賈子君,周慶兵,張 艷,徐鳳芹

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、中風(fēng)和外周動(dòng)脈疾病的主要病理基礎(chǔ)[1]。動(dòng)脈粥樣硬化嚴(yán)重威脅人民群眾的身體健康,也給國(guó)家和社會(huì)帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]?，F(xiàn)有研究表明,動(dòng)脈粥樣硬化的病理機(jī)制主要包括炎癥反應(yīng)、血脂異常、平滑肌細(xì)胞異常增殖等[3]。近年來(lái),隨著多組學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,動(dòng)脈粥樣硬化基因甲基化的研究受到眾多研究者的關(guān)注[4]。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要組成部分,是指胞嘧啶添加甲基基團(tuán)形成5-甲基胞嘧啶,這一過(guò)程需要DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的介導(dǎo),并由S-腺苷甲硫氨酸提供甲基供體。DNA甲基化對(duì)基因的表達(dá)具有重要的調(diào)控作用,一般認(rèn)為啟動(dòng)子區(qū)域高甲基化能抑制基因的下游表達(dá),低甲基化能促進(jìn)基因的表達(dá)[5]?，F(xiàn)有研究表明,DNA異常甲基化在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展中扮演重要角色,以動(dòng)脈粥樣硬化異常基因甲基化為靶點(diǎn)的藥物開發(fā)研究有可能為動(dòng)脈粥樣硬化的治療帶來(lái)突破[6]。

傳統(tǒng)中醫(yī)中并沒(méi)有動(dòng)脈粥樣硬化這一病名,參照動(dòng)脈粥樣硬化類疾病的常見臨床癥狀表現(xiàn),可將其歸入到中醫(yī)“脈痹”“胸痹”“中風(fēng)”等疾病范疇中。近年來(lái),陳可冀院士團(tuán)隊(duì)提出了以瘀毒病機(jī)為核心的動(dòng)脈粥樣硬化致病理論[7]。徐鳳芹教授傳承了陳可冀院士瘀毒理論思想,從古典名方越鞠丸中發(fā)掘出梔子、川芎兩味中藥,并在臨床中廣泛使用該藥對(duì)治療動(dòng)脈粥樣硬化類疾病,取得了較好的臨床療效。梔子性味苦寒,歸心、肺、三焦經(jīng),有瀉火除煩、清熱涼血解毒之功[8]。川芎辛溫?zé)o毒,活血行氣、祛風(fēng)止痛[9],《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載川芎“上行頭目,中開郁結(jié),下行血海,旁通絡(luò)脈,為血中之氣藥”。前期課題組研究表明,活血解毒藥對(duì)梔子、川芎能夠縮小兔動(dòng)脈粥樣硬化斑塊厚度及面積,在DNA甲基化研究方面,高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)梔子、川芎藥對(duì)能調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化兔異常的基因甲基化水平[10]。本研究則從DNA甲基化及下游基因的表達(dá)角度,運(yùn)用多組學(xué)技術(shù),進(jìn)一步深入闡明梔子、川芎藥對(duì)治療動(dòng)脈粥樣硬化的現(xiàn)代生物學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物、試劑及儀器 梔子-川芎凍干粉由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院制劑室制備,梔子與川芎生藥質(zhì)量比為4∶5;人氧化型低密度脂蛋白(human oxidized-LDL,ox-LDL)購(gòu)于廣東奕源生物科技有限公司(貨號(hào):YB-002);Gbico DMEM高糖培養(yǎng)基(貨號(hào):C11995500BT);細(xì)胞毒性試驗(yàn)(CCK-8)細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒購(gòu)于日本同仁有限公司(貨號(hào):CK04-500);可溶性細(xì)胞間黏附分子-1(sICAM-1)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒(貨號(hào):EM013-96);小鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA檢測(cè)試劑盒(貨號(hào):EM008-96);小鼠白細(xì)胞介素6(IL-6)ELISA檢測(cè)試劑盒(貨號(hào):EM004-96);DNA提取試劑盒DNeasy Blood Tissue Kit(250)(Qiagen, Valencia,CA,USA,貨號(hào):166013782);動(dòng)物總RNA抽提取試劑盒(磁珠法,貨號(hào):T02-096);酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國(guó),BioTek公司);二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(美國(guó),Thermo公司);GCMS-TQ8040 NX mass spectrograph(SHIMADZU,Origin,Japan)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及泡沫細(xì)胞模型的建立 RAW 264.7細(xì)胞株購(gòu)于北京協(xié)和細(xì)胞資源中心,培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基,在37 ℃、5% CO2孵育箱中進(jìn)行培養(yǎng)。按照前期課題組的方法建立泡沫細(xì)胞模型[11],以含有ox-LDL終濃度為80 mg/L的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h即可得到泡沫細(xì)胞。將細(xì)胞分為梔子-川芎凍干粉組(80 mg/L ox-LDL、0.3 g/L梔子-川芎凍干粉干預(yù))、模型組(80 mg/L ox-LDL處理)和空白對(duì)照組(未處理)。

