趙佳福,周明帥,徐 暢,楊秀遠(yuǎn),陳 祥

(1.貴州大學(xué)高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴陽(yáng) 550025;2.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,貴陽(yáng) 550025)

【研究意義】黔北麻羊作為貴州省三大優(yōu)良地方山羊品種之一,具有生長(zhǎng)發(fā)育快、體型大、性成熟早、肉質(zhì)香嫩鮮美、無(wú)膻味和皮張品質(zhì)好等特點(diǎn),深受消費(fèi)者的歡迎和喜愛(ài)[1]。研究發(fā)現(xiàn),黔北麻羊繁殖力較強(qiáng),產(chǎn)羔率可達(dá)196%,高于貴州白山羊(160%)和貴州黑山羊(152%)。繁殖率是肉羊養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟(jì)性狀[2],因此,研究黔北麻羊繁殖性狀對(duì)提高其養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益具有重要作用?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】組織蛋白酶 K(Cathepsin K,CTSK)是一種溶酶體半胱氨酸蛋白酶,屬于木瓜蛋白酶超家族成員,存在于溶酶體細(xì)胞內(nèi),是蛋白酶中一個(gè)細(xì)胞外基質(zhì)降解酶[3],廣泛存在于病毒、細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物及原蟲(chóng)、植物、哺乳動(dòng)物和人體中,通過(guò)氨基酸活性部位調(diào)節(jié)對(duì)應(yīng)蛋白的催化活性。對(duì)綿羊的研究發(fā)現(xiàn),在綿羊妊娠的40～120 d可在其子宮胎盤(pán)組織中檢測(cè)到多種組織蛋白酶mRNA的表達(dá),CTSK蛋白在妊娠后期主要分布于子宮內(nèi)膜腺間和胎盤(pán)間,表明在綿羊子宮胎盤(pán)組織中CTSK蛋白可能參與綿羊子宮內(nèi)膜重塑以及胎盤(pán)的形成[4]。纖連蛋白(Fibronectin,FN)是一種分子量為440 kDa的高分子量細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白,是纖維連接蛋白家族的一個(gè)成員,其分子結(jié)構(gòu)中含有多種結(jié)構(gòu)域,可選擇性地與細(xì)胞外基質(zhì)中多種大分子如膠原、肝素、纖維蛋白及細(xì)胞表面受體結(jié)合,在細(xì)胞黏附、遷移、生長(zhǎng)、分化及基質(zhì)重塑等多種細(xì)胞過(guò)程中起至關(guān)重要作用[5],FN1在腫瘤、動(dòng)脈粥樣硬化、關(guān)節(jié)炎等疾病中發(fā)揮著多種生物學(xué)功能[6]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】圍繞前期轉(zhuǎn)錄組學(xué)檢測(cè)結(jié)果,以單羔黔北麻羊卵巢中差異表達(dá)的CTSK和FN1基因?yàn)榍腥朦c(diǎn),研究CTSK、FN1基因在黔北麻羊單羔、多羔性腺軸中的表達(dá)規(guī)律,解析CTSK和FN1基因與黔北麻羊繁殖之間的表達(dá)調(diào)控關(guān)系?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】闡明CTSK、FN1基因不同表達(dá)模式與黔北麻羊繁殖率之間的相互作用關(guān)系,為黔北麻羊多胎品系的選育尋找潛在的關(guān)鍵候選基因和分子標(biāo)記物。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物、試劑及主要儀器

