易春燕,杜 超,楊 明,劉昌華,郝員敏,雷應(yīng)華,劉 旭

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所/農(nóng)業(yè)部西南作物有害生物綜合治理重點實驗室,成都 610066;2.內(nèi)蒙古科技大學包頭師范學院,內(nèi)蒙古 包頭 014000)

【研究意義】芫菁為鞘翅目(Coleoptera)芫菁科(Meloidae)昆蟲的通稱,眼斑芫菁(MylabriscichoriiLinnaeus)俗稱“黃黑小斑蝥”,因其蟲體內(nèi)含有斑蝥素(Cantharidin)被中華人民共和國藥典(2005年)收錄為藥用昆蟲。斑蝥幼蟲以蝗蟲卵為食(或寄生蜂巢,以地花蜂的卵、幼蟲及花蜜為食),成蟲生長依賴于絲瓜花等寄主植物,人工養(yǎng)殖斑蝥難度較大,成蟲可以依靠人工飼料完成整個生命周期,而幼蟲只能進行半人工飼料飼養(yǎng),即初孵幼蟲以蝗蟲卵飼養(yǎng),待幼蟲生長到3齡時轉(zhuǎn)移至人工飼料,直至化蛹。昆蟲攜帶共生菌是一種普遍存在的自然現(xiàn)象,在長期的協(xié)同進化過程中,昆蟲與其內(nèi)共生菌之間形成了穩(wěn)定的互惠共生關(guān)系[1-3]。昆蟲和其腸道微生物處在一個共生的關(guān)系中,大多數(shù)共生菌對昆蟲的生長發(fā)育、食物消化、免疫等具有一定的影響。腸道作為昆蟲消化系統(tǒng)的重要組成部分,其中的共生菌對昆蟲食性的選擇和食物的降解代謝具有重要作用[4-10]。因此,揭示眼斑芫菁幼蟲腸道多樣性與食物之間的關(guān)系,對眼斑芫菁的人工飼養(yǎng)具有重要意義。【前人研究進展】斑蝥素的應(yīng)用范圍日趨廣泛,對斑蝥素資源的需求愈來愈大,但不合理采集導致野生斑蝥資源日漸減少。芫菁科昆蟲資源匱乏已成為制約進一步開發(fā)利用斑蝥素的“瓶頸”,人工飼養(yǎng)斑蝥已成為必然趨勢。20世紀90年代,科研人員就對斑蝥的人工飼養(yǎng)進行了研究,明確了斑蝥生長的最適溫度、濕度、光照條件、飼養(yǎng)密度等[11-12],汪會榮[13]研制了斑蝥成蟲和幼蟲的人工飼料配方,目前大多數(shù)研究相對集中在斑蝥素的合成、應(yīng)用等,同時也開展了芫菁與外寄生菌的研究,周治成等[14]基于掃描電鏡觀察和分子生物學試驗對一株扁角豆芫菁(EpicautaimpressicornisPic )寄生菌進行了分離鑒定,結(jié)果顯示為飼養(yǎng)過程中感染的真菌黃曲霉菌;李曉飛等[15]對芫菁寄生菌降解斑蝥素進行了研究,發(fā)現(xiàn)球孢白僵菌可以有效降解斑蝥素,而曲霉不能降解斑蝥素?！颈狙芯壳腥朦c】近年來,昆蟲腸道共生菌和寄主昆蟲的互作逐漸成為國內(nèi)外關(guān)注的熱點[16],取食人工飼料后,斑蝥腸道共生菌可能在提供營養(yǎng)方面起著重要作用,進而影響其新陳代謝和生長發(fā)育,但斑蝥腸道菌群的相關(guān)研究尚未見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以眼斑芫菁為研究對象,通過高通量測序技術(shù)分析其腸道內(nèi)共生菌的多樣性,初步探索斑蝥腸道內(nèi)共生菌的組成差異以及功能,為后續(xù)針對眼斑芫菁或其它鞘翅目昆蟲腸道微生物的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 眼斑芫菁試蟲的采集與實驗室飼養(yǎng)

供試的眼斑芫菁成蟲采自貴陽省畢節(jié)縣,采回實驗室內(nèi)用絲瓜花飼養(yǎng),接初孵幼蟲以蝗卵飼養(yǎng),至2齡時,采集樣品作對照;一部分用蝗卵繼續(xù)飼養(yǎng)至4齡采樣;另一部分2齡幼蟲轉(zhuǎn)接至人工飼料飼養(yǎng),至4齡采集樣本,樣品信息如表1所示。

