隋 哲,程 旭,王海燕,余海忠

(1.湖北文理學(xué)院食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院·化學(xué)工程學(xué)院,湖北 襄陽(yáng) 441053;2.襄陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院,湖北 襄陽(yáng) 441057)

【研究意義】甾體皂苷是百合科山麥冬屬植物襄麥冬(Liriopespicatavar.proliferaY. T. Ma)塊根中的主要活性成分之一,具有抗腫瘤等多種藥理活性,在臨床醫(yī)學(xué)、食品營(yíng)養(yǎng)學(xué)等研究中日益受到關(guān)注[1-4]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前,甾體皂苷的生產(chǎn)以中藥材(如襄麥冬等)為原料,通過(guò)分離純化工藝進(jìn)行制備[5]。提高襄麥冬的產(chǎn)量,對(duì)實(shí)現(xiàn)甾體皂苷的穩(wěn)定供應(yīng)具有重要意義。然而,由于麥冬塊根的生產(chǎn)周期長(zhǎng)、皂苷含量低、大田的連作障礙等因素制約了襄麥冬產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[6]。研究表明,植物皂苷類成分的含量及組成,不僅隨植物遺傳背景、組織類型、生長(zhǎng)年齡、生理狀況、環(huán)境因子的改變而發(fā)生顯著變化,還取決于皂苷合成酶及其相關(guān)基因的表達(dá)水平[7-10]。進(jìn)一步研究顯示,隨著生育期的延長(zhǎng),襄麥冬塊根中甾體皂苷的含量會(huì)逐步升高,在快速膨大期和采收期達(dá)到峰值[5, 11-13]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】據(jù)此可認(rèn)為,甾體皂苷合成酶基因在不同的襄麥冬塊根生長(zhǎng)發(fā)育階段的表達(dá)具有差異性。若結(jié)合現(xiàn)有研究方法如高通量測(cè)序等,則能從分子水平對(duì)甾體皂苷的形成過(guò)程進(jìn)行解析,挖掘甾體皂苷合成相關(guān)酶的基因及相關(guān)基因的表達(dá)特點(diǎn),以更深入全面了解甾體皂苷的形成途徑及影響因素[14-17]?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以襄麥冬基因組為研究對(duì)象,挖掘麥冬的甾體皂苷生物合成調(diào)控酶的基因,分析其表達(dá)情況。采集始見(jiàn)期和膨大期的襄麥冬塊根樣品,通過(guò)高通量測(cè)序比較分析2個(gè)轉(zhuǎn)錄組中的表達(dá)差異基因,并從分子水平上探究襄麥冬甾體皂苷的生物合成機(jī)理,從而為提高甾體皂苷的產(chǎn)量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料采自漢江中游湖北襄陽(yáng)歐廟襄麥冬良好農(nóng)業(yè)規(guī)范(Good agricultural practices,GAP)種植基地,分別在襄麥冬塊根始見(jiàn)期、塊根膨大期選擇生長(zhǎng)良好的植株,剪取塊根樣品(圖1)加入液氮速凍后,置于-80 ℃保存。

A:始見(jiàn)期樣品;B:膨大期樣品。A:Samples of initial onset stages(XMDSJQ);B:Samples of expansion stages(XMDPDQ).圖1 襄麥冬塊根始見(jiàn)期和膨大期的樣品Fig.1 Samples from the root tubers of Liriope spicata var. prolifera at the initial onset stage or expansion stage

1.2 主要儀器和試劑

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Bio-Rad,美國(guó));Agilent 2100生物分析儀(Agilent,美國(guó))。主要試劑:Plant RNA Purification Reagent (Invitrogen,美國(guó))、TruseqTM RNA sample prep Kit(Illumina,美國(guó))、TBS380 Picogreen (Invitrogen,美國(guó))、Certified Low Range Ultra Agarose(Bio-Rad,美國(guó))、cBot Truseq PE Cluster Kit v3-cBot-HS(Illumina,美國(guó))、Hiseq2000 Truseq SBS Kit v3-HS (200-cycles)(Illumina,美國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 總RNA的提取與Illumina測(cè)序 按照Invitrogen公司的Plant RNA Purification Reagent kit提取襄麥冬塊根總RNA。對(duì)總RNA進(jìn)行定量并電泳分析完整性后,置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司,采用HiSeqTM2000平臺(tái)對(duì)構(gòu)建的2個(gè)cDNA文庫(kù)進(jìn)行Illumina測(cè)序。

