崔光芬　杜文文　金鵬程　段青　王祥寧　賈文杰　馬璐琳　王繼華

摘要： 秋水仙堿是一種功能較多的植物源生物堿，在醫(yī)藥行業(yè)發(fā)揮著重要作用。系統(tǒng)地了解秋水仙堿提取、分離的技術(shù)類型有助于推動高純度秋水仙堿的生產(chǎn)。本文介紹了秋水仙堿不同提取技術(shù)的特點、原理和應(yīng)用效果，闡述了秋水仙堿在不同種類植物、植物不同部位中的含量以及影響含量的因素，總結(jié)了傳統(tǒng)的浸提法、回流法與超聲波提取、超臨界CO₂提取、微波提取、酶促提取等新提取方法，以及膜分離法、色譜分離法等秋水仙堿分離純化方法的研究進展，分析了不同提取分離技術(shù)的效果和影響因素，探討了秋水仙堿提取技術(shù)的發(fā)展方向，以期為秋水仙堿的提取分離技術(shù)的研究和應(yīng)用提供參考。

關(guān)鍵詞： 秋水仙堿；嘉蘭屬；提取方法；分離純化

中圖分類號： R284 文獻標識碼： A 文章編號： 1000-4440（2023）01-0295-10

Advances in extraction and separation of colchicine

CUI Guang-fen^1，2 ， DU Wen-wen¹， JIN Peng-cheng²， DUAN Qing¹， WANG Xiang-ning¹， JIA Wen-jie¹，MA Lu-lin¹， WANG Ji-hua¹

（1.Flower Research Institute， Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Kunming 650205，China;2.Agro-Products Processing Research Institute， Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Kunming 650221，China）

Abstract： Colchicine is a plant-derived alkaloid with many functions， which plays an important role in the pharmaceutical industries. Systematic understanding of the technology types for extraction and separation of colchicine is helpful for promoting the production of high-purity colchicine. In this article，the characteristics， principles and application effects of different extraction techniques of colchicine were introduced， and the research progresses on colchicine content in different plants and different parts of plants as well as the affecting factors were described. Traditional extraction methods such as maceration extraction and reflux extraction were summarized. New extraction methods such as ultrasonic extraction， supercritical CO₂extraction， microwave extraction and enzymatic extraction were also summarized. Besides， research progress on separation and purification methods of colchicine such as membrane seperation and chromatographic separation were generalized. The effects and influencing factors of different extraction and separation technologies were analyzed， and the development direction of colchicine extraction technology was discussed to provide reference for the research and application of colchicine extraction and separation technology.

Key words： colchicine；Gloriosa；extraction methods；separation and purification

秋水仙堿是一種三環(huán)脂溶性生物堿，于1820年由法國化學(xué)家從秋水仙屬（Colchicum）植物^[1]中分離獲得，其化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。秋水仙堿作為治療痛風(fēng)的藥物應(yīng)用歷史悠久，近年來，其藥用價值被不斷挖掘并被廣泛用于治療家族性地中海熱^[2]、皮膚病^[3]、心臟病^[4]等疾病，甚至用于治療新冠肺炎引起的急性呼吸窘迫綜合征^[5]。秋水仙堿在細胞中可與微管蛋白β亞基上第1～46位和第214～241位2段氨基酸殘基發(fā)生交聯(lián)，抑制微管聚合進而影響細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞分裂、遷移和細胞運輸?shù)榷喾N細胞過程^[6-8]。除藥用價值外，秋水仙堿還可用于植物多倍體育種，作為誘變劑誘導(dǎo)植物的莖尖、花粉、根尖、種子等器官或組織獲得多倍體品種，進而得到更高的作物產(chǎn)量^[9-10]，或通過改變基因組倍性水平來影響植物代謝物的濃度^[11-12]，甚至在水果保鮮領(lǐng)域也有所應(yīng)用^[13]。隨著秋水仙堿的用途不斷拓展，人們對秋水仙堿的需求也快速增長。

生物堿是植物體內(nèi)產(chǎn)生的次生代謝物，能夠保護植物免受食草動物采食和病原體侵害，其傳統(tǒng)提取方法包括煎煮、浸漬、滲漉等^[14]。秋水仙堿作為生物堿的一類，常用提取方法有溶劑提取、超聲提取等^{[15- 16]}。目前，生物堿提取技術(shù)不斷創(chuàng)新和發(fā)展，更多含秋水仙堿的植物被發(fā)現(xiàn)，秋水仙堿的提取范圍不斷擴大，提取效率也得到較大提升。本研究通過對不同植物中秋水仙堿含量及其影響因素、提取方法、分離純化等相關(guān)研究進行綜述，結(jié)合目前國內(nèi)外有關(guān)秋水仙堿合成的最新進展，以期闡明不同提取技術(shù)的優(yōu)勢和適用范圍，為促進秋水仙堿的生產(chǎn)和應(yīng)用提供參考。

1 秋水仙堿的植物來源

1.1 含秋水仙堿的植物種類

秋水仙堿最早是從秋水仙屬植物中提取獲得的。近年來，人們在山慈姑屬（Iphigenia）^[17]、宮燈百合屬（Sandersonia）^[18]、搖船花屬（Androcymbium）^[19]、安圭拉氏蘭屬（Wurmbea）^[20]等秋水仙科不同屬植物中發(fā)現(xiàn)了秋水仙堿，Vinnersten等^[21]研究認為秋水仙科的植物中普遍含有秋水仙堿，因此提出秋水仙堿可作為秋水仙科植物分類擴展的化學(xué)標志物。秋水仙科植物分布于非洲、亞洲、澳大利亞、歐洲和北美的溫帶和熱帶地區(qū)，科內(nèi)各屬植物均為多年生，地下球莖或塊莖發(fā)達，全株含秋水仙堿^[22]，除秋水仙科外，百合科百合屬（Lilium）^[23]、萱草屬（Hemerocallis）^[24]的多種植物中也含秋水仙堿，秋水仙科與百合科是含秋水仙堿植物中最豐富的2個科。另外，菊科風(fēng)毛菊屬的水母雪蓮（Saussurea medusa）^[25]和唐古特雪蓮（Saussurea tangutica）^[26]，天南星科天南星屬的曲序南星（Arisaema curvatum）^[27]，澤瀉科慈姑屬的慈姑（Sagittaria sagittifolia）^[28]也曾有關(guān)于秋水仙堿被提取分離的報道。目前秋水仙堿生產(chǎn)上常用的提取植物為秋水仙屬（Colchicum）、山慈姑屬（Iphigenia）和嘉蘭屬（Gloriosa）^[29-30]。嘉蘭是一類攀緣植物，在印度分布廣泛，其種子和塊莖被大量出口至歐美用于藥用秋水仙堿提取^[31]，而山慈姑屬的麗江山慈姑則是中國藥企生產(chǎn)秋水仙堿常用的基源植物^[32]。