1.3 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 將梔子-川芎凍干粉溶于完全培養(yǎng)基中,進(jìn)行細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn),在細(xì)胞貼壁后加入含有梔子-川芎凍干粉不同濃度的完全培養(yǎng)基(藥物濃度分別為4.800 g/L、2.400 g/L、1.200 g/L、0.600 g/L、0.300 g/L、0.150 g/L、0.075 g/L),培養(yǎng)48 h后加入CCK-8試劑,檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)條件下的吸光度值,計(jì)算各組細(xì)胞存活率。

1.4 膽固醇和炎性因子檢測(cè) 使用氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)測(cè)定不同細(xì)胞樣本中總膽固醇(total cholesterol,TC)、游離膽固醇(free cholesterol,FC)水平。使用帶有 RTX-5MS 色譜柱的 GCMS-TQ8040 NX 質(zhì)譜儀檢測(cè)樣本。ELISA法檢測(cè)不同樣本細(xì)胞上清中TNF-α、IL-6及ICAM-1含量,根據(jù)試劑盒說(shuō)明書步驟進(jìn)行檢測(cè),由樣本的OD值計(jì)算出對(duì)應(yīng)樣本中炎性因子濃度。

1.5 甲基化捕獲測(cè)序(MC-seq) 細(xì)胞樣本采用DNeasy Blood Tissue Kit(250)提取DNA,抽提所得DNA經(jīng)Qubit 2.0 Fluorometer和瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)檢。對(duì)合格的DNA進(jìn)行片段化及亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化等處理,完成建庫(kù)并使用Illumina NovaSeq6000測(cè)序儀測(cè)序。測(cè)序數(shù)據(jù)以GRCm38.p4(mm10)為參考基因組進(jìn)行比對(duì),計(jì)算差異甲基化CpG位點(diǎn)得到基因功能注釋。組間對(duì)比采用Bioconductor package中的DSS(dispersion shrinkage for sequencing data)工具,進(jìn)行差異甲基化位點(diǎn)(differential methylation site,DMS)的檢測(cè)和注釋,閾值設(shè)為:P<0.05,甲基化差異程度>10%。

1.6 RNA測(cè)序(RNA-seq) 提取細(xì)胞RNA,抽提所得RNA經(jīng)Agilent 2100 Bioanalyzer(agilent technologies santa clara,US)電泳質(zhì)檢。對(duì)純化后的總RNA進(jìn)行分離、片段化、cDNA合成及富集等步驟,完成建庫(kù)及質(zhì)檢后,使用Illumina NovaSeq6000測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序,設(shè)定測(cè)序模式為PE150。對(duì)測(cè)序得到Raw Reads進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理,與基因組GRCm38.p4(mm10)進(jìn)行比對(duì),將reads轉(zhuǎn)化成FPKM(fragments per kilobase of exon model per million mapped reads)并進(jìn)行基因表達(dá)量的標(biāo)準(zhǔn)化,進(jìn)行基因功能注釋并計(jì)算出基因的表達(dá)量。應(yīng)用edgeR進(jìn)行樣本間差異基因分析,得出P值后進(jìn)行多重假設(shè)檢驗(yàn)校正,通過(guò)控制偽發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate,FDR)來(lái)決定P的閾值。同時(shí),根據(jù)FPKM值計(jì)算差異表達(dá)倍數(shù),即Fold-change。

1.7 京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析與基因本體(GO)富集分析 將符合篩選條件的基因運(yùn)用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行KEGG富集分析及GO富集分析,并使用微生信在線繪圖平臺(tái)將結(jié)果進(jìn)行可視化展示。

2 結(jié) 果

2.1 梔子-川芎凍干粉對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng) CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,0.075～4.800 g/L 梔子-川芎凍干粉對(duì)RAW264.7細(xì)胞具有抑制效應(yīng),濃度越高,抑制效應(yīng)越明顯,詳見圖1。本研究選用梔子-川芎凍干粉0.300 g/L作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度。