1.3.2 生物信息學(xué)分析 使用Trinity軟件(http://trinityrnaseq.github.io/)對(duì)質(zhì)檢處理的序列進(jìn)行從頭測(cè)序與拼接。使用RSEM(http://deweylab.biostat.wisc.edu/rsem)和edge R軟件(http://www. bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html)對(duì)差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。使用Trinity軟件對(duì)拼接結(jié)果進(jìn)行開(kāi)放閱讀框(Open Reading Frame,ORF)的預(yù)測(cè),使用Blast軟件完成序列功能注釋。使用blast2go軟件(http://www.blast2go.com/b2ghome)進(jìn)行基因本體(Gene Ontology,GO)的功能分類。使用blastx 2.2.24+軟件比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)STRING 9.0 (http://string-db.org/),完成基因產(chǎn)物的分類(Clusters of Orthologous Groups,COG)。使用blastx/blastp 2.2.24+軟件進(jìn)行代謝通路的分析。使用goatools軟件(https://github.com/tanghaibao/goatools)對(duì)差異基因進(jìn)行GO功能顯著性富集分析。使用KOBAS軟件(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/home.do)對(duì)各組基因差異的表達(dá)進(jìn)行代謝通路(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)的顯著性富集分析。

1.3.3 基因驗(yàn)證和分析 根據(jù)樣本轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析結(jié)果,從篩選獲得的差異表達(dá)基因中選取8個(gè)關(guān)鍵基因,采用反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR技術(shù)(Real time quantitative PCR,RT-qPCR)驗(yàn)證Illumina測(cè)序結(jié)果,并對(duì)襄麥冬塊根膨大期的差異表達(dá)基因進(jìn)行表達(dá)譜分析,包括糖基轉(zhuǎn)移酶保守結(jié)構(gòu)域(Glycosyl transferase family 8 protein,GTF8,comp11269_c0_seq4)、環(huán)阿齊醇合成酶(Cycloartenol synthase,CS,comp1761_c0_seq5)、角鯊烯合成酶(Squalene synthase,SS,comp13813_c0_seq1)、單萜烯合成酶(Monoterpene synthases,MS,comp15786_c0 _seq2)、F26G(comp309_c0_seq3)、甾醇14α-去甲基化酶(Obtusifoliol 14alpha-demethylase,OF14D,comp444_c0_seq4)、甾酮C27單加氧酶2(Sterol 4-alpha-methyl-oxidase 2,SMO2,comp939_c0_seq8)和環(huán)丙基固醇異構(gòu)酶(Cycloprop Yl sterol isomerase1,CPI1,comp4924_c0_seq9)。各個(gè)基因在轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)情況見(jiàn)表1。利用Primer Express 3.0設(shè)計(jì)定量PCR特異性引物,并將翻譯延長(zhǎng)因子(Translation elongation factor,TEF)和(Translation β-tubulin,TUB)作為內(nèi)參基因,引物如表2所示。

表1 襄麥冬轉(zhuǎn)錄組中8個(gè)關(guān)鍵基因的測(cè)序結(jié)果Table 1 The sequencing results of 8 key isogenes from the transcriptome of Liriope spicata var. prolifera

表2 RT-qPCR分析的引物Table 2 The primers designed for RT-qPCR

構(gòu)建25 μL RT-qPCR反應(yīng)體系:SYBR?Premix ExTaqTM II,12.5 μL;上游引物(10 μmol/L)1 μL;下游引物(10 μmol/L)1 μL;cDNA 2 μL;ddH2O 8.5 μL。RT-qPCR反應(yīng)程序:95 ℃ 預(yù)變性2 min;95 ℃ 變性 30 s,58 ℃ 退火 30 s,72 ℃ 延伸 30 s,45 個(gè)循環(huán);95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,80次循環(huán);55 ℃降溫至0.5 ℃ 10 s。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)的去雜及拼接分析

完成襄麥冬塊根始見(jiàn)期和膨大期2個(gè)樣品XMDPDQ、XMDSJQ的Iiilumia測(cè)序,共得到12.9 GB的原始數(shù)據(jù)。去除測(cè)序質(zhì)量值低于25的reads、接頭污染的reads、含N較多的reads以及經(jīng)過(guò)以上步驟后長(zhǎng)度小于25 nt的reads,分別獲得高質(zhì)量序列59 405 731和71 478 348條。對(duì)上述質(zhì)控后的高質(zhì)量序列進(jìn)行從頭測(cè)序并拼接,共得到56 067個(gè)genes和118 265個(gè)isogenes。isogene長(zhǎng)度在351～15 626 bp,平均長(zhǎng)度787 bp,其中以401～600 bp長(zhǎng)度區(qū)間內(nèi)分布的Contig數(shù)量最多,占36.17%,拼接結(jié)果如表3所示,isogene大小分布趨勢(shì)如圖2所示。