1.2 不同植物中的秋水仙堿含量

秋水仙堿雖然在越來越多的植物中被發(fā)現(xiàn)和提取，但已報道的不同種類植物在秋水仙堿含量上差別較大（表1）。商業(yè)用途的秋水仙堿最早從秋水仙（Colchicum autumnale）中提取獲得，該物種的種子中秋水仙堿質(zhì)量分數(shù)為0.5%～0.6%^[33]。Pandey等^[34]從嘉蘭（Gloriosa superba）的干燥塊莖中提取秋水仙堿，其質(zhì)量分數(shù)可高達0.91%。除秋水仙屬和嘉蘭屬外，前人還在山慈姑屬、宮燈百合屬和搖船花屬植物中發(fā)現(xiàn)了一些秋水仙堿含量高的種類，如宮燈百合（Sandersonia aurantiaca）的塊莖中秋水仙堿含量為1.07%（質(zhì)量分數(shù)）^[18]，山慈姑屬植物（Iphigenia indica）球莖中秋水仙堿含量為3.250 mg/g ^[17]，搖船花屬植物（Androcymbium hierrense）的種子中秋水仙堿含量為4.500 mg/g ^[21]。即使是在相同屬內(nèi)，不同種間植物的秋水仙堿含量差異也較大，在6種安圭拉氏蘭屬植物中，Wurmbea deserticola和 W. tenella的秋水仙堿含量分別為1.700 mg/g和0.300 mg/g^[20]。

1.3 影響植物秋水仙堿含量的因素

1.3.1 環(huán)境因素 在不同氣候土壤條件下生長的植物種群其生化代謝方面存在差異。李慧芳等^[35]采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-MS）法分析野罌粟（Papaver nudicaule）不同居群的生物堿含量，結(jié)果表明，野罌粟中主要的3種生物堿包括野罌粟堿、黑龍辛甲醚和瑞芙熱米定的含量在不同居群中各不相同，前2種生物堿含量最大值均出現(xiàn)在烏蘭布統(tǒng)居群，分別為2.018 5 mg/g和1.138 2 mg/g。而瑞芙熱米定含量的最大值則出現(xiàn)在多倫居群（1.287 8 mg/g）。綜合比較各居群間生物堿含量差異，結(jié)果顯示，烏蘭布統(tǒng)地區(qū)的野罌粟品質(zhì)最佳，生物堿類成分含量最高，由此說明生物堿在植物中的含量與生長區(qū)域相關(guān)。Pandey等^[36]對來自印度32個不同地理位置的嘉蘭居群進行秋水仙堿含量檢測，結(jié)果顯示，在印度11個州32個不同地區(qū)的嘉蘭居群中，秋水仙堿含量為2.12～7.58 mg/g。秋水仙堿含量最高的居群為印度東部地區(qū)的大吉嶺-西孟加拉邦居群（7.58 mg/g）和甘托克-錫金居群（7.37 mg/g），東喜馬拉雅高海拔地區(qū)嘉蘭居群的秋水仙堿含量明顯高于西喜馬拉雅地區(qū)和印度-恒河平原的居群，說明在2 045 m海拔范圍內(nèi)生長的嘉蘭居群的秋水仙堿含量受到生境海拔的調(diào)控，這種受海拔影響次生代謝物合成的變化歸因于一些生理、生態(tài)和環(huán)境因素，即紫外線輻射水平的高低、溫度水平差異等。袁理春等^[37]對云南西北部及四川越西縣分布的22個麗江山慈姑（I. indica）居群中秋水仙堿含量的測定結(jié)果表明，分布在金沙江兩岸貧瘠砂礫土壤上的麗江紅巖居群秋水仙堿質(zhì)量分數(shù)最高，達0.61%， 而生長在較肥沃的草叢中的永勝縣板橋鄉(xiāng)居群質(zhì)量分數(shù)僅為0.13%，說明麗江山慈姑秋水仙堿含量與生境土壤的土質(zhì)關(guān)系較大。

1.3.2 生長周期和栽培措施 植物中的生物堿含量受生長年限和季節(jié)的影響。Akram等^[38]研究石蒜球莖中生物堿含量時發(fā)現(xiàn)，兩年生球莖中的加蘭他敏和石蒜寧堿的含量最高，而在三年生球莖中網(wǎng)球花胺的含量最高，一年生球莖中的高石蒜堿含量較高，綜合比較可知，兩年生球莖中的生物堿含量最高。在約旦原產(chǎn)的2種秋水仙屬植物中，Alali等^[39]發(fā)現(xiàn)C. tunicatum在花期、營養(yǎng)生長期和苗期的秋水仙堿含量較高，而在C.brachyphyllum中，花期和苗期的秋水仙堿含量較高。此外，在栽培過程中，施肥也有利于秋水仙堿在球莖和葉片中的積累。Al-Fayyad等^[40]按照氮磷鉀5∶10∶5的施用比例，在種植10 d后施用3種用量的配方肥，結(jié)果顯示，在不同施肥水平下，C. hierosolymitanum和C. tunicatum球莖中的秋水仙堿含量均高于對照，尤其是氮磷鉀配比為75∶100∶75的處理秋水仙堿含量最高，秋水仙堿含量分別為0.806 mg/g和0.803 mg/g，C. hierosolymitanum球莖中秋水仙堿含量甚至高于未施肥（對照）80%以上，說明施肥能夠促進植物中秋水仙堿的合成。

2 秋水仙堿的提取方法

生物堿為含氮有機物，傳統(tǒng)提取方法包括煎煮、浸漬、滲漉等，由于大多數(shù)生物堿能溶于三氯甲烷、乙醚、乙醇、丙酮等有機溶劑，也能溶于酸性、堿性水溶液形成鹽類，因此可選用不同溶劑提取植物中的生物堿。隨著提取技術(shù)不斷發(fā)展，雙水相萃取^[41]、低共熔溶劑提取^[42]等新技術(shù)也被應(yīng)用到生物堿提取中。天然秋水仙堿在植物中的分布因器官組織不同而不同，因此提取方法也可根據(jù)原材料特點及提取效率等要素進行選擇。