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 黔北麻羊(Qianbei Ma goat)由貴州省習(xí)水縣富興牧業(yè)有限公司提供。選擇健康無(wú)病、繁殖性能正常,體重相近的1～2歲單羔(連續(xù)2胎產(chǎn)單羔)和多羔(連續(xù)2胎產(chǎn)雙羔以上)黔北麻羊各3只,屠宰后分別采集單羔、多羔母羊下丘腦、垂體、子宮、輸卵管和卵巢5個(gè)性腺組織,使用滅菌的錫箔紙包裹組織樣品,貼好標(biāo)簽置于液氮中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑 TRIzol和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于Thermo Fisher科技公司,qPCR Mix購(gòu)于美國(guó)BIO-RAD公司,膠回收試劑盒購(gòu)于Axygen生物技術(shù)有限公司,DNA Marker 2000購(gòu)于大連寶生物工程有限公司,LB培養(yǎng)基粉末購(gòu)于上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司,液氮、氯仿、50×TAE 緩沖液、異丙醇、無(wú)水乙醇、瓊脂糖、氨芐青霉素等購(gòu)自貴州西寶生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器 包括超微量紫外分光光度計(jì)(NANODROP 2000,美國(guó)Thermo Fisher)、恒溫?fù)u床(MaxQ4000,美國(guó)ThermoScientific)、電泳儀(DYY-2C 型,北京六一)、PCR 擴(kuò)增儀(C1000 TouchTM、美國(guó)BIO-RAD)、熒光定量PCR儀(CFX 96,美國(guó)BIO-RAD)、凝膠成像系統(tǒng)(Gel Doc XR,美國(guó)BIO-RAD)、微量瞬時(shí)離心機(jī)(D1008E,大龍)、斡旋混勻儀(VORTEX-1,歐萊博)。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)Genbank公布的山羊CTSK(XM_005677656.3)、FN1(XM_005676508.3)及β-acting基因 mRNA序列,利用Primer Premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)熒光定量 PCR引物,由上海擎科生物科技有限公司合成,引物序列信息見(jiàn)表1。

表1 qPCR引物序列信息Table 1 Primer sequence information of qPCR

1.2.2 RNA的提取及cDNA的合成 利用TRIZOL法提取組織RNA,超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA質(zhì)量,隨后通過(guò)HiFi Saript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,逆轉(zhuǎn)錄體系為20 μL,體系為5×RT Buffer 4 μL、RibolockRnose Inhibitor 1 μL、10 mmol/L dNTP Mix 2 μL、RevertAid M-MuLURT 1 μL、RNase-Free water補(bǔ)充至20 μL。反應(yīng)條件:42 ℃,60 min;70 ℃,5 min,最后將反應(yīng)產(chǎn)物置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)浜罄m(xù)試驗(yàn)。

1.2.3 qPCR檢測(cè) 采用qPCR檢測(cè)CTSK、FN1基因在單羔、多羔黔北麻羊下丘腦、垂體、卵巢、輸卵管、子宮性腺組織中表達(dá)水平。將逆轉(zhuǎn)錄得到的各組織cDNA稀釋至等濃度作為模板,反應(yīng)體系為10 μL:qRT-PCR mix 5 μL、cDNA模板1 μL、上下游引物(100 μmol/L)各0.5 μL、ddH2O 3 μL。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性 2 min,95 ℃變性 15 s,60 ℃退火 30 s,70 ℃延伸30 s并添加機(jī)器自帶的熔解曲線,以β-acting為內(nèi)參基因,每組3個(gè)重復(fù)進(jìn)行qPCR反應(yīng)。

1.3 數(shù)據(jù)處理及生物信息學(xué)分析

qPCR數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,圖表采用GraphPad Prism5進(jìn)行處理。在t檢驗(yàn)中,*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01);在進(jìn)行多重比較分析時(shí),不同字母表示差異極顯著(P< 0.01),相同字母表示差異不顯著(P> 0.05)。使用Expasy網(wǎng)站中的ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)工具分析CTSK、FN1蛋白理化性質(zhì);運(yùn)用SignalP-5.0Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析蛋白信號(hào)肽;使用PSOR(http://psort1.hgc.jp/form.html)預(yù)測(cè)蛋白亞細(xì)胞定位;SOPMA和SWISS預(yù)測(cè)蛋白二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu);使用Megalign進(jìn)行不同物種同源性比較;用MEGA7.0構(gòu)建不同物種系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 CTSK、FN1基因在黔北麻羊單羔、多羔性腺軸中的表達(dá)水平

從圖1看出,CTSK基因在單羔組及多羔組黔北麻羊的卵巢、下丘腦、子宮、輸卵管和垂體中均有表達(dá)。在單羔組中,CTSK基因在卵巢組織中的表達(dá)最高,極顯著高于其他組織,在垂體和輸卵管中的表達(dá)最低;在多羔組中,CTSK基因在卵巢中表達(dá)最高,極顯著高于其他組織,在輸卵管、下丘腦、子宮和垂體中的表達(dá)較低且差異不顯著。CTSK基因在單羔組卵巢、下丘腦、子宮中的表達(dá)均極顯著高于多羔組,在垂體和輸卵管中的表達(dá)差異不顯著。FN1基因在單羔組及多羔組卵巢、下丘腦、子宮、輸卵管和垂體中均有表達(dá)。在單羔組中,FN1基因在輸卵管中的表達(dá)量最高,極顯著高于其他性腺軸組織,在垂體、下丘腦和子宮中的中的表達(dá)量較低,且差異不顯著。在多羔組中,FN1基因在子宮組織中的表達(dá)量最高,極顯著高于其他性腺軸組織,在輸卵管和垂體中的表達(dá)量最低。FN1在多羔組丘腦和子宮組織中的表達(dá)極顯著高于單羔組,在卵巢中的表達(dá)量顯著高于單羔組,垂體和輸卵管中的表達(dá)量極顯著低于單羔組。