表3 襄麥冬樣品的Illumina 測(cè)序拼接結(jié)果Table 3 Summary of the sequence assembly after Illumina sequencing of Liriope spicata var. prolifera

圖2 襄麥冬樣品的isogene大小分布趨勢(shì)Fig.2 Size distribution of isogene of Liriope spicata var. prolifera

2.2 表達(dá)量統(tǒng)計(jì)及表達(dá)差異分析

首先,利用RSEM軟件分別統(tǒng)計(jì)與isogenes和genes相匹配的reads數(shù)量,以此數(shù)量來(lái)計(jì)算isogenes和genes的表達(dá)量。隨后,利用edgeR軟件對(duì)統(tǒng)計(jì)的reads數(shù)量進(jìn)行均一化,據(jù)此對(duì)基因的差異表達(dá)情況進(jìn)行分析,確定P-value、FDR值均小于0.05的基因?yàn)椴町惐磉_(dá)基因。

從圖3可知,在襄麥冬塊根迅速膨大生育期XMDPDQ樣品中,共有993條差異表達(dá)的genes和5562條差異表達(dá)的isogenes,上調(diào)表達(dá)的genes有139條,上調(diào)表達(dá)的isogenes有2157條。

A:在樣本XMDPDQ與XMDSJQ差異表達(dá)的gene;B:在樣本XMDPDQ與XMDSJQ中差異表達(dá)的isogene。紅色點(diǎn)表示在兩個(gè)樣本中都表達(dá)的差異基因(P<0.05,FDR<0.05);黑色點(diǎn)表示在兩個(gè)樣本中都表達(dá)的非差異基因;黃色部分表示僅在一個(gè)樣本中表達(dá)的基因。A:Differentially expressed genes from two stage samples;B:Differentially expressed isogenes from two stage samples.The red pots were differentially expressed genes between samples (P<0.05, FDR<0.05); The black pots were the genes expressed in all the samples; The yellow part indicated the genes only expressed in one sample.圖3 樣本XMDPDQ與XMDSJQ差異表達(dá)基因Fig.3 Visualization of differentially expressed genes between XMDPDQ and XMDSJQ

2.3 拼接序列的基因預(yù)測(cè)與注釋

使用Trinity軟件對(duì)拼接序列進(jìn)行ORF預(yù)測(cè),其中,預(yù)測(cè)出ORF的序列有62 507條,未預(yù)測(cè)出ORF的序列有55 758條。預(yù)測(cè)核酸cds序列的長(zhǎng)度最短為150 bp,最長(zhǎng)為15 357 bp,具體長(zhǎng)度分布如圖4所示。

圖4 預(yù)測(cè)的cds長(zhǎng)度分布Fig.4 Size distribution of predicted cds

同時(shí),將上述預(yù)測(cè)出ORF的蛋白序列使用Blastp、未預(yù)測(cè)出ORF的DNA序列使用Blastx分別與NCBI NR、String、KEGG Genes數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),完成所有拼接的注釋,比對(duì)參數(shù)設(shè)置期望值E-value為1e-5。能注釋到三大數(shù)據(jù)庫(kù)中的拼接序列數(shù)量如表4所示。預(yù)測(cè)出ORF的蛋白序列有14 665條可注釋到Genes庫(kù);有45 043條可注釋到NR庫(kù),相似性介于35%～100%,其中335條達(dá)100%;有10 007條可注釋到String庫(kù),相似性介于75%～100%,其中111條達(dá)100%。未預(yù)測(cè)出ORF的DNA序列有3802條可注釋到Genes庫(kù);有13 515條可注釋到NR庫(kù),相似性介于28%～100%,其中315條達(dá)100%;有1207條可注釋到String庫(kù),相似性介于75%～100%,其中42條達(dá)100%。

表4 拼接序列與NR, String和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中公共數(shù)據(jù)的對(duì)比Table 4 BLAST result of isogenes against the data from three databases (NR, String and KEGG)