2.1 浸提法

2.1.1 水提取法 水提法直接以水為溶劑，適用于提取在水中溶解度較高的化合物。秋水仙堿易溶于水，Agrawal等^[15]以水為溶劑在室溫下浸漬嘉蘭莖塊的干燥粉末，獲得的秋水仙堿質(zhì)量分數(shù)可達0.31%。除純水外，酸和堿的水溶液也常用于生物堿提取。生物堿通常與鹽酸形成生物堿氯化物，其在水中的溶解性優(yōu)于堿性生物堿，ankaya等^[43]用濃度0.1 mol/L的鹽酸提取C. autumnale球莖中的秋水仙堿，提取過程輔以超聲技術(shù)，結(jié)果表明，提取時間、提取介質(zhì)的pH值、液料比、提取溫度和超聲功率對提取效率影響較大。在pH值為1、料液比為1∶30（質(zhì)量體積比）、超聲時間為40 min、溫度為64 ℃時，提取效率最高，秋水仙堿質(zhì)量分數(shù)達0.238%。黃晨熙等^[44]以pH 2.8～4.5的檸檬酸或蘋果酸水溶液燙漂百合花瓣干粉，將燙漂液制作成浸膏后加入乙醇制成提取液，浸膏與乙醇的料液質(zhì)量比為1∶15～1∶30，提取溫度為40～60 ℃，提取時間為30～50 min，提取液經(jīng)固相萃取后可獲得秋水仙堿提取物，純度78%以上。

2.1.2 有機溶劑提取法 甲醇、乙醇、三氯甲烷等有機溶劑是秋水仙堿提取中常用的提取溶劑。針對不同的提取材料，秋水仙堿提取劑可選用單一的有機溶劑，也可用混合溶劑。

姚紅銳等^[45]用百合鱗莖干粉和乙醇混合物（1∶3，體積比）進行冷浸提，提取時間4 h，提取3 次后秋水仙堿的提取率為1.96%。而陳莉華等^[46]同樣以百合干燥粉末為材料，以體積分數(shù)95%的乙醇浸泡后在80 ℃下提取8 h，提取液濃縮溶于水后再分別用石油醚、乙醚和三氯甲烷萃取，將每種萃取劑獲得的萃取物合并得到秋水仙堿粗提物，分步提取使百合原料中秋水仙堿的提取率最大化，此試驗結(jié)果說明，對百合中秋水仙堿提取率產(chǎn)生影響的因素按其作用大小排序分別為：提取溫度＞料液比＞乙醇體積分數(shù)＞提取時間。

2.2 回流法

回流提取是以乙醇等沸點低的有機溶劑與原料混合后在水浴中加熱，溶劑揮發(fā)后經(jīng)冷凝作用重新回流到提取容器中提取目標成分。田素英等^[17]以一定粒度范圍內(nèi)的山慈姑藥粉為原料，以體積比75%的乙醇溶液作為提取劑，經(jīng)4次回流提取后，秋水仙堿提取量為2 983.6 mg/kg。對于山慈姑中秋水仙堿回流提取的效果而言，粉末的粒徑越小，提取效果越好，并且乙醇濃度、提取次數(shù)、乙醇用量對提取得率的影響較大。管倫興等^[47]以體積比70%的甲醇對麗江山慈姑粉末中的秋水仙堿進行回流提取，結(jié)果表明，回流2次可將原料中的秋水仙堿完全提取出來，提取效率明顯高于超聲提取法。

2.3 超聲提取法

超聲波是一種高頻機械波，可產(chǎn)生高速、強烈的空化效應(yīng)高效破碎細胞，增強細胞壁和細胞膜的通透性及溶劑的穿透力，使提取溶劑更易接觸目標成分，從而提高目標化合物的溶出速度和溶出量^[48]。Ou等^[28]采用超聲法對慈姑球莖干粉中的秋水仙堿進行提取，體積分數(shù)為60%的乙醇溶液在50 ℃的溫度條件下超聲提取30 min，料液比（質(zhì)量體積比）為1∶25，秋水仙堿的平均提取得率可達0.27%，在此研究中秋水仙堿的提取率隨超聲時間增加而增加，但超聲時間為30 min時，秋水仙堿的提取率達到峰值，之后雖然提取時間延長但秋水仙堿提取率逐漸降低，原因可能與提取物中非靶標物質(zhì)的增加有關(guān)。ankaya等^[43]以超聲輔助法提取C. autumnale球莖中的秋水仙堿，結(jié)果顯示，超聲波功率為602.4 W、提取時間為42 min、溫度為64 ℃時，秋水仙堿的得率最高，超聲處理40 min后提取率升高，表明超聲波可促進目標化合物在溶劑中擴散，并在短時間內(nèi)實現(xiàn)溶解平衡。同時，當(dāng)料液比（質(zhì)量體積比）從1∶15增加到1∶30時，提取效率提高21%，但是料液比大于1∶30（質(zhì)量體積比）以后，提取效率變化不顯著，原因可能是溶劑與溶質(zhì)比增加時，溶質(zhì)擴散過程加快，且迅速達到溶解力最大值。

2.4 超臨界CO₂萃取法

超臨界CO₂萃取法以處于臨界狀態(tài)的CO₂為媒介，其具有雙重優(yōu)點，既有液體對物料的高滲透性和溶解能力，又有氣體的高擴散性和低黏度，僅通過控制壓力和溫度即可選擇性地把不同極性、不同沸點和不同相對分子質(zhì)量的成分萃取出來，而且在提取物中溶劑無殘留^[49]。Bayrak等^[16]將C. speciosum的種子磨碎后經(jīng)脫脂處理去除油分，以超臨界CO₂技術(shù)萃取秋水仙堿，選用0.5 ml/min甲醇為改性劑，CO₂流速為1.50 ml/min，CO₂密度為0.90 g/ml，獲得的萃取物中只含有秋水仙堿，得率為1.44%，說明超臨界CO₂流體對秋水仙堿具有選擇性，脫脂和添加甲醇改性劑可提高種子中秋水仙堿的萃取率。對于含有大量淀粉和多糖的百合鱗莖而言，經(jīng)過氨水充分堿化后，更多的秋水仙堿可從原料中釋放出來，有利于后續(xù)的超臨界CO₂流體萃取。此外使用提攜劑萃取也可提高秋水仙堿萃取率，乙醇因滲透力較強，與秋水仙堿之間以氫鍵結(jié)合有利于萃取，適合作為超臨界CO₂流體萃取百合中秋水仙堿的提攜劑^[50]。Ellington等^[33]通過考察CO₂不同密度、改性劑百分比、提取溫度和萃取時間，建立從C. autumnale種子中提取秋水仙堿的超臨界CO₂萃取法，即在恒定的CO₂密度（0.90 g/ml）和通量（1.5 ml/min）條件下，以體積分數(shù)3%的甲醇為改性劑，可在110 min內(nèi)提取98%的秋水仙堿，與傳統(tǒng)提取方法相比，超臨界CO₂萃取法更高效、快速、環(huán)保。