圖1 CTSK和FN1基因在黔北麻羊單羔及多羔性腺軸中的表達(dá)量Fig.1 Expression of CTSK gene and FN1 gene in gonadal axis of monotocous and polytocous lambs of Qianbei Ma goat

2.2 黔北麻羊CTSK和FN1基因蛋白理化性質(zhì)

黔北麻羊CTSK基因共編碼330個(gè)氨基酸,相對(duì)分子質(zhì)量37160.25,化學(xué)式C1649H2566N458O490S16,理論P(yáng)I為8.82,在哺乳動(dòng)物體中的半衰期約為30 h。其中帶負(fù)電荷氨基酸殘基(Asp + Glu)總數(shù)34個(gè),帶正電荷的殘基總數(shù)(Arg + Lys)為41個(gè),說(shuō)明該基因編碼的氨基酸序列帶負(fù)電荷。該基因的不穩(wěn)定指數(shù)為31.67,為穩(wěn)定蛋白質(zhì)(不穩(wěn)定系數(shù)<40),脂肪族指數(shù)為77.12,總平均親水性為-0.523,為親水性蛋白。

黔北麻羊FN1基因共編碼2478個(gè)氨基酸,相對(duì)分子質(zhì)量272 070.51,化學(xué)式C11912H18545N3317O3814S88,理論P(yáng)I為5.37,在哺乳動(dòng)物體中的半衰期約為30h。其中帶負(fù)電荷氨基酸殘基(Asp + Glu)總數(shù)為266個(gè),帶正電荷的殘基總數(shù)(Arg + Lys)為206個(gè),說(shuō)明該基因編碼的氨基酸序列帶負(fù)電荷。該基因的不穩(wěn)定指數(shù)為41.14,為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)(不穩(wěn)定系數(shù)>40),脂肪族指數(shù)為69.79,總平均親水性為-0.496,為親水性蛋白。

2.3 黔北麻羊CTSK和FN1基因的亞細(xì)胞定位

使用PSOR II Prediction在線軟件預(yù)測(cè)CTSK、FN1蛋白亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示,CTSK蛋白定位在細(xì)胞外和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的可能性為33.3%,定位在線粒體中的可能性為22.2%,定位在囊泡的可能性為11.1%。FN1蛋白定位在細(xì)胞核的可能性60.9%,定位在線粒體及細(xì)胞外的可能性均為13.0%,小概率定位在囊泡(8.7%)和細(xì)胞質(zhì)(4.3%)中。說(shuō)明CTSK蛋白可能主要在細(xì)胞外和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中發(fā)揮生物學(xué)作用,而FN1蛋白可能主要在細(xì)胞核中發(fā)揮生物學(xué)作用。

2.4 黔北麻羊CTSK和FN1基因信號(hào)肽預(yù)測(cè)

從圖2看出,黔北麻羊CTSK蛋白在16～17位(SFA-LY)氨基酸位置有86.23%的可能性出現(xiàn)信號(hào)肽切割位點(diǎn),且是Sec/SPI信號(hào)肽的可能性為96.33%;黔北麻羊FN1蛋白在27～28位(AGA-SK)氨基酸位置有34.92%的可能性出現(xiàn)信號(hào)肽切割位點(diǎn),且是Sec/SPI信號(hào)肽的可能性為99.35%。說(shuō)明CTSK和FN1蛋白信號(hào)肽均由Sec轉(zhuǎn)運(yùn)子運(yùn)輸,由信號(hào)肽酶Ⅰ(Lep)切割而成,與信號(hào)識(shí)別有關(guān)。

圖2 CTSK和FN1蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.2 Signal peptide prediction of CTSK protein and FN1 protein