2.4 GO功能分類與富集顯著性分析

比對(duì)GO數(shù)據(jù)庫(kù),完成42 388條拼接序列的GO注釋。其中,歸屬于生物學(xué)過(guò)程的25個(gè)功能組基因中,細(xì)胞過(guò)程類群注釋的基因最多(圖5),有24 409條,占比57.59%;在細(xì)胞組分19個(gè)功能組中,細(xì)胞類群注釋的基因最多,有28 131條,占比66.37%;在分子功能16個(gè)功能組中,催化活性類群注釋的基因最多,有22 028條,占比51.97%。說(shuō)明,本研究所建立并分析的轉(zhuǎn)錄組功能性基因,分別涉及襄麥冬生長(zhǎng)及皂苷代謝的核心環(huán)節(jié),因此可作為GO富集顯著性分析的對(duì)象。

圖5 GO功能的分類Fig.5 GO function classification of isogene

GO富集顯著性分析發(fā)現(xiàn),在2個(gè)轉(zhuǎn)錄組中存在5563個(gè)差異表達(dá)基因,分布在357個(gè)功能類群中,其中差異基因分布數(shù)量最多的功能類群為分子功能(2657個(gè)差異基因)、生物過(guò)程(2409個(gè))、細(xì)胞組成(2342個(gè))、細(xì)胞部分(1954個(gè))、催化活性(1873個(gè))、胞內(nèi)組分(1802個(gè))、細(xì)胞過(guò)程(1713個(gè))、代謝過(guò)程(1684個(gè))、結(jié)合(1669個(gè))、胞內(nèi)細(xì)胞器(1389個(gè))。差異基因分布數(shù)量最少的功能類群為類胡蘿卜素雙加氧酶活性、9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶活性以及表皮結(jié)構(gòu)組成,均只有4個(gè)基因。說(shuō)明,始見(jiàn)期與膨大期襄麥冬在生命活動(dòng)能力上差異顯著,暗示了皂苷合成與代謝水平間的關(guān)系:即膨大期的細(xì)胞功能更活躍,皂苷合成水平更高。

2.5 差異基因的COG/KOG注釋

比對(duì)COG數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)預(yù)測(cè)差異基因的可能功能,共有10 077條序列可注釋到23個(gè)COG類群(圖6-A)?；驍?shù)目最多的是一般功能預(yù)測(cè)基因,預(yù)測(cè)出2129功能基因條,占比21.13%,為最大類群,其后3位依次是轉(zhuǎn)錄(9.94%)、復(fù)制、重組及修復(fù)(9.21%)以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制(8.47%),而細(xì)胞動(dòng)力僅有0.12%,為最小類群。同時(shí),比對(duì)KOG數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn),共有8187條序列可注釋到25個(gè)KOG類群(圖6-B)?；驍?shù)最多的是一般功能預(yù)測(cè)基因,預(yù)測(cè)基因1388條,占比16.95%,為最大類群。其后3位依次是轉(zhuǎn)錄后修飾與蛋白伴侶(11.10%)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制(9.16%)、轉(zhuǎn)錄(6.88%),而細(xì)胞動(dòng)力僅有0.06%,為最小類群。

A.COG分類比例的統(tǒng)計(jì);B.KOG分類比例的統(tǒng)計(jì)。A.COG function classification of the two-staged samples; B.KOG function classification of the two-staged samples.圖6 同源蛋白簇的分析Fig.6 Histogram presentation of COG classification and KOG classification

在信息存儲(chǔ)和加工(Information storage and processing)類別中,歸類到核酸復(fù)制、修復(fù)及轉(zhuǎn)錄過(guò)程(Replication, repair and transcription)的差異基因最多;在細(xì)胞過(guò)程與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Cellular processing and singaling)類別中,歸類到蛋白修飾與折疊的差異基因最多;在細(xì)胞代謝(Metabolism)類別中,歸類到碳水化合物運(yùn)輸與代謝、氨基酸運(yùn)輸與代謝的差異基因最多。說(shuō)明,襄麥冬在不同生長(zhǎng)期的生命活動(dòng)差異顯著,并由此影響麥冬皂苷的合成。

2.6 KEGG功能分類與富集顯著性分析

采用KOBAS軟件,對(duì)各組差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG代謝通路顯著性富集分析,發(fā)現(xiàn)共有26 626條拼接序列可映射到不同的KEGG途徑中。KEGG富集顯著性分析(Qvalue≤0.05)發(fā)現(xiàn),在襄麥冬塊根始見(jiàn)期、膨大期,共有1981個(gè)差異表達(dá)基因映射到227條KEGG途徑,其中細(xì)胞周期通路(60個(gè)差異基因)、酵母細(xì)胞周期(52個(gè)差異基因)和淀粉及蔗糖代謝(51個(gè)差異基因)為3個(gè)主要的途徑。