2.5 微波助提法

微波輔助提取的作用力主要來源于微波對細胞膜的生物效應(yīng)。微波能穿透組織細胞，導(dǎo)致細胞內(nèi)壓力和溫度升高，當(dāng)壓力超過細胞承受能力時細胞膜破裂，各種有效成分將從細胞進入溶劑中^[51]。Pandey等^[36]以微波助提法對嘉蘭中的秋水仙堿進行提取，主要參數(shù)設(shè)置為：微波功率300～600 W，提取時間3～9 min，溶劑為20%～40%（體積分數(shù)）的乙醇水溶液，溶劑pH為 2～6。通過比對獲得最優(yōu)提取條件：微波功率460 W，微波處理時間6.4 min，乙醇水溶液的體積分數(shù)為30%，pH值為3，在此條件下獲得的秋水仙堿含量達到最大值（7.51 mg/g）。Agrawal等^[15]同樣以微波助提法提取嘉蘭塊莖中的秋水仙堿，結(jié)果顯示，在最佳提取條件下，即微波功率245 W、微波處理時間15 min、提取溶劑為100%甲醇時，秋水仙堿的質(zhì)量分數(shù)為0.64%。

2.6 酶促提取法

酶在提取過程中可降解細胞壁及細胞間質(zhì)中的成分，通過破壞細胞滲透阻力，將細胞內(nèi)的有效成分分離出來^[52]。黃旖旎等^[53]將百合粉與磷酸鹽緩沖液混合加熱糊化，之后采用NaOH溶液堿化和α-淀粉酶溶液恒溫酶解，最后以三氯甲烷萃取，結(jié)果顯示，在 2～10 U的酶量范圍內(nèi)，隨著酶量提高，提取液中葡萄糖濃度增加，秋水仙堿的提取率也相應(yīng)提高。淀粉酶不同用量處理的秋水仙堿提取率均高于對照，原因可能是α-淀粉酶在降解淀粉時，淀粉被水解成較小的葡萄糖分子，能夠使更多被淀粉結(jié)構(gòu)包圍的秋水仙堿釋放出來，由此說明加入淀粉酶可提高百合鱗莖中秋水仙堿的提取率。

2.7 雙水相萃取法

雙水相萃取系統(tǒng)是由2種化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的親水性聚合物，或一種親水性聚合物、低相對分子質(zhì)量親水性有機溶劑與無機鹽在水中以適當(dāng)濃度形成的互不相容的兩水相系統(tǒng)，當(dāng)目標物進入雙水相體系后，因相對分子質(zhì)量大小、電荷作用和各種力的存在以及環(huán)境影響使其在上相和下相中濃度不同而實現(xiàn)分離^[41]。石瑤等^[30]以聚乙二醇（PEG）與（NH₄）₂SO₄形成的雙水相體系萃取麗江山慈姑中的秋水仙堿，發(fā)現(xiàn)PEG相對分子質(zhì)量大小與雙水相成相體系的組成及成相后的相比有關(guān)，隨著PEG相對分子質(zhì)量增加，相同濃度的PEG成相所需的鹽量逐漸減少，成相能力為PEG6000＞PEG4000＞PEG2000＞PEG600＞PEG400。當(dāng)pH為7.0、PEG6000質(zhì)量分數(shù)為8%、（NH₄）₂SO₄質(zhì)量分數(shù)為20%時，秋水仙堿主要集中于上相（PEG相），質(zhì)量濃度為0.749 6 mg/ml。雙水相體系對麗江山慈姑粗提液中秋水仙堿的萃取率達82.09%，富集倍數(shù)為6.84倍。此方法與傳統(tǒng)的液液萃取、固相萃取等方法相比，具有操作簡單、萃取條件溫和、不使用有機溶劑等優(yōu)點，除在蛋白質(zhì)、酶、核酸的分離和純化方面具有廣闊的應(yīng)用前景外^[54]，也為生物堿類化合物的萃取分離提供了一種有效方法。

2.8 其他方法

除上述方法外，生物堿提取已從使用單一方法演變?yōu)槎喾N方法的集成應(yīng)用。李璐等^[55]采用正交試驗法建立了淫羊藿生物堿的超聲波-微波協(xié)同提取工藝，淫羊藿葉片粉末密封浸泡40 min后在超聲波-微波協(xié)同作用下萃取18 min，微波功率250 J/s， 液固比為30 ml/g， 乙醇溶液體積分數(shù)為70%，淫羊藿生物堿的提取率可達16.146 mg/g，顯著高于超聲波提取法、微波提取法和加熱提取法。劉謀盛等^[56]采用超聲波輔助雙水相萃取系統(tǒng)從山慈姑中提取秋水仙堿，原料中加入其質(zhì)量3～5倍的乙醇（80%～95%，體積分數(shù)）和原料質(zhì)量4～6倍的水，浸泡后加入原料質(zhì)量0.5～2.0倍的硫酸銨、硫酸鈉或甲酸鈉中的一種，在溫度40～70 ℃、頻率30～200 kHz的超聲波作用下進行雙水相萃取30～60 min。富含秋水仙堿的上層溶液減壓濃縮形成含秋水仙堿的浸膏，經(jīng)脫鹽純化和大孔吸附樹脂柱分離后得到純度大于95%的高純度秋水仙堿。此方法以超聲波輔助萃取，提高了秋水仙堿的萃取率，雙水相萃取同時又對目標化合物起到分離純化的作用，在秋水仙堿的生產(chǎn)上具有一定的應(yīng)用前景。