2.5 CTSK和FN1基因的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)

從圖3看出,黔北麻羊CTSK蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋(32.7%)、β-轉(zhuǎn)角(5.45%)、無(wú)規(guī)則卷曲(58.47%)與延伸鏈(29.82%)組成;FN1蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋(5.73%)、β-轉(zhuǎn)角(5.97%)、無(wú)規(guī)則卷曲(45.45%)與延伸鏈(16.35%)組成。CTSK蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋與無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成,FN1蛋白質(zhì)則主要為無(wú)規(guī)則卷曲及延伸鏈構(gòu)成,預(yù)測(cè)結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)一致。

圖3 CTSK和FN1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)(A)和三級(jí)結(jié)構(gòu)(B)Fig.3 Secondary structures(A) and tertiary structures (B) of CTSK protein and FN1 protein

2.6 CTSK和FN1基因同源性及遺傳距離

將黔北麻羊CTSK、FN1基因氨基酸序列與不同物種氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)結(jié)果顯示,黔北麻羊CTSK基因與綿羊、牛、豬、狗、馬、兔、人、鼠和雞的同源性分別為99.5%、98.4%、95.9%、95.9%、95.4%、94.7%、94.2%、85.7%和74.9%(圖4-A);黔北麻羊FN1基因與綿羊、牛、豬、狗、馬、人、兔、鼠和雞的同源性分別為99.7%、99.1%、95.8%、95.2%、95.1%、93.9%、93.3%、91.6%和83.2%(圖4-B)。由此可見(jiàn),黔北麻羊CTSK和FN1基因編碼氨基酸序列在不同物種之間具有較高的保守性,均與反芻動(dòng)物綿羊、牛的同源性最高,與小型動(dòng)物或非哺乳動(dòng)物鼠和雞中的同源性最低。從構(gòu)建的不同物種CTSK、FN1基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果證實(shí),黔北麻羊CTSK(圖5-A)和FN1(圖5-B)基因與綿羊、牛等反芻動(dòng)物遺傳距離最近,與鼠和雞的遺傳距離最遠(yuǎn)。

圖4 不同物種CTSK(A)和FN1(B)氨基酸序列的同源性Fig.4 Amino acid sequence homology of CTSK (A) and FN1 (B) in different species

圖5 不同物種CTSK(A)和FN1(B)氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of amino acid sequences of CTSK (A) and FN1 (B) in different species

3 討 論

CTSK基因作為組織蛋白酶家族中被研究得較少的一類(lèi),近年來(lái)較多的研究方向均為與骨質(zhì)疏松或牙周炎[7-9]和腫瘤發(fā)生[10]等有關(guān),Feng等[11-13]研究認(rèn)為,CTSK基因是一種骨質(zhì)疏松靶向蛋白酶,活化的破骨細(xì)胞特異性表達(dá)成熟CTSK基因,且有助于骨組織的重塑與再吸收,CTSK基因缺乏的骨細(xì)胞防止乳汁誘導(dǎo)的骨丟失和甲狀旁腺激素抑制,而雌激素可以下調(diào)CTSK基因的表達(dá)。魏巍等[3]發(fā)現(xiàn),CTSK基因不僅參與機(jī)體正常生理調(diào)節(jié),而且在多種疾病如實(shí)體瘤、關(guān)節(jié)炎、椎間盤(pán)退行性改變等中均異常表達(dá)。Li等[14]研究表明,CTSK基因被確定為腸道菌群失衡與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移之間的重要中介,與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良相關(guān)。但近年來(lái)CTSK基因在家畜、山羊上的研究則比較少見(jiàn)。Balatsky等[15]研究表明,肌肉內(nèi)脂肪含量和嫩度受CTSK等位基因變異的影響,CTSK基因可能與優(yōu)質(zhì)瘦肉的生產(chǎn)特別相關(guān)。Suárez-Vega等[16]研究發(fā)現(xiàn),CTSK基因還可能與綿羊的奶酪量與品質(zhì)性狀有關(guān)。本研究中,qPCR結(jié)果顯示,CTSK基因在單羔組卵巢、下丘腦、子宮中的表達(dá)均極顯著高于多羔組,這與 Balboula[17]的研究一致;Balboula等研究發(fā)現(xiàn),與質(zhì)量較差的胚胎相比,優(yōu)質(zhì)胚胎或優(yōu)質(zhì)卵裂球表現(xiàn)出更強(qiáng)的自噬活性和較少的CTSK基因活性,且抑制CTSK基因會(huì)降低IVP牛胚胎的發(fā)育率(增加囊胚和孵化率)和質(zhì)量(增加細(xì)胞總數(shù)和降低凋亡細(xì)胞百分比),此外,下丘腦-垂體-卵巢軸通過(guò)調(diào)節(jié)激素分泌對(duì)哺乳動(dòng)物卵巢卵泡的發(fā)育具有重要影響[18-20],而CTSK基因在單羔組卵巢和下丘腦組織中高表達(dá),說(shuō)明CTSK基因可能與胚胎質(zhì)量和卵泡發(fā)育具有負(fù)向調(diào)控關(guān)系。

