付 群,李長(zhǎng)新,王 佳,宋 昕

隱球菌性腦膜炎(cryptococcal meningitis)是由嚴(yán)重的真菌感染而引發(fā)的疾病,通過(guò)血源性擴(kuò)散從原發(fā)性肺病灶擴(kuò)散至大腦,該疾病常見(jiàn)于細(xì)胞介導(dǎo)的免疫功能低下人群,具有極高的發(fā)病率和死亡率,因此,α詳細(xì)了解其治療藥物對(duì)該疾病的治療機(jī)制十分必要[1-3]。NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)炎性小體可通過(guò)響應(yīng)微生物感染和細(xì)胞損傷,激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase-1),并介導(dǎo)促炎細(xì)胞因子白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)的分泌,是先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分,其異常激活與炎癥性疾病密切有關(guān)[4]。有研究表明,新生隱球菌可依賴于鉀離子外流和吞噬溶酶體膜的滲漏激活炎性小體,而抑制NLRP3炎性小體的激活可有效改善隱球菌性腦膜炎造成的腦損傷[5]。氟康唑(fluconazole)是一種唑類藥物,具有有效的抗真菌活性,能夠高效率穿過(guò)血腦屏障,已被用于治療隱球菌性腦膜炎[6]。目前,關(guān)于氟康唑的研究多與臨床相關(guān),而關(guān)于其對(duì)隱球性菌腦膜炎的治療機(jī)制是否與NLRP3炎性小體有關(guān)尚未明確。因此,本研究通過(guò)構(gòu)建隱球菌性腦膜炎小鼠模型,探究氟康唑是否可通過(guò)調(diào)控NLRP3炎性小體通路影響隱球菌性腦膜炎小鼠腦小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康的雄性C57BL/6小鼠100只,體質(zhì)量15～22 g,購(gòu)自華中科技大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,許可證號(hào):SCXK(鄂)2016—0009,于12 h/12 h正常明暗交替、相對(duì)濕度40%～70%的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d,期間自由采食、飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合國(guó)家倫理準(zhǔn)則及實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物護(hù)理及使用方針,且實(shí)驗(yàn)過(guò)程中嚴(yán)格進(jìn)行質(zhì)量控制。

1.2 細(xì)菌培養(yǎng) 于沙保斜面培養(yǎng)基中接種隱球菌菌株后,在35 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d,生理鹽水沖洗后將懸浮液調(diào)整為4.8×105cfu/mL。

1.3 主要試劑及儀器 隱球菌菌株購(gòu)自上海醫(yī)學(xué)真菌實(shí)驗(yàn)室;腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒(貨號(hào):CSB-EQ023955MO-1、CSB-E04639m-1、E-EL-M0046km)購(gòu)自上海恒斐生物科技有限公司;氟康唑標(biāo)準(zhǔn)品(純度:99%,規(guī)格:5 g,貨號(hào):K0040)購(gòu)自上海寶曼生物科技有限公司;注射用兩性霉素B(規(guī)格:每支25 mg,國(guó)藥準(zhǔn)字H13020284)購(gòu)自華北制藥股份有限公司;蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(貨號(hào):G1120-100)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)檢測(cè)試劑盒、免疫組化試劑盒購(gòu)自上海嶸崴達(dá)實(shí)業(yè)有限公司(貨號(hào):4890-025-K、11719386001);二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測(cè)試劑盒、免疫熒光試劑盒、DMEM/F12培養(yǎng)基、兔抗鼠離子鈣結(jié)合銜接分子1(ionized calcium binding adapter molecule 1,Iba1)購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司(貨號(hào):ALH371-QIP、KFS019、SNM544-UEO、K18238-XID);兔抗鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)二抗抗體均購(gòu)自亞科因(武漢)生物技術(shù)有限公司(貨號(hào):A01021、A21020);兔抗鼠Rab5購(gòu)自上海恒斐生物科技有限公司(貨號(hào):Rab5 Antibody);兔抗鼠Caspase-1購(gòu)自武漢博歐特生物科技有限公司(貨號(hào):orb621674);NLRP3購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司(貨號(hào):AF2155);蛋白提取試劑盒購(gòu)自武漢純度生物科技有限公司(貨號(hào):CD-13559-ML);新型隱球菌購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院(編號(hào):BNCC225501);蛋白凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司;熒光顯微鏡購(gòu)自?shī)W林巴斯。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物模型制備及分組給藥 將50 g氟康唑溶于500 mL生理鹽水中配制成100 mL含0.4 g氟康唑的注射液。將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham組)、隱球菌性腦膜炎模型組(CM組)、兩性霉素B組(AmB組)、氟康唑低劑量組(FCZ-L組)、氟康唑高劑量組(FCZ-H組),每組20只[7]。除對(duì)照組外其余小鼠用10 mL/kg戊巴比妥鈉麻醉、消毒后切開(kāi)顱頂皮膚暴露顱骨,沿中線后3 mm、側(cè)面1 mm部位注射2 μL隱球菌懸液后縫合(針頭插入3 mm,持續(xù)10 min)[8];sham組僅穿刺不注射。造模成功后AmB組鞘內(nèi)注射0.7 mg/kg 兩性霉素B,FCZ-L組與FCZ-H組分別注射20 mg/kg、40 mg/kg氟康唑,sham組及CM組注射等量生理鹽水,為期2周,記錄小鼠死亡情況。