2.9 不同提取方法的比較

秋水仙堿的不同提取方法均具有各自的優(yōu)點和局限性，并且由于含秋水仙堿的植物種類多樣且含量差異較大，因此相同提取方法在不同植物上的應(yīng)用效果也有一定差別。Agrawal等^[15]同時采用5種方法提取嘉蘭莖塊中的秋水仙堿，結(jié)果顯示，與其他方法相比，微波助提法的用時最短，溶劑消耗量最少，提取效率最高。浸提法以水為提取劑經(jīng)24 h提取得到的秋水仙堿質(zhì)量分數(shù)為0.310%，超聲提取法以體積分數(shù)50%的甲醇水溶液提取4 h，秋水仙堿得率為0.270%，而微波助提法在功率245 W時以甲醇為提取劑僅需提取15 min，秋水仙堿含量即可達0.640%（質(zhì)量分數(shù)）。Bayrak等^[16]通過比對超臨界CO₂萃取與傳統(tǒng)提取法對C. speciosum種子中秋水仙堿的提取差異時發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過脫脂處理的種子膏狀物用200 ml體積比為95∶5的甲醇-水混合液振蕩浸提24 h，同時在提取過程中采用2次各30 min的超聲波輔助提取，可獲得最高的提取得率（4.12%），但所得提取產(chǎn)物中除秋水仙堿外還含有秋水仙苷、3-去甲秋水仙堿2種秋水仙堿的衍生物，秋水仙堿的提取率取決于溶劑體積和振蕩周期。而超臨界CO₂萃取在35 ℃、CO₂流速1.50 ml/min、CO₂密度0.90 g/ml提取5 h的條件下，秋水仙堿的得率為1.44%，提取物僅含有秋水仙堿和另一種未知化合物。由于超臨界CO₂萃取過程使用甲醇作為改性劑，因此除節(jié)約時間外，超臨界CO₂萃取并未體現(xiàn)出更多區(qū)別于傳統(tǒng)提取法的優(yōu)勢。黃旖旎等^[53]將百合粉末在85 ℃高溫下糊化處理后用α-淀粉酶進行酶解，再以三氯甲烷為溶劑浸提原料中的秋水仙堿，結(jié)果證實α-淀粉酶酶解可以提高百合粉末中秋水仙堿的提取得率，此方法操作步驟簡便，用時較短，但需使用三氯甲烷為提取溶劑，對環(huán)境有一定污染。表2簡要比對了各種提取方法的提取時間、試劑、技術(shù)要點及秋水仙堿提取得率，微波助提法在提取時間和得率方面顯示出極大的優(yōu)勢，具有較高的實際應(yīng)用價值。

3 秋水仙堿的分離純化

3.1 膜分離技術(shù)

膜分離技術(shù)是以選擇性透過膜為分離介質(zhì)，借助液體的濃度差或電位差為推動力，對混合物中的特定組分實現(xiàn)分離、提純和濃縮的分離技術(shù)^[57]。在藥物分離上常用的膜技術(shù)主要包括微濾（濾膜孔徑≥0.1 μm）、超濾（濾膜孔徑10.0～100.0 nm）、納濾（濾膜孔徑1.0～10.0 nm）和反滲透（濾膜孔徑≤1.0 nm）4類。微濾膜為均勻的多孔薄膜，厚度為90～150 μm，操作壓力為0.01～0.20 MPa，過濾粒徑為0.025～10.000 μm，常用于截留粒徑大于0.1 μm的微粒^[58]。以微濾膜過濾粗提液是秋水仙堿提取純化中常用的方法，0.45 μm的微濾膜適用于對不同提取方法獲得的秋水仙堿粗提液進行分離純化，為后續(xù)采用HPLC定量測定秋水仙堿的濃度提供高純度溶液^{[15，24，37，43]}。Gumustas等^[59]從C. speciosum和G. superba的種子中提取秋水仙堿時發(fā)現(xiàn)，以甲醇為溶劑稀釋秋水仙堿提取物再以0.45 μm的微濾器進行過濾，在隨后的濃度檢測中沒有觀察到由基質(zhì)引起的其他化合物干擾，說明選擇甲醇溶劑和微濾分離結(jié)合的提取效果較好。

3.2 色譜法

3.2.1 薄層色譜法 薄層色譜利用涂布于平板上的物質(zhì)的吸附能力的差異，使混合溶液流經(jīng)固定相時被吸附，從而獲得目標提取物。Alali等^[60]以石油醚提取2種秋水仙球莖、葉和花中的秋水仙堿，將粗提物溶于體積分數(shù)70%的乙醇并以硅膠制備的薄層色譜板進行分離，秋水仙堿經(jīng)分離后顯示為黃色區(qū)域，將其從平板上取出溶于乙醇鹽酸溶液即可用紫外分光光度法測定秋水仙堿含量。Bodoki等^[61]為檢測秋水仙種子中秋水仙堿的含量，采用薄層色譜法分離秋水仙堿的乙醇提取物，在溫度20～24 ℃和濕度46%～56%的條件下以三氯甲烷-丙酮-二乙胺（5∶4∶1，體積比）的溶劑體系作為流動相，混合物分離后在350 nm反射率和254 nm熒光模式下進行密度掃描測定，結(jié)果顯示，對于來源未知的待檢樣品，薄層色譜法更容易消除其背景干擾，可作為快速、準確定性和定量測定不同基質(zhì)中秋水仙堿的標準技術(shù)，具有樣品預(yù)處理流程簡單、成本較低和可高通量檢測樣品的優(yōu)點。

3.2.2 柱色譜分離法 柱色譜分離原理與薄層色譜法相同，但柱色譜分離通量大且效率高、適用范圍廣、操作更簡單。柱色譜常用的吸附劑或載體主要有硅膠、聚酰胺、葡聚糖凝膠、環(huán)糊精鍵合凝膠、氧化鋁、大孔樹脂、纖維素粉和離子交換樹脂等^[62]。Kannan等^[63]采用柱色譜法分離得到嘉蘭種子的秋水仙堿粗提物，分離柱填充中性氧化鋁，洗脫劑為體積比97∶3的三氯甲烷和甲苯混合液，分離后的秋水仙堿結(jié)晶純度高達99.9%。Joshi等^[64]用體積分數(shù)為90%的甲醇對嘉蘭種子中的秋水仙堿進行第一次提取，甲醇提取物通過真空濃縮后再用二氯甲烷進行第二次提取，獲得的干物質(zhì)經(jīng)多步清洗去除酚類雜質(zhì)之后溶于乙醇，乙醇溶液經(jīng)過活性炭柱洗脫，得到分數(shù)為96.7%的秋水仙堿，再經(jīng)中性氧化鋁柱進一步純化，最終獲得質(zhì)量分數(shù)為99.82%的秋水仙堿。由此說明氧化鋁柱可分離高純度的秋水仙堿，并且氧化鋁柱色譜可與其他分離手段結(jié)合使用，將氧化鋁柱分離作為最后的純化步驟能夠使化合物的分離效果達到最優(yōu)。