表1 樣品信息Table 1 Information of the sample

1.2 眼斑芫菁試蟲的饑餓處理與表面殺菌

將收集的眼斑芫菁試蟲轉(zhuǎn)移至新的離心管中,在飼養(yǎng)環(huán)境下饑餓處理24 h,使眼斑芫菁試蟲體內(nèi)的腸道菌群達到相對穩(wěn)定的水平。用無菌水清洗饑餓處理后的試蟲,再用75%乙醇浸泡2 min,再次用無菌水沖洗去除殘留的乙醇。

1.3 眼斑芫菁試蟲的解剖與腸道收集

經(jīng)過饑餓處理和表面殺菌后,在體視顯微鏡下用尖頭鑷子夾住眼斑芫菁試蟲的蟲體,用眼科剪沿著頭口器下方的腹部,順著胸足、腹足、尾足之間輕輕剪開,然后換另外一把鑷子展開腹部,完整取出腸道,置于無菌離心管中,用液氮速凍, -80 ℃冰箱保存用于DNA提取。

1.4 眼斑芫菁試蟲腸道共生菌群16S rDNA擴增子測序

采用CTAB法提取眼斑芫菁試蟲腸道菌的基因組DNA,測定DNA濃度并用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性。PCR全長擴增,產(chǎn)物純化,構(gòu)建SMART bel文庫,PacBio上機進行高通量測序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

PacBio下機數(shù)據(jù)通過PacBio公司SMRT分析軟件導出bam文件。按barcode區(qū)分樣本后進行OTUs(Operational taxonomic units )聚類和物種分類分析。根據(jù)OTUs聚類結(jié)果,對每個OUT的代表序列做物種注釋,得到對應(yīng)的物種信息和基于物種的豐度分布情況。同時,對OTUs進行豐度、Alpha多樣性計算及Venn圖分析,得到樣品內(nèi)物種豐度和均勻度信息、不同樣品或分組間的共有和特有OTUs信息等。對OTUs進行多序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹,進一步得到不同樣品和分組的群落結(jié)構(gòu)差異,通過PcoA 降維圖和樣品聚類樹進行展示。為進一步挖掘分組樣品間的群落結(jié)構(gòu)差異,選用LefSe、MRPP等統(tǒng)計方法對分組樣品的物種組成和群落結(jié)構(gòu)進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 眼斑芫菁幼蟲腸道菌群測序質(zhì)量與OTUs分布

本試驗共檢測12個眼斑芫菁幼蟲腸道樣本(表2),獲得96 390條原始數(shù)據(jù)(Raw reads),最終獲得81 759條有效數(shù)據(jù)(Clean reads),原始堿基數(shù)Base(nt)共118 280 001 bp,序列相似性為85.2%,有效數(shù)據(jù)比例均超過80%,說明測序數(shù)據(jù)質(zhì)量滿足后續(xù)分析要求。聚類共獲得230個OTUs,從L.H2、L.H4和L.S4腸道菌群測序數(shù)據(jù)中獲得121、106和48個OTUs。從圖1可知,蝗卵飼養(yǎng)的眼斑芫菁幼蟲的腸道細菌所含OTUs種類明顯高于從2齡轉(zhuǎn)接到人工飼料中的眼斑芫菁幼蟲,說明蝗卵飼養(yǎng)的眼斑芫菁幼蟲腸道細菌種類更豐富。

圖1 不同組眼斑芫菁幼蟲腸道內(nèi)生菌Fig.1 Intestinal bacteria of different groups of M. cichorii Linnaeus larvae

表2 眼斑芫菁幼蟲腸道菌的測序預(yù)處理統(tǒng)計及質(zhì)控信息Table 2 Sequencing preprocessing statistics and quality control information of gut microorganisms from larvae of M. cichorii

2.2 眼斑芫菁幼蟲腸道內(nèi)生菌的組成與結(jié)構(gòu)分析

在門水平上,眼斑芫菁幼蟲的腸道內(nèi)生菌共注釋到17個門(圖2),主要為變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacter-oidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)等。3個處理組中,變形菌門(Proteobacteria)為腸道菌優(yōu)勢菌群的絕對優(yōu)勢菌門,L.H2、L.H4、L.S4的相對豐度分別為89.2%、92.7%、99.6%。

圖2 眼斑芫菁幼蟲腸道菌群門水平相對豐度前10的物種組成Fig.2 Bacterial composition of the top 10 relative abundances at the phylum level of M.cichorii Linnaeus larvae