1.4.2 ELISA法檢測(cè)腦脊液中炎性因子的表達(dá)水平 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后隨機(jī)取5只小鼠暴露寰枕膜,1 mL注射器針尖刺入蛛網(wǎng)膜下隙抽取腦脊液(0.5 mL),根據(jù)ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)TNF-α、IL-6、IL-10表達(dá)水平。

1.4.3 HE染色觀察腦組織病理學(xué)變化 小鼠頸椎脫臼處死后取出腦組織,在4%多聚甲醛固定后用石蠟包埋后切片(4 μm),二甲苯(10 min)脫蠟,依次使用100%、95%、85%、70%的乙醇處理5 min后進(jìn)行HE染色(蘇木精染色5 min,0.5%伊紅染色2 min),脫水,封片,顯微鏡觀察。

1.4.4 免疫組化法檢測(cè)Iba1表達(dá) 將石蠟切片脫水后緩沖液沖洗,3% H2O2除去內(nèi)源性過(guò)氧化物酶后(10 min)加100 μL 90%的牛血清清蛋白(孵育20 min),再加入一抗過(guò)夜,加二抗30 min、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗后加入ABC復(fù)合物、二氨基聯(lián)苯胺(DBA)顯色觀察5 min(棕色即為陽(yáng)性),軟件Image-Pro Plus對(duì)陽(yáng)性染色光密度均值進(jìn)行計(jì)算。

1.4.5 小膠質(zhì)細(xì)胞分離純化 另取5只小鼠頸椎脫臼處死后將剝離腦膜的腦組織在胰酶中懸浮消化后吹打均勻移入離心管中,經(jīng)網(wǎng)篩過(guò)濾后分裝離心(4 000 r/min離心10 min),去上清,經(jīng)DMEM/F12培養(yǎng)基重懸后接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中(1×106個(gè)/mL),恒溫?fù)u床37 ℃、250 r/min連續(xù)搖動(dòng),所得新細(xì)胞懸浮液移入新培養(yǎng)瓶37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h,除去未貼壁細(xì)胞即為純化小膠質(zhì)細(xì)胞。

1.4.6 MTT法檢測(cè)腦小膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞活力 將純化后細(xì)胞稀釋為1×105個(gè)/mL接種100 μL于96孔板中培養(yǎng)24 h后,根據(jù)試劑盒說(shuō)明書使用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力,在490 nm處測(cè)定吸光度OD值,計(jì)算小膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞存活率:細(xì)胞存活率(%)=(OD處理組/OD對(duì)照組)×100%。

1.4.7 免疫熒光檢測(cè)Rab5表達(dá) 所得小膠質(zhì)細(xì)胞用PBS(0.01 mol/L)沖洗3次(每次5 min),胰酶消化,DMEM/F12培養(yǎng)基重懸調(diào)整至細(xì)胞密度4×105個(gè)/mL。細(xì)胞爬片、4%多聚甲醛固定(15 min)后置于Triton X-100(0.5%)10 min,再放入牛血清清蛋白(2%)1 h,添加一抗(1∶500),過(guò)夜,PBS(0.01 mol/L)沖洗,加入二抗(1∶100)2 h,PBS沖洗,熒光顯微鏡觀察并用軟件Image-Pro Plus對(duì)平均熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析。

