有4條代謝通路發(fā)生顯著變化,分別為酮體的合成與降解、賴氨酸降解、苯丙氨酸代謝、組氨酸代謝,見圖6;藥物組抑郁癥患者有4條代謝通路發(fā)生顯著變化,分別為亞油酸代謝、咖啡因代謝、?；撬岷蛠喤；撬岬拇x、精氨酸和脯氨酸代謝,見圖7。

注:a1.酮體的合成與降解;b1.賴氨酸降解;c1.苯丙氨酸代謝;d1.組氨酸代謝圖6 針刺藥物組治療前后血漿差異代謝通路Fig.6 Differential metabolic pathways in plasma before and after treatment in acupuncture-drug group

注:a.亞油酸代謝;b.咖啡因代謝;c.牛磺酸和?；撬岬拇x;d.精氨酸和脯氨酸代謝圖7 藥物組治療前后血漿差異代謝通路Fig.7 Plasma differential metabolic pathways before and after treatment in drug group

4 討論

中醫(yī)學認為抑郁癥多由陽氣虧虛、氣機不暢導(dǎo)致五臟功能失調(diào)而產(chǎn)生。針灸具有疏經(jīng)通絡(luò)、調(diào)整臟腑、調(diào)和氣血、調(diào)暢情致等作用,已廣泛應(yīng)用于臨床抑郁癥的治療中。耳部可視為人體的縮影,穴位豐富,對耳內(nèi)特定部位的皮刺刺激,能夠調(diào)控神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)改善臟腑功能,發(fā)揮安神、疏肝、調(diào)理臟腑作用,多用于神志相關(guān)病及痛證的治療。現(xiàn)代研究表明,神經(jīng)炎癥可能是抑郁病的發(fā)病機制之一,外耳針刺的主要刺激對象為三叉神經(jīng)旁核、孤束核、迷走神經(jīng)核、藍斑、延髓腹外側(cè)的頭端和尾端、下丘腦室旁核等,這些核團組成的網(wǎng)絡(luò)與炎癥調(diào)節(jié)密切相關(guān),外耳針刺可降低機體的神經(jīng)炎癥[10],改善抑郁癥狀態(tài)。

維生素的生物合成與苯丙氨酸代謝息息相關(guān)[16],維生素具有消除氧自由基的作用,此外,維生素B6可使GABA以及5-HT合成增加,對抑郁癥亦有治療作用。L-賴氨酸是5-HT拮抗劑,并在鈣吸收中起主要作用[17-18]。本次研究顯示針刺藥物可通過調(diào)節(jié)苯丙氨酸代謝及L-賴氨酸降解,促進維生素的合成,進而調(diào)節(jié)5-HT的合成。三羧酸循環(huán)(TCA)是有氧代謝供能系統(tǒng),同時也是糖類、蛋白質(zhì)、脂類的代謝樞紐,組氨酸是可以轉(zhuǎn)化成TCA循環(huán)中間體的氨基酸之一[19-20]。差異性代謝物中的檸檬酸和異檸檬酸都是TCA循環(huán)中重要的中間產(chǎn)物。提示針刺藥物組可一定程度改善抑郁癥患者能量代謝異常。酮體[21]是脂肪酸在肝臟進行正常分解代謝所生成的特殊中間產(chǎn)物,包括有乙酰乙酸(約占30%),β-羥基丁酸(約占70%)和極少量的丙酮。酮體可作為替代燃料,為受損的線粒體提供更多的能量來源以維持腦組織正常功能,酮體可以氧化輔酶Q,減少線粒體內(nèi)氧自由基的形成[20],改善抑郁癥炎癥狀態(tài)。本研究顯示,針刺藥物主要調(diào)控酮體的合成與降解、賴氨酸降解、苯丙氨酸代謝以及組氨酸代謝,提示其可能通過調(diào)控機體代謝,改善抑郁癥患者神經(jīng)炎癥及能量代謝異常。

本研究藥物組差異代謝物與針刺藥物組明顯不同,其主要調(diào)控亞油酸代謝、咖啡因代謝、?；撬岷蛠喤；撬?、精氨酸和脯氨酸代謝。亞油酸在免疫調(diào)節(jié)、脂類代謝、心血管疾病等方面起著非常重要的作用。相關(guān)文獻表明適宜的亞油酸水平對增強機體抗氧化功能具有重要影響[22]。咖啡因能夠激活去甲腎上腺素能通路,已被證實能反復(fù)增強大腦多個區(qū)域去甲腎上腺素的轉(zhuǎn)化。研究表明靶向去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運體,可對重度抑郁癥發(fā)揮有效治療作用[12]。對咖啡因的調(diào)控,可一定程度增強去甲腎上腺素的轉(zhuǎn)化起到抗抑郁作用。牛磺酸作為體內(nèi)含量最豐富的含硫氨基酸,以游離狀態(tài)存在于生物體內(nèi),是人體正常所必需的活性物質(zhì),有研究發(fā)現(xiàn)?；撬醄23]可對抗利血平誘導(dǎo)的急性抑郁患者多巴胺、去甲腎上腺素的含量下降,降低單胺氧化酶活性,升高腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子水平,提示調(diào)控?；撬岽x治療抑郁癥的作用機制與神經(jīng)單胺遞質(zhì)假說、神經(jīng)內(nèi)分泌假說和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子假說密切相關(guān)。

綜上所述,SSRIs類藥物加耳內(nèi)皮刺與單獨使用SSRIs類藥物可能通過調(diào)控抑郁癥患者代謝發(fā)揮抑郁癥治療作用,調(diào)控更多的代謝物可能是耳內(nèi)皮刺增效的內(nèi)在機制。但本研究未觀察給予耳內(nèi)皮刺后,是否可以減少SSRIs類藥物量,且納入病例較少,后續(xù)將進一步采用多中心大樣本隨機對照試驗深入探討耳內(nèi)皮刺加藥物發(fā)揮抗抑郁的作用機制。