在屬水平上,眼斑芫菁幼蟲的腸道內(nèi)生菌優(yōu)勢屬菌共注釋到109個屬,主要為勞爾氏菌屬(Ralstonia)、甲基桿菌屬(Methylobacterium),還包括沙雷氏菌屬(Serratia)、Pluralibacter屬、克雷伯菌屬(Klebsiella)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium)、魏斯氏菌屬(Weissella)、微桿菌屬(Microbacterium)(圖3)。各分組樣品的優(yōu)勢菌屬不同,L.H2腸道細菌樣品中的優(yōu)勢菌屬是克雷伯菌屬(26.0%)、勞爾氏菌屬(25.0%)、沙雷氏菌屬(18.8%);L.H4腸道細菌樣品中的優(yōu)勢菌屬是甲基桿菌屬(42.1%)、勞爾氏菌屬(29.0%);L.S4腸道細菌樣品中的優(yōu)勢菌屬是勞爾氏菌屬(24.8%)、Pluralibacter(18.7%)。

圖3 眼斑芫菁幼蟲腸道菌群屬水平相對豐度前10的物種組成Fig.3 Bacterial composition of the top 10 relative abundances at the genus level of M.cichorii Linnaeus larvae

2.3 眼斑芫菁幼蟲腸道菌群多樣性分析

從表3可知,L.H2、 L.H4的Chao1指數(shù)分別為48.52、34.63,均比L.S4的(24.24)高,說明蝗卵飼養(yǎng)的眼斑芫菁幼蟲的腸道菌群豐度比人工飼料飼養(yǎng)的高。L.H2、L.H4的Shannon指數(shù)(1.80和1.47)比L.S4的(0.45)高;且L.H2、L.H4的Simpson指數(shù)(0.46和0.42)高于L.S4(0.14),表明用蝗卵飼養(yǎng)的眼斑芫菁幼蟲的腸道菌群多樣性高于人工飼料飼養(yǎng)的幼蟲。說明,L.H2和L.H4具有較高的多樣性指數(shù)和豐度指數(shù)及優(yōu)勢度指數(shù),表明這2組樣本中的細菌種類更豐富。

表3 眼斑芫菁幼蟲腸道細菌α多樣性指數(shù)Table 3 α diversity index of intestinal bacteria in M.cichorii larvae

利用Beta多樣性分析中的MRPP分析配合PcoA降維分析顯示,各組腸道菌群落結(jié)構(gòu)組內(nèi)差異大,但不同組的腸道細菌群落結(jié)構(gòu)差異不顯著(P>0.05),這與Alpha多樣性分析結(jié)果一致。

2.4 眼斑芫菁幼蟲腸道微生物群組成的差異分析

根據(jù)眼斑芫菁幼蟲腸道微生物群在屬水平的物種注釋及豐度信息,選取豐度排名前35的屬,根據(jù)其在每個樣品中的豐度信息,從物種和樣品2個層面進行聚類,繪制成優(yōu)勢菌屬熱圖(圖4),各處理眼斑芫菁幼蟲腸道菌群的優(yōu)勢菌屬差異明顯。Pluralibacter菌屬是轉(zhuǎn)移到人工飼喂中的4齡眼斑芫菁幼蟲腸道微生物群的主要組成部分,相對豐度高于其他組。

圖4 眼斑芫菁腸道菌群屬水平上相對豐度前35類群的聚類熱圖Fig.4 Cluster heat maps of the top 35 taxa with relative abundance at the genus level of M.cichorii Linnaeus larvae

LEfSe (Linear discriminant analysis effect size) 分析可以發(fā)現(xiàn)種間在豐度上具有顯著差異的物種(圖5)。L.H2腸道菌群中具有顯著差異的菌群是未命名的伯克霍爾德菌屬(unidentifiedBurkholderiaceae)、洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderiacepacia)[17]和皮特不動桿菌(Acinetobacterpittii)[18-19];L.H4的腸道細菌豐度具有顯著差異的為芽孢桿菌綱、乳桿菌目和鞘脂單胞菌目;L.S4的腸道菌群明顯富集在α-變形菌目和醋酸桿菌科。

圖5 腸道菌群線性判別(LDA)得分大于4的細菌類群Fig.5 Bacterial taxa with linear discriminant analysis (LDA) score greater than four in the gut microbiota

2.5 眼斑芫菁幼蟲腸道菌群基因功能預(yù)測

利用PICRUSt軟件對眼斑芫菁幼蟲腸道菌群進行功能分析,得到不同樣品細菌的功能預(yù)測信息。利用KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)數(shù)據(jù)庫,對眼斑芫菁幼蟲腸道細菌基因功能預(yù)測發(fā)現(xiàn),KEGG一級通路中共注釋到6類生物代謝通路,由35個子功能組成,其中與新陳代謝相關(guān)的基因數(shù)量占總數(shù)的45.62%;參與環(huán)境信息處理(18.91%)、遺傳信息處理(14.80%)、細胞工程(2.96%)、人類疾病(1.05%)、生物系統(tǒng)(0.54%)。對一級功能層分析發(fā)現(xiàn),6個功能預(yù)測基因豐度無顯著差異(P>0.05)。對預(yù)測基因的二級功能層分析發(fā)現(xiàn),眼斑芫菁幼蟲腸道菌群基因與11類消化代謝過程相關(guān)(圖6),其中碳水化合物代謝和氨基酸代謝的基因在整個代謝過程中豐度最高,能量代謝以及輔助因子和維生素代謝的基因豐度也相對較高。進一步對預(yù)測基因三級功能層分析發(fā)現(xiàn),L.S4的氨基酸代謝(Amino acid metabolism)比L.H4顯著增強(圖7,P=0.035)。