1.4.8 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)蛋白表達(dá) 用苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)裂解細(xì)胞,冰浴30 min后12 000 r/min離心10 min獲取上清液,用BCA試劑盒檢測(cè)總蛋白含量。加入蛋白進(jìn)行10%聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳后低溫轉(zhuǎn)膜,脫脂奶粉(5%)進(jìn)行1 h封閉,洗膜3次,加入GAPDH、Caspase-1、NLRP3(1∶1 000)一抗后4 ℃孵育過(guò)夜,再加入二抗(1∶5 000)孵育2 h,蛋白凝膠成像儀進(jìn)行Caspase-1、NLRP3定量分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠死亡率比較 2周后,sham組、CM組、AmB組、FCZ-L組、FCZ-H組小鼠死亡率分別為5%、35%、5%、10%、5%。與sham組比較,CM組小鼠死亡率升高(P<0.05);與CM組比較,AmB組、FCZ-L組、FCZ-H組小鼠死亡率明顯降低(P<0.05)。詳見(jiàn)圖1。

CM組與sham組比較,＊P<0.05;與CM組比較,#P<0.05。

2.2 各組小鼠腦脊液中TNF-α、IL-6和IL-10水平比較 與sham組比較,CM組TNF-α、IL-6水平明顯增加(P<0.05),而IL-10水平明顯降低(P<0.05);與CM組比較,AmB組、FCZ-L組、FCZ-H組TNF-α、IL-6水平明顯降低(P<0.05),而IL-10水平明顯增加(P<0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠腦脊液中TNF-α、IL-6和IL-10水平比較 單位:pg/mL

2.3 各組小鼠腦組織病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果 sham組腦組織正常,未見(jiàn)炎癥癥狀及壞死現(xiàn)象;CM組腦組織中炎癥細(xì)胞大量滲出,出現(xiàn)血管充血、壞死灶及隱球菌生物;與CM組比較,AmB組、FCZ-L組、FCZ-H組小鼠腦組織中炎癥細(xì)胞、壞死灶及隱球菌生物明顯減少。詳見(jiàn)圖2。

2.4 各組小鼠腦小膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物Iba1表達(dá)比較 在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中均存在Iba1陽(yáng)性表達(dá),與sham組比較,CM組小膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物Iba1陽(yáng)性表達(dá)明顯增加(P<0.05);與CM組比較,AmB組、FCZ-L組、FCZ-H組Iba1陽(yáng)性表達(dá)明顯降低(P<0.05)。詳見(jiàn)圖3及表2。

表2 各組腦小膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物Iba1表達(dá)比較 單位:%

圖3 免疫組化檢測(cè)各組小鼠腦小膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物Iba1表達(dá)(×400)

2.5 各組小鼠腦小膠質(zhì)細(xì)胞存活率比較 與sham組比較,CM組小膠質(zhì)細(xì)胞存活率明顯增加(P<0.05);與CM組比較,AmB組、FCZ-L組、FCZ-H組細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.05)。詳見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠腦小膠質(zhì)細(xì)胞存活率比較 單位:%

2.6 各組小鼠腦小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬標(biāo)志物Rab5表達(dá)比較 免疫熒光檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與sham組比較,CM組Rab5陽(yáng)性表達(dá)明顯降低(P<0.05);與CM組比較,AmB組、FCZ-L組、FCZ-H組Rab5陽(yáng)性表達(dá)明顯增加(P<0.05)。詳見(jiàn)圖4及表4。

表4 各組Rab5陽(yáng)性表達(dá)率比較 單位:%

圖4 免疫熒光檢測(cè)各組腦小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬標(biāo)志物Rab5表達(dá)(×400)

2.7 各組NLRP3炎性小體通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較 與sham組比較,CM組小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)NLRP3炎性小體通路相關(guān)蛋白Caspase-1、NLRP3表達(dá)明顯增加(P<0.05);與CM組比較,AmB組、FCZ-L組、FCZ-H組Caspase-1、NLRP3表達(dá)明顯降低(P<0.05)。詳見(jiàn)表5及圖5。

表5 各組NLRP3炎性小體通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

圖5 各組NLRP3炎性小體通路相關(guān)蛋白表達(dá)條帶圖

3 討 論

隱球菌性腦膜炎是慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的常見(jiàn)原因之一,具有極高的致死性,1年內(nèi)的死亡率為70%,而在全球范圍內(nèi)占艾滋病相關(guān)死亡的15%[9-10]。臨床上隱球菌性腦膜炎的治療方法是使用藥物抑制隱球菌從而達(dá)到治療目的。