3.3 樹脂吸附法

常規(guī)樹脂分為離子交換樹脂和吸附樹脂，大孔吸附樹脂是一類高分子聚合物，具有大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和較大的比表面積，理化性質(zhì)穩(wěn)定，吸附力強且易洗脫，可循環(huán)使用^[65]。李曉靜等^[66]以秋水仙堿提取液為大孔樹脂的上樣液，比較5種不同型號的大孔樹脂（D101為非極性，LSA5B、LSA21 為弱極性，HPD600 和 LSD001為極性大孔吸附樹脂） 的吸附解吸性能，不同極性的大孔吸附樹脂依次用NaOH溶液、HCl溶液和95%（體積分數(shù)）乙醇浸泡、水洗后再進行篩選，結(jié)果表明，樹脂的極性、比表面積和平均孔徑的大小直接影響樹脂的吸附容量和解析率，非極性樹脂D101和弱極性樹脂LSA5B和LSA21對秋水仙堿的吸附量較大，但LSA21和D101吸附達到平衡所需時間較長，LSA5B吸附達到平衡所需時間較短，且有較高解析率。在pH值2.5、上樣體積流量1.5 BV/h、秋水仙堿飽和吸附量26.49 mg/g時，用體積分數(shù)70%的乙醇洗脫，洗脫體積流量1.5 BV/h的條件下，LSA5B大孔樹脂對秋水仙堿的吸附率達98.16%，秋水仙堿的質(zhì)量濃度比富集前提高25倍。近年來，樹脂吸附除應(yīng)用在分離純化粉末狀原料中的秋水仙堿外，用樹脂吸附培養(yǎng)基中的秋水仙堿也有相關(guān)研究報道。Nasreen等^[67]在秋水仙種子的培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)，占總含量40%～70%的秋水仙堿是由標記前體合成的秋水仙堿，表明在種子內(nèi)合成的秋水仙堿被釋放到培養(yǎng)基中。Aroud^[68]對C.autumnale和G.superba進行愈傷組織及根組織的懸浮培養(yǎng)，用非極性的大孔樹脂XAD-4、XAD-16和中極性的大孔樹脂XAD-7吸附液體培養(yǎng)基中的秋水仙堿，將樹脂封閉在尼龍網(wǎng)袋中與細胞懸浮培養(yǎng)物一起孵育，XAD-4和XAD-16 2種樹脂對秋水仙堿的吸收率分別達到98.0%和99.5%，由此說明樹脂吸附不僅可以高效純化分離物，在細胞工程中還可以大大提高目標化合物的生產(chǎn)效率。

3.4 秋水仙堿不同分離純化方法的特點

秋水仙堿的分離純化研究多集中于膜分離技術(shù)、色譜分離和樹脂吸附3類方法。膜分離技術(shù)在生物堿的分離純化方面應(yīng)用廣泛，秋水仙堿分離純化常采用0.45 μm孔徑的微濾膜進行初級純化，濾液需協(xié)同其他分離手段再經(jīng)過進一步純化才能得到純度更高的秋水仙堿產(chǎn)品^[37，43]。色譜法利用待分離物在固定相中吸附分配的微小差別，將各種性質(zhì)極相似的組分彼此分離。Bodoki等^[61]采用以硅膠60為固定相的薄層色譜分離從C. autumnale中獲得的秋水仙堿粗提物，證實此法可消除秋水仙堿因光照產(chǎn)生降解產(chǎn)物的干擾，將有生物活性的秋水仙堿準確地分離出來，說明薄層色譜法可作為定性、定量分離秋水仙堿的標準技術(shù)，廣泛應(yīng)用于制藥工業(yè)中快速、準確地分離秋水仙堿。柱色譜分離可使用的吸附劑種類較多，秋水仙堿常用的吸附劑為中性氧化鋁，由柱色譜分離獲得的秋水仙堿純度高達98%以上^[63-64]。大孔樹脂在生物堿的分離純化領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，但因其種類繁多，選擇時應(yīng)滿足目標成分對樹脂吸附容量和解析率的要求。在秋水仙堿純化時篩選過的樹脂型號包括LSA5B、LSA21、LSD001、HPD600、D101等^[66]，非極性和弱極性的大孔吸附樹脂顯示出對秋水仙堿吸附量更大、過濾速度更快、解析更容易等優(yōu)點。由于樹脂吸附性能穩(wěn)定，可回收再利用，與膜分離技術(shù)集成聯(lián)用，可充分發(fā)揮各自的工藝優(yōu)勢，獲得純度更高的化合物單體。

4 結(jié)論與展望

目前大多數(shù)植物次生代謝物產(chǎn)品的獲取都是通過田間栽培或從自然棲息地收集的植物材料中提取純化^[69]，秋水仙堿的生產(chǎn)仍然以從栽培植物中提取為主，因此，秋水仙堿含量高的植物一直是人們尋找的熱點植物。嘉蘭的秋水仙堿質(zhì)量分數(shù)（0.90%）高于秋水仙的秋水仙堿質(zhì)量分數(shù)（0.62%）^[60]，且種植范圍較廣，逐步成為生產(chǎn)秋水仙堿的主要基源植物^[18]。在提取方法上，對于種子類原料，Bayrak等^[16]在提取前增加脫脂步驟，提高了秋水仙堿的提取率，而對球莖、塊莖類材料，采用酶解或堿化等^[50，53]處理方法去除淀粉和多糖成分，減少此類物質(zhì)對提取過程的干擾，可獲得更高的秋水仙堿提取得率。隨著秋水仙堿的提取方式越來越多樣，僅憑單一提取技術(shù)常常難以滿足多個目標。傳統(tǒng)提取方法效率低，耗時較長，提取過程需要使用大量對環(huán)境有污染的試劑，而單獨使用超聲輔助、超臨界CO₂萃取、酶輔助、雙水相萃取等方法雖能加快提取速度，但并不能大幅提升秋水仙堿的提取得率。因此，由不同提取技術(shù)組合而成的協(xié)同提取法應(yīng)用價值極高，可針對各種技術(shù)優(yōu)勢互補的原則形成高效的協(xié)同提取法，減少使用有毒試劑，降低生產(chǎn)成本，以利于秋水仙堿提取技術(shù)的工業(yè)化應(yīng)用將是今后研究的主要方向。