圖6 Level 2水平的眼斑芫菁幼蟲腸道菌群基因與代謝相關(guān)KEGG patnway注釋Fig.6 KEGG patnway annotation on the correlation between intestinal flora genes and metabolism at Level 2 of M.cichorii larvae

圖7 L.H4與L.S4組間差異顯著的功能分析(三級功能層)Fig.7 Functional analysis of significant difference between L.H4 and L.S4 groups (Level 3)

3 討 論

本研究對以天然食物為食的眼斑芫菁幼蟲(L.H2、L.H4)及以人工飼料為食的眼斑芫菁幼蟲(L.S4)的腸道菌群組成、多樣性及豐度進行分析,共檢測到17個門,27個綱,41個目,71個科,109個屬。昆蟲腸道菌結(jié)構(gòu)組成的主要優(yōu)勢菌集中在變形菌門和厚壁菌門,尤其是鱗翅目[20-22],這一結(jié)論與本研究相同,眼斑芫菁幼蟲腸道優(yōu)勢菌也是變形菌門(Proteobacteria),其相對豐度達到89.2%以上,因此,不同食性的昆蟲腸道微生物具有相似性。

食物、健康狀況、環(huán)境等因素可能影響昆蟲腸道共生菌的種類和數(shù)量。在不同發(fā)育階段,昆蟲腸道內(nèi)菌群豐度有一定差異,不同發(fā)育齡期的內(nèi)生菌多樣性也有差異[23]。本研究表明,以蝗卵為食的眼斑芫菁幼蟲腸道菌菌群物種豐度及多樣性差異較小,但顯著高于以人工飼料為食的4齡幼蟲,因此,可以初步設(shè)想,眼斑芫菁幼蟲腸道菌群的多樣性和豐度受食物影響較大。

不同寄主植物會引起植食性昆蟲腸道微環(huán)境存在差異,進而導致其腸道微生物多樣性的差異[24]。陳勃生等[25]研究發(fā)現(xiàn),家蠶低齡幼蟲與成蟲腸道和卵的表面微生物相似,隨著家蠶生長發(fā)育,高齡幼蟲的腸道微生物與其食物(桑葉)表面的微生物更相近。本研究顯示,具有相同食物來源的眼斑芫菁2齡幼蟲與4齡幼蟲的優(yōu)勢菌群不同,且2齡幼蟲腸道菌群多樣性和豐度比4齡幼蟲高,可能是因為4齡幼蟲取食以后,其腸道菌與食物中的微生物更接近,也證實食物可以影響眼斑芫菁幼蟲的腸道菌群。

腸道細菌在昆蟲宿主中的作用不可或缺,其功能包括幫助消化食物、參與營養(yǎng)吸收、激起免疫反應(yīng)等[20, 26]。研究表明,有相當比例的昆蟲依賴共生菌進行代謝,例如:白蟻(Nasutitermes)腸道細菌可幫助宿主降解纖維素[27],蚜蟲(Acythosiphinpisum)共生菌能夠合成氨基酸[28]。本研究中,眼斑芫菁幼蟲腸道菌群代謝方面的基因注釋較高,說明眼斑芫菁幼蟲腸道菌群在代謝過程中起重要作用,特別是碳水化合物代謝和氨基酸代謝。L.S4的氨基酸代謝(Amino acid metabolism)比L.H4顯著增強。說明,從蝗卵轉(zhuǎn)移至人工飼料組飼養(yǎng)的眼斑芫菁幼蟲腸道細菌會分泌多種消化酶協(xié)助宿主進行氨基酸代謝以及營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用。

4 結(jié) 論

本研究明確了眼斑芫菁幼蟲腸道菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)受食物影響,其腸道細菌在代謝功能上能協(xié)助宿主適應(yīng)相應(yīng)的食物。研究眼斑芫菁幼蟲腸道細菌多樣性與食物之間的關(guān)系,為研究眼斑芫菁腸道微生物變化奠定了基礎(chǔ)。今后的研究應(yīng)從眼斑芫菁各個齡期、不同蟲態(tài)腸道菌群的變化規(guī)律,或者是對不同食物的連續(xù)世代適應(yīng)中的變化來進行研究,并用多組學方法剖析腸道菌在宿主適應(yīng)中的重要作用。