綜上,上述轉(zhuǎn)錄組基因注釋、分類及顯著性分析結(jié)果均表明,襄麥冬在不同生長(zhǎng)期的生命代謝活動(dòng)差異顯著,基礎(chǔ)代謝差異對(duì)皂苷合成的相關(guān)代謝產(chǎn)生影響。

2.7 與甾體皂苷生物合成相關(guān)的基因

通過(guò)基因功能分類及富集顯著性分析,初步梳理出43個(gè)可能參與甾體皂苷生物合成的差異表達(dá)基因,主要分布在倍半萜和三萜生物合成(Sesquiterpenoid and triterpenoid biosynthesis)(圖7)、類固醇生物合成(Steroid biosynthesis)、油菜類固醇生物合成(Brassinosteroid biosynthesis)、淀粉和蔗糖代謝(Starch and sucrose metabolism)等KEGG途徑中。

圖7 參與甾體皂苷生物合成的基因在相關(guān)KEGG途徑中的分布預(yù)測(cè)Fig.7 Predicted distribution of genes involved in Steroidal saponin biosynthesis in the related KEGG pathways

在上述初步篩選的43個(gè)基因中,有8個(gè)基因的表達(dá)在不同生長(zhǎng)階段的襄麥冬塊根中具有顯著差異。在襄麥冬塊根膨大期,上調(diào)表達(dá)的有角鯊烯合成酶基因(comp13813_c0_seq1、comp13813_c0_seq2)、環(huán)阿屯醇合成酶基因(comp1761_c0_seq1、comp1761_c0_seq2、comp1761_c0_seq7、comp1761_c0_seq4、comp1761_c0_seq5)等,下調(diào)表達(dá)的有SMO1基因(comp669_c0_seq1)、SMO2基因(comp939_c0_seq2、comp939_c0_seq1)、呋甾皂苷26-O-β-葡萄糖苷酶基因(Furostanol glycoside 26-O-beta-glucosidase,F26G,comp309_c0_seq1、comp309_c0_seq2、comp309_c0_seq3、comp5904_c0_seq6)等。

2.8 RT-qPCR驗(yàn)證

通過(guò)RT-qPCR驗(yàn)證選擇的8個(gè)基因,發(fā)現(xiàn)其在襄麥冬的不同時(shí)期表現(xiàn)出不同的表達(dá)量,且結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果相符(圖8)。

柱狀圖表示基因的相對(duì)表達(dá)量,誤差線表示每次實(shí)驗(yàn)的差異。*表示在以MM為對(duì)照的0.05水平相對(duì)顯著。其中,A～D表示在膨大期表達(dá)上調(diào)的基因:A表示Glycosyl transferase family 8 protein基因在兩階段襄麥冬塊根中的表達(dá)差異;B表示Squalene synthase基因在兩階段襄麥冬塊根中的表達(dá)差異;C表示Cycloartenol synthase基因在兩階段襄麥冬塊根中的表達(dá)差異;D表示Monoterpene synthases基因在兩階段襄麥冬塊根中的表達(dá)差異;E～H表示在塊根膨大期下調(diào)的基因:E表示F26G基因在兩階段襄麥冬塊根中的表達(dá)差異;F表示1,4-beta-D-xylan synthase基因在兩階段襄麥冬塊根中的表達(dá)差異;G表示SMO2基因在兩階段襄麥冬塊根中的表達(dá)差異;H表示CPI1基因在兩階段襄麥冬塊根中的表達(dá)差異。The up-regulated genes extracted from swelled samples were shown in A-D, which were GTF8, SS, CS and MS, respectively;The down-regulated genes extracted from swelled samples were shown in E-H, which were gene F26G, OF14D, SMO2 and CPI1, respectively.圖8 RT-qPCR驗(yàn)證XMDSJQ和XMDPDQ的基因表達(dá)結(jié)果Fig.8 The results of RT-qPCR between XMDSJQ and XMDPDQ