圖1 不同濃度梔子-川芎凍干粉對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率的影響(n=3)

2.2 梔子-川芎藥對(duì)的降脂及抗炎效應(yīng) 與空白對(duì)照組比較,模型組TC和FC水平明顯升高(P<0.01);與模型組比較,梔子-川芎凍干粉組TC和FC水平明顯下降(P<0.01)。詳見圖2。與空白對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6和ICAM-1水平明顯升高(P<0.01);與模型組比較,梔子-川芎凍干粉組TNF-α、IL-6和ICAM-1表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)。詳見圖3。

模型組與空白對(duì)照組比較,＊P<0.01;與模型組比較,# P<0.01。

模型組與空白對(duì)照組比較,＊ P<0.01;與模型組比較,# P<0.01。

2.3 梔子-川芎藥對(duì)逆轉(zhuǎn)ox-LDL誘導(dǎo)的甲基化變化 本研究應(yīng)用MC-seq來(lái)確定梔子-川芎凍干粉是否可以改變泡沫細(xì)胞中全基因組DNA甲基化的狀態(tài)。熱圖直觀地在總體上顯示了3組樣本中基因的甲基化存在差異(見圖4)。進(jìn)一步分析DMS在啟動(dòng)子至轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)區(qū)域(Promoter-TSS)的分布情況,模型組與空白對(duì)照組相比,模型組有8 421個(gè)DMSs,分別對(duì)應(yīng)5 061個(gè)低甲基化和3 405個(gè)高甲基化基因位點(diǎn)(見圖5)。與模型組比較,梔子-川芎凍干粉組有8 395個(gè)DMSs,分別有4 257個(gè)高甲基化基因位點(diǎn)和4 138個(gè)低甲基化基因位點(diǎn)(見圖6)。

圖4 3組間基因甲基化程度的總體差異

圖5 模型組與空白對(duì)照組的差異甲基化基因

對(duì)模型組與空白對(duì)照組以及梔子-川芎凍干粉組與模型組差異甲基化(聚焦于啟動(dòng)子區(qū)域)進(jìn)行兩兩比較后取交集,共發(fā)現(xiàn)有7 669個(gè)DMSs,對(duì)應(yīng)6 016個(gè)基因。具體來(lái)說(shuō),與空白對(duì)照組比較,模型組中有3 435個(gè)低甲基化的基因(4 315個(gè)DMSs)經(jīng)過(guò)梔子-川芎凍干粉處理后變?yōu)楦呒谆?見圖7)。有2 581個(gè)高甲基化基因(3 049個(gè)DMSs)通過(guò)梔子-川芎凍干粉處理后變?yōu)榈图谆?見圖8)。表明梔子-川芎凍干粉可以逆轉(zhuǎn)泡沫細(xì)胞中ox-LDL誘導(dǎo)的DNA甲基化變化。此外,對(duì)梔子-川芎凍干粉誘導(dǎo)的高甲基化與低甲基化基因分別進(jìn)行KEGG分析,發(fā)現(xiàn)高甲基化基因涉及Ras信號(hào)通路、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路等(見圖9),低甲基化基因涉及Rap1信號(hào)通路、Hippo信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路等(見圖10)。

圖7 梔子-川芎凍干粉逆轉(zhuǎn)3 435個(gè)模型組低甲基化基因

圖8 模型組梔子-川芎凍干粉逆轉(zhuǎn)2 581個(gè)高甲基化基因

圖9 梔子-川芎凍干粉干預(yù)后轉(zhuǎn)為高甲基化基因的KEGG分析

圖10 梔子-川芎凍干粉干預(yù)后轉(zhuǎn)為低甲基化基因的KEGG分析

2.4 梔子-川芎凍干粉對(duì)泡沫細(xì)胞RNA表達(dá)的影響 RNA-seq檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)梔子-川芎凍干粉對(duì)泡沫細(xì)胞的基因表達(dá)存在影響。主成分分析(principal component analysis,PCA)顯示,3組內(nèi)樣本具有良好的一致性且組間有明顯差異(見圖11),熱圖(見圖12)也發(fā)現(xiàn)3組之間的基因表達(dá)存在差異。對(duì)組間差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs)進(jìn)行可視化展示,與空白對(duì)照組比較,模型組有1 344個(gè)DEGs,包括874個(gè)低表達(dá)基因和470個(gè)高表達(dá)基因(見圖13)。與模型組比較,梔子-川芎凍干粉組有634個(gè)DEGs,分別對(duì)應(yīng)302個(gè)高表達(dá)基因上調(diào),332個(gè)低表達(dá)基因(見圖14)。