在秋水仙堿的分離純化研究方面，膜分離、色譜分離和樹脂吸附技術(shù)取得了一定的研究進展。膜分離過程操作簡單，常用于秋水仙堿粗提液的分離純化，與色譜分離或大孔樹脂吸附協(xié)同作用可得到高純度的秋水仙堿。大孔樹脂因具有吸附量大、分離高效快速等優(yōu)點，最宜于在工業(yè)生產(chǎn)中使用。隨著Nett等^[70]闡明嘉蘭（G. superba）中完整的秋水仙堿生物合成途徑，并在煙草中成功重現(xiàn)秋水仙堿的合成過程，后續(xù)針對生物合成秋水仙堿的特異性分離將會成為一項必要的研究，將不同分離純化技術(shù)的優(yōu)勢整合，減少操作步驟，降低成本，篩選環(huán)保型的分離介質(zhì)，是下一步秋水仙堿分離純化需要開展的工作。

參考文獻：

[1] ADE R， RAI M K. Review： colchicine， current advances and future prospects[J]. Nusantara? Bioscience， 2010， 2（2）： 90-96.

[2] DASGEB B， KORNREICH D， MCGUINN K， et al. Colchicine： an ancient drug with novel applications[J]. British Journal of Dermatology， 2018， 178（2）： 350-356.

[3] KOLKHIR P， GRAKHOVA M， BONNEKOH H， et al. Treatment of urticarial vasculitis： a systematic review[J]. Journal of Allergy & Clinical Immunology， 2019， 143（2）： 458-466.

[4] SAMUEL M， TARDIF J C， BOUABDALLAOUI N， et al. Colchicine for secondary prevention of cardiovascular disease： a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials[J]. Canadian Journal of Cardiology， 2021， 37（5）： 776-785.

[5] ELSHAFEI M N， KHALIL A， EL-BARDISSY A， et al. The efficacy of colchicine in the management of coronavirus disease 2019： a protocol for systematic review and meta-analysis[J]. Medicine， 2020， 99（36）： e21911.

[6] 王亞茹，鄧高松，李 云，等. 秋水仙堿對微管蛋白的作用機制及其細胞效應(yīng)研究進展[J]. 西北植物學(xué)報， 2010， 30（12）： 2570-2576.

[7] DALBETH N， LAUTERIO T J， WOLFE H R. Mechanism of action of colchicine in the treatment of gout[J]. Clinical Therapeutics， 2014， 36（10）： 1465-1479.

[8] ANGELIDIS C， KOTSIALOU Z， KOSSYVAKIS C， et al. Colchicine pharmacokinetics and mechanism of action[J]. Current Pharmaceutical Design， 2018， 24（6）： 659-663.

[9] 李 赟，郭 倩，王 君，等. 秋水仙堿誘導(dǎo)銀白楊花粉染色體加倍及其細胞學(xué)效應(yīng)研究[J]. 核農(nóng)學(xué)報， 2014， 28（5）：749-756.

[10]LIMERA C， WANG K， XU L， et al. Induction of autotetraploidy using colchicine and its identification in radish （Raphanus sativus L.） [J]. The Journal of Horticultural Science and Biotechnology， 2016， 91（1）： 63-70.

[11]DIXIT V， CHAUDHARY B R. Colchicine-induced tetraploidy in garlic （Allium sativum L.） and its effect on allicin concentration[J]. Journal of Horticultural Science & Biotechnology， 2014， 89 （5）： 585-591.

[12]DIXIT V， VERMA S， CHAUDHARY B R. Changes in ploidy and its effect on thymoquinone concentrations in Nigella sativa L. seeds[J]. Journal of Horticultural Science & Biotechnology， 2015， 90 （5）：537-542.

[13]李文文，吳光斌，陳發(fā)河. 秋水仙堿處理對采后蓮霧果實在冷藏期間品質(zhì)， 活性氧代謝和能量代謝的影響[J]. 食品科學(xué)， 2016， 37（16）： 272-279.

[14]YANG L Q， STOCKIGT J. Trends for diverse production strategies of plant medicinal alkaloids[J]. Natural Product Reports， 2010， 27（10）： 1469-1479.

[15]AGRAWAL P， LADDHA K. Extraction of colchicine from Gloriosa superba tubers： a comparison of conventional and microwave-assisted extraction[J]. Journal of Microwave Power and Electromagnetic Energy， 2019， 53（1）：1-10.

[16]BAYRAK S， SOKMEN M， AYTAC E， et al. Conventional and supercritical fluid extraction （SFE） of colchicine from Colchicum speciosum[J]. Industrial Crops & Products， 2019， 128（3）： 80-84.

[17]田素英，陳周全. 山慈菇中秋水仙堿醇提工藝的優(yōu)選[J]. 中草藥， 2002， 33（8）： 708-710.

[18]KITAJIMA M， TANAKA A， KOGURE N， et al. Metacolchicine， a new colchicinoid from Sandersonia aurantiaca[J]. Heterocycles， 2011， 83（8）： 1903-1907.

[19]ELLINGTON E， BASTIDA J， VILADOMAT F， et al. Occurrence of colchicine derivatives in plants of the genus Androcymbium[J]. Biochemical Systematics and Ecology， 2003， 31（7）： 715-722.

[20]POTESILOVA H， MACFARLANE T D， GUENARD D. Alkaloids and phenolics of Wurmbea and Burchardia species[J]. Phytochemistry， 1987， 26（4）： 1031-1032.

[21]VINNERSTEN A， LARSSON S. Colchicine is still a chemical marker for the expanded Colchicaceae[J]. Biochemical Systematics and Ecology， 2010， 38（6）： 1193-1198

[22]BOZYEL M E， MERDAMERT-BOZYEL E， BENEK A， et al. Ethnomedicinal uses of colchicaceae and liliaceae taxa in turkey， advances in scientific research： engineering and architecture[M]. Sofia：St. Kliment Ohridski University Press， 2020.