氟康唑由于能夠高效率穿過(guò)血腦屏障起到抗真菌作用,在體內(nèi)和體外均能夠有效抑制隱球菌,因此已被用于治療隱球菌性腦膜炎[11-12]。兩性霉素B同樣在隱球菌性腦膜炎治療中具有抗菌作用,研究表明兩性霉素B與氟康唑聯(lián)合使用能有效減少病人腦脊液中隱球菌數(shù)量以及炎癥反應(yīng)的發(fā)生,改善病人預(yù)后情況[13]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最為重要的免疫細(xì)胞是小膠質(zhì)細(xì)胞,其在機(jī)體損傷時(shí)會(huì)由靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ顮顟B(tài),聚集到損傷部位引起炎癥反應(yīng),因此,可作為大腦的監(jiān)測(cè)器[8]。Iba1作為小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物,在小膠質(zhì)細(xì)胞活化后其表達(dá)明顯增加[14-15]。Rab5作為小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞吞噬的標(biāo)志物,是Ras家族成員之一,位于早期內(nèi)體并在早期內(nèi)體和胞吞泡融合過(guò)程中起重要調(diào)控作用[8]。隱球菌可導(dǎo)致早期吞噬體標(biāo)志物Rab5的過(guò)早清除,從而降低Rab5表達(dá)水平[16]。隱球菌性腦膜炎小鼠模型中小膠質(zhì)細(xì)胞處于激活狀態(tài),Iba1表達(dá)水平明顯增加,而Rab5表達(dá)水平則明顯降低[17]。兩性霉素B能通過(guò)抑制核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)通路的激活來(lái)抑制腦組織損傷,從而對(duì)隱球菌性腦膜炎起到治療作用[8]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),氟康唑能夠明顯降低隱球菌性腦膜炎小鼠死亡率、細(xì)胞存活率、腦組織損傷程度、Iba1表達(dá),增加Rab5陽(yáng)性表達(dá),表明氟康唑能夠有效抑制隱球菌性腦膜炎小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞活化,以此緩解腦組織損傷,從而在隱球菌性腦膜炎中具有有效治療作用。

炎性小體的激活是一個(gè)重要的炎癥途徑,炎性小體可表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的小膠質(zhì)細(xì)胞,參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng),而NLRP3炎性小體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分布最廣,可經(jīng)由微生物感染及細(xì)胞損傷活化,并通過(guò)剪切激活Caspase-1,從而介導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的分泌,是宿主針對(duì)真菌、病毒、細(xì)菌感染的免疫防御的關(guān)鍵所在,NLRP3炎性小體的異常激活可導(dǎo)致炎癥性疾病的發(fā)生[4,18-19]。TNF-α、IL-6是免疫系統(tǒng)中典型的促炎因子,而IL-10是抗炎細(xì)胞因子,三者對(duì)炎癥反應(yīng)的發(fā)生起重要調(diào)節(jié)作用。有研究表明,在腦膜炎大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中NLRP3、Caspase-1表達(dá)水平明顯增加[20]。而本研究發(fā)現(xiàn),氟康唑可明顯降低隱球菌性腦膜炎小鼠腦脊液中TNF-α、IL-6水平及小膠質(zhì)細(xì)胞中Caspase-1、NLRP3表達(dá),增加腦脊液中IL-10水平。表明氟康唑可有效抑制隱球菌性腦膜炎小鼠腦小膠質(zhì)細(xì)胞中NLRP3炎性小體通路的激活,從而抑制炎癥反應(yīng)的過(guò)度激活,提示氟康唑抑制隱球菌性腦膜炎小鼠腦小膠質(zhì)細(xì)胞的活化可能與該通路有關(guān)。

綜上所述,氟康唑?qū)﹄[球菌性腦膜炎的治療可能與其抑制NLRP3炎性小體通路的激活來(lái)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化有關(guān),本研究對(duì)氟康唑在隱球菌性腦膜炎中的治療機(jī)制的研究具有重要參考價(jià)值,但關(guān)于氟康唑在隱球菌性腦膜炎治療過(guò)程中的最佳劑量還需進(jìn)一步研究。