3 討 論

本研究通過(guò)對(duì)始見(jiàn)期襄麥冬塊根和膨大期襄麥冬塊根轉(zhuǎn)錄組的比較分析,發(fā)現(xiàn)在襄麥冬的不同生育期,參與調(diào)控代謝甾體皂苷生成的蛋白和酶基因存在差異性表達(dá),初步梳理出43個(gè)可能直接參與甾體皂苷生物合成的差異表達(dá)基因。通過(guò)GO功能分類和COG/KOG功能標(biāo)注,發(fā)現(xiàn)除一般性的功能基因外,差異基因主要參與核酸及蛋白質(zhì)合成過(guò)程及氨基酸和碳水化合物運(yùn)輸與代謝等相關(guān)基因,一方面說(shuō)明不同生長(zhǎng)階段的襄麥冬塊根發(fā)育過(guò)程中蛋白質(zhì)和核酸的合成情況有較大差異,另一方面說(shuō)明它們對(duì)碳水化合物、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝與運(yùn)輸能力也有較大差異。即不同生長(zhǎng)階段的襄麥冬在合成代謝與分解代謝兩方面的基因表達(dá)差異明顯,由此推測(cè)不同階段襄麥冬的代謝狀況差異明顯。

在KEGG富集分析中,對(duì)26 626條拼接序列進(jìn)行了富集差異性分析,結(jié)果顯示主要有3條代謝通路在分析中都得到了顯著性富集,大量的細(xì)胞周期相關(guān)基因、酵母細(xì)胞周期相關(guān)基因和能量代謝相關(guān)基因參與襄麥冬塊根組織的生長(zhǎng)發(fā)育,調(diào)節(jié)襄麥冬塊根組織細(xì)胞的增殖以及能量的供應(yīng),是襄麥冬組織中甾體皂苷表達(dá)的先決條件。在此基礎(chǔ)上,針對(duì)甾體皂苷生物合成相關(guān)基因的分析結(jié)果顯示,共有43個(gè)差異基因可能參與甾體皂苷的生物合成,主要映射到倍半萜和三萜生物合成、類固醇生物合成等多個(gè)次生代謝產(chǎn)物合成通路注釋基因,說(shuō)明不同生長(zhǎng)階段的襄麥冬塊根組織次級(jí)代謝水平存在顯著差異。

在初步篩選的43個(gè)基因中,發(fā)現(xiàn)8個(gè)差異性表達(dá)顯著的基因,轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果與RT-qPCR的驗(yàn)證結(jié)果相符。相較于始見(jiàn)期樣本,在膨大期樣本中有4個(gè)基因表達(dá)上調(diào)。①糖基轉(zhuǎn)移酶(Glycosyl transferase family 8 protein,GTF8):可催化環(huán)化三萜類化合物的糖基化,是皂苷生物合成的關(guān)鍵酶;②角鯊烯合成酶(Squalene synthase,SS):角鯊烯合成的關(guān)鍵酶,催化異戊二烯途徑中的碳流向三萜生物合成,而且角鯊烯合成酶的活性與角鯊烯等三萜化合物的含量相關(guān),而2,3-氧化角鯊烯是甾體皂苷與萜類化合物的分支和前體物質(zhì);③環(huán)阿屯醇合成酶(Cycloartenol synthase,CS):催化2,3-氧化角鯊烯成環(huán)形成甾體皂苷元的初始碳架-環(huán)阿屯醇,隨后在酶的連續(xù)催化下形成膽固醇;④單帖合成酶(Monoterpene synthases,MS):單萜生物合成的關(guān)鍵酶。根據(jù)現(xiàn)有研究,上述4種酶均在甾體皂苷及皂苷元的生物合成中發(fā)揮重要作用[18-23],其表達(dá)上調(diào),表明膨大期的襄麥冬中進(jìn)行著更旺盛的甾體皂苷合成代謝。而在下調(diào)的基因中,包含消化呋甾皂苷C26葡萄糖水解酶的基因(Furostanol glyscoside 26-O-β-glucosidase,F26G)、裂解細(xì)胞壁并促進(jìn)甾體皂苷釋放的木聚糖酶的基因(1,4-beta-D-xylan synthase,OF14D)等[24-25]。除了挖掘并驗(yàn)證合成的甾體皂苷關(guān)鍵酶基因外,上調(diào)基因與下調(diào)基因的功能對(duì)比還表明,襄麥冬塊根內(nèi)皂苷的生物合成與其生長(zhǎng)狀態(tài)緊密關(guān)聯(lián),甾體皂苷主要合成于膨大期的襄麥冬塊根內(nèi)。

4 結(jié) 論

初步揭示與襄麥冬甾體皂苷生物合成有潛在關(guān)聯(lián)的基因和代謝通路,為今后進(jìn)一步研究襄麥冬甾體皂苷的主要關(guān)聯(lián)基因及代謝通路的功能以闡明其合成機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。