FN1基因作為纖維連接蛋白家族中的一員,是一種參與細(xì)胞粘附和遷移過(guò)程的糖蛋白,被普遍研究認(rèn)為與癌癥的發(fā)生途徑有關(guān)。在癌癥病例中,FN1基因的高表達(dá)往往被視為預(yù)后不良,FN1基因在GAC腫瘤組織中的表達(dá)水平均顯著高于正常組織[21]。Qiu等[22]研究發(fā)現(xiàn),FN1在甲狀腺乳頭狀癌(PTC)進(jìn)展中發(fā)揮重要作用,可能作為PTC預(yù)后的標(biāo)志物。在生殖過(guò)程中FN1基因也發(fā)揮著不同的功能,如受精和著床。FN1基因的表達(dá)從桑椹胚到囊胚早期顯著增加,這表明FN1基因可能也參與了早期囊胚的形成。Goossens等[23]研究認(rèn)為,FN1可能在囊胚形成過(guò)程中發(fā)揮特定的功能,胚胎FN1基質(zhì)具有黏附性,將細(xì)胞連接在一起,并為細(xì)胞層遷移提供底物。Cai等[24]研究發(fā)現(xiàn),敲低FN1基因能顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和遷移;樊慶燦[25]對(duì)雞胚的研究表明,FN1基因通過(guò)結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞表面受體、纖維蛋白等特異性結(jié)合,調(diào)控細(xì)胞的遷移、分化和黏附,參與胚胎細(xì)胞分化和器官形成,在胚胎發(fā)育中起到重要的調(diào)節(jié)作用。本研究表明,FN1基因在多羔組下丘腦、子宮和卵巢組織中的表達(dá)均顯著高于單羔組,推測(cè)FN1可能通過(guò)卵巢及子宮細(xì)胞的增殖及遷移,促進(jìn)胚胎發(fā)育,與動(dòng)物繁殖性狀可能具有正向調(diào)控關(guān)系。因此,CTSK和FN1基因作為影響黔北麻羊繁殖力高低的重要候選基因還需作進(jìn)一步的研究。

4 結(jié) 論

CTSK、FN1基因分別編碼330和2478個(gè)氨基酸,理論P(yáng)I分別為8.82和5.37,CTSK是一種具有信號(hào)肽的穩(wěn)定親水性蛋白,而FN1是一種具有信號(hào)肽的不穩(wěn)定親水性蛋白;亞細(xì)胞定位結(jié)果說(shuō)明:CTSK蛋白可能主要在細(xì)胞外和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中發(fā)揮生物學(xué)作用,而FN1蛋白可能主要在細(xì)胞核中發(fā)揮生物學(xué)作用;高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,CTSK和FN1蛋白均主要由無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成;與其他動(dòng)物相比,黔北麻羊CTSK、FN1基因均與反芻動(dòng)物綿羊及牛的親緣關(guān)系最近。qPCR表明:CTSK和FN1基因在單羔組及多羔組黔北麻羊的卵巢、下丘腦、子宮、輸卵管和垂體中均有表達(dá);CTSK基因在單羔組卵巢、下丘腦、子宮中的表達(dá)均極顯著高于多羔組,在垂體和輸卵管中的表達(dá)差異不顯著(P>0.05);FN1在多羔組丘腦和子宮組織中的表達(dá)極顯著高于單羔組,在卵巢中的表達(dá)量顯著高于單羔組(P<0.05),在垂體和輸卵管中的表達(dá)量極顯著低于單羔組。CTSK基因表達(dá)量與黔北麻羊的繁殖性狀有一定的負(fù)相關(guān),FN1基因表達(dá)量與黔北麻羊的繁殖性狀有一定的正相關(guān),兩者均與動(dòng)物繁殖性狀密切相關(guān)。