圖11 PCA分析

圖12 RNA-seq熱圖

圖13 模型組與空白對(duì)照組DEGs分布

圖14 梔子-川芎凍干粉組與模型組DEGs分布

對(duì)模型組與空白對(duì)照組,梔子-川芎凍干粉組與模型組DEGs進(jìn)行兩兩比較后取交集,共確定119個(gè)DEGs。具體而言,ox-LDL處理后上調(diào)的39個(gè)DEGs經(jīng)梔子-川芎凍干粉處理后下調(diào),下調(diào)的80個(gè)DEGs經(jīng)梔子-川芎凍干粉處理后上調(diào)。表明梔子-川芎凍干粉可以逆轉(zhuǎn)ox-LDL誘導(dǎo)的基因表達(dá)變化。

2.5 DNA甲基化與RNA表達(dá)譜關(guān)聯(lián)分析 DNA甲基化在基因轉(zhuǎn)錄中起著重要的調(diào)節(jié)作用。本研究對(duì)梔子-川芎凍干粉對(duì)誘導(dǎo)的基因表達(dá)變化與DNA甲基化進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。與模型組相比,梔子-川芎凍干粉組分別有29個(gè)低甲基化高表達(dá)基因和33個(gè)高甲基化低表達(dá)基因,詳見圖15。KEGG分析提示這些基因涉及Focal adhesion信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(AGE-RAGE)信號(hào)通路等,詳見圖16。GO分析顯示涉及白細(xì)胞介素-1的產(chǎn)生、血管生成、腫瘤壞死因子產(chǎn)生的調(diào)節(jié)等生物學(xué)過(guò)程,詳見圖17。

圖15 梔子-川芎凍干粉組與模型組 DNA甲基化與RNA表達(dá)譜關(guān)聯(lián)分析散點(diǎn)圖

圖16 梔子-川芎凍干粉組與模型組低甲基化高表達(dá)基因以及高甲基化低表達(dá)基因的KEGG分析氣泡圖

圖17 梔子-川芎凍干粉組與模型組低甲基化高表達(dá)基因以及高甲基化低表達(dá)基因的GO分析條形圖

3 討 論

他汀類藥物是當(dāng)前治療動(dòng)脈粥樣硬化類疾病的主要手段。然而臨床研究也發(fā)現(xiàn),部分病人在服用他汀類藥物治療過(guò)程中出現(xiàn)的肌肉疼痛或血糖升高等副作用限制了該類藥物的使用[12],并且有相當(dāng)部分病人在接受他汀類藥物治療后仍不可避免地出現(xiàn)了急性心腦血管事件[13]。近年來(lái),從瘀毒致病理論出發(fā)創(chuàng)立的活血解毒法抗動(dòng)脈粥樣硬化研究受到眾多中醫(yī)研究者的關(guān)注。已有的眾多研究表明,與單純活血化瘀或解毒中藥相比,解毒活血中藥具有更強(qiáng)的抗動(dòng)脈粥樣硬化效應(yīng)[14-15]。與既往研究結(jié)果一致,本研究中活血解毒中藥梔子-川芎藥對(duì)能夠明顯降低泡沫細(xì)胞中膽固醇與炎性因子水平,顯示出了較強(qiáng)的抗動(dòng)脈粥樣硬化效應(yīng)。

既往大量的研究表明,DNA異?；蚣谆趧?dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展中扮演重要角色,是動(dòng)脈粥樣硬化的重要治療靶標(biāo)。Kumar等[16]發(fā)現(xiàn)ox-LDL通過(guò)誘導(dǎo)人Kruppel樣因子2(endothelial Kruppel-like factor 2,KLF2)高甲基化導(dǎo)致該基因下游的表達(dá)降低,最終加重內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng),引發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂。另一方面,動(dòng)脈粥樣硬化存在基因異常的低甲基化。Aavik等[17]運(yùn)用高通量技術(shù)發(fā)現(xiàn),與9例正常人相比,22例動(dòng)脈粥樣硬化斑塊病人存在3 997個(gè)異常的高甲基化基因,同時(shí)伴有782個(gè)異常的低甲基化基因。本研究還發(fā)現(xiàn),與空白對(duì)照組相比,模型組存在大量異常的甲基化基因,進(jìn)一步證明了異?；蚣谆莿?dòng)脈粥樣硬化重要的分子機(jī)制。與此同時(shí),本研究發(fā)現(xiàn),梔子-川芎藥對(duì)能部分恢復(fù)ox-LDL誘導(dǎo)的基因異常甲基化水平,異常高甲基化基因[血小板源性生長(zhǎng)因子受體α多肽(platelet-derived growth factor receptor alpha,PDGFRα)、纖維連接蛋白1(fibronectin-1,FN1)及Ⅰ型膠原蛋白α2(collagen type I alpha,COL1A2)、酪氨酸蛋白激酶受體B4(Ephb4)等]與異常低甲基化基因[YAM1、硫酯酶超家族成員4(THEM4)、神經(jīng)型一氧化氮合酶(NOS1)等]被梔子-川芎藥對(duì)逆轉(zhuǎn),說(shuō)明梔子-川芎藥對(duì)能夠雙向調(diào)控基因甲基化。KEGG分析發(fā)現(xiàn),這些被逆轉(zhuǎn)甲基化的基因涉及Ras信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、Hippo信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路等。

DNA甲基化調(diào)控基因的表達(dá),因而在生命活動(dòng)中占有重要地位。本研究運(yùn)用RNA-seq觀察梔子-川芎藥對(duì)調(diào)控基因甲基化后的下游效應(yīng)。經(jīng)ox-LDL誘導(dǎo)后,出現(xiàn)了異常的DEGs,包括874個(gè)低表達(dá)基因和470個(gè)高表達(dá)基因。分別進(jìn)行兩兩比較后取交集(模型組與空白對(duì)照組,梔子-川芎凍干粉組與模型組),發(fā)現(xiàn)共有119個(gè)DEGs可被梔子-川芎藥對(duì)逆轉(zhuǎn)。DNA甲基化在基因轉(zhuǎn)錄中起著至關(guān)重要的作用,啟動(dòng)子區(qū)域高甲基化可引起下游基因的低表達(dá)。相反,低甲基化可誘導(dǎo)基因的高表達(dá)。在對(duì)梔子-川芎藥對(duì)誘導(dǎo)的基因表達(dá)變化與DNA甲基化進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析時(shí)發(fā)現(xiàn),與模型組相比,梔子-川芎凍干粉組分別有29個(gè)低甲基化高表達(dá)基因和33個(gè)高甲基化低表達(dá)基因,充分證明梔子-川芎藥對(duì)可通過(guò)調(diào)節(jié)基因甲基化進(jìn)而調(diào)控基因的表達(dá)。KEGG富集分析顯示上述基因參與Focal adhesion信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、AGE-RAGE信號(hào)通路等,涉及的基因包括PDGFRα、FN1及COL1A2等。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),梔子-川芎凍干粉干預(yù)后,PDGFRα、COL1A2、FN1均呈高甲基化低表達(dá)的狀態(tài)。既往研究表明,PDGFRα被激活后可誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)的增殖和遷移,引發(fā)新內(nèi)膜病變形成和動(dòng)脈粥樣硬化[18]。Thankam等[19]研究發(fā)現(xiàn),高脂血癥豬模型頸動(dòng)脈血管中PDGFRα的表達(dá)明顯上調(diào),提示該基因與動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展密切相關(guān)。此外,研究發(fā)現(xiàn),動(dòng)脈粥樣硬化病變中COL1A2與FN1的表達(dá)明顯上調(diào),提示上調(diào)的COL1A2與FN1可能與心血管風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)[20-21]。因此,推測(cè)梔子-川芎藥對(duì)可能通過(guò)提高PDGFRα、COL1A2和FN1基因的啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平進(jìn)而引起下游的表達(dá),從而起到抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。

綜上所述,體外研究發(fā)現(xiàn)梔子-川芎藥對(duì)具有明顯的抗動(dòng)脈粥樣硬化效應(yīng),其機(jī)制可能與雙向調(diào)控DNA異常甲基化進(jìn)而影響下游基因的表達(dá)有關(guān)。研究篩選到的PDGFRα、COL1A2、FN1等基因可能是梔子-川芎藥對(duì)抗動(dòng)脈粥樣硬化的潛在治療靶點(diǎn),為未來(lái)進(jìn)一步深入研究奠定了基礎(chǔ)。