[23]唐湘?zhèn)? 高效液相色譜法檢測不同采收期邵陽龍牙百合的秋水仙堿含量[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報， 2018， 9（5）： 1013-1016.

[24]張 寧，李 森，王金耀，等. 萱草屬植物花蕾中秋水仙堿含量HPLC檢測體系的優(yōu)化[J]. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報， 2017， 40（5）： 48-54.

[25]王慧春，李 毅，王 環(huán)，等. 光照對水母雪蓮愈傷組織合成生物堿的影響[J]. 西北植物學(xué)報， 2002， 22（1）： 69-73.

[26]徐 彥，吳春蕾，劉 圓，等. 唐古特雪蓮的化學(xué)成分研究[J]. 中草藥， 2010， 41（12）： 1957-1960.

[27]何達海，丁克毅，王曉玲. 天南星屬植物化學(xué)成分研究進展[J]. 西南民族大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）， 2014， 40（6）： 861-865.

[28]OU L L， ZHU Y， SHUI P X， et al. Extraction and anti-inflammatory effects of colchicine from Sagittaria sagittifolia[J]. Agricultural Science & Technology， 2017， 18（7）： 1208-1212， 1216.

[29]ALEMU I D， DABA T M. Gloriosa， a source of colchicine review article[J]. International Journal of Biological and Chemical Sciences， 2016， 10（4）： 1888-1893.

[30]石 瑤，楊亞玲，李晚誼，等. 雙水相萃取麗江山慈菇中的秋水仙堿[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)， 2012， 24（10）： 1412-1416.

[31]JANA S， SHEKHAWAT G S. Critical review on medicinally potent plant species： Gloriosa superba[J]. Fitoterapia， 2011， 82（3）： 293-301.

[32]楊 雄，金兆元，李 維. 一種秋水仙堿的提取方法： CN102276493B[P]. 2013-12-11.

[33]ELLINGTON E， BASTIDA J， VILADOMAT F， et al. Supercritical carbon dioxide extraction of colchicine and related alkaloids from seeds of Colchicum autumnale L.[J]. Phytochemical Analysis， 2003， 14（3）： 164-169.

[34]PANDEY D K， BANIK R M. Optimization of extraction conditions for colchicine from Gloriosa superba tubers using response surface methodology[J]. Journal of Agricultural Technology， 2012， 8（4）： 1301-1315.

[35]李慧芳，莊 麗，董又溧，等. 野罌粟不同產(chǎn)地不同部位中生物堿類成分的比較研究[J]. 中草藥， 2017， 48（23）： 4986-4993.

[36]PANDEY D K， KAUR P， KUMAR V， et al. Screening the elite chemotypes of Gloriosa superba L. in India for the production of anticancer colchicine： simultaneous microwave-assisted extraction and HPTLC studies[J]. BMC Plant Biology， 2021， 21： 1-18.

[37]袁理春，徐中志，趙 琪，等. 麗江山慈姑秋水仙堿HPLC測定[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報， 2007， 20（1）： 120-122.

[38]AKRAM M N， VERPOORTE R， POMAHACOVA B. Effect of bulb age on alkaloid contents of narcissus pseudonarcissus bulbs[J]. South African Journal of Botany， 2021，136： 182-189.

[39]ALALI F Q， EL-ALALI A， TAWAHA K， et al. Seasonal variation of colchicine content in Colchicum brachyphyllum and Colchicum tunicatum （Colchicaceae） [J]. Natural Product Research， 2006， 20（12）： 1121-1128.

[40]AL-FAYYAD M， ALALI F， ALKOFAHI A， et al. Determination of colchicine content in Colchicum hierosolymitanum and Colchicum tunicatum under cultivation[J]. Natural Product Letters， 2002， 16（6）： 395-400.

[41]樊輕亞，許衛(wèi)軍，代春美. 雙水相萃取/超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定倒提壺中8種生物堿[J]. 分析測試學(xué)報， 2019， 38（11）： 1328-1334.

[42]KANG X， DENG L L， QUAN T， et al. Selective extraction of quinolizidine alkaloids from Sophora flavescens Aiton root using tailor-made deep eutectic solvents and magnetic molecularly imprinted polymers[J]. Separation and Purification Technology， 2021， 261： 118282.

[43]ANKAYA N， BULDUK I， OLAK A M. Extraction， development and validation of HPLC-UV method for rapid and sensitive determination of colchicine from Colchicum autumnale L. bulbs[J]. Saudi Journal of Biological Sciences， 2019， 26（2）： 345-351.

[44]黃晨熙，黃贛輝，郭勇輝. 提取秋水仙堿的方法：CN104610084B[P]. 2016-06-01.

[45]姚紅銳，尚 靖，柳 軍，等. 百合各株系中秋水仙堿提取方法優(yōu)化及含量測定[J]. 中醫(yī)藥臨床雜志， 2015， 27（5）：729-731.

[46]陳莉華，張 麗，徐 果. 百合粉中秋水仙堿的提取及抑菌性研究[J]. 食品科學(xué)， 2011， 32（6）： 57-60.

[47]管倫興，儲益平. 云南麗江山慈菇品種考證及有效成分秋水仙堿含量的研究[J]. 中藥與臨床， 2015， 6（3）： 1-3.

[48]吳劍夫，程安瑋，孫金月，等. 超聲波輔助提取秋葵果膠工藝優(yōu)化及理化性質(zhì)分析[J]. 核農(nóng)學(xué)報， 2018， 32（10） ： 2002-2011.

[49]石一飛，陳巧青，徐永進，等. 超臨界流體CO₂萃取浙貝母花生物堿的工藝研究[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工， 2017（10）： 34-36.

[50]李新社，王志興. 溶劑提取和超臨界流體萃取百合中的秋水仙堿[J]. 中南大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）， 2004， 35（2）： 244-248.

[51]王 遠，鄭 雯，袁田青，等. 辣木葉總黃酮微波輔助提取工藝優(yōu)化及其抑制α-葡萄糖苷酶活性研究[J].核農(nóng)學(xué)報， 2018， 32（1）：84-94.

[52]宋成英. 酶解技術(shù)在中藥提取中的應(yīng)用研究[J]. 時珍國醫(yī)國藥， 2013， 24（8）： 1934-1935.

[53]黃旖旎，索緒斌，鄧妍芳，等. α-淀粉酶水解百合的動力學(xué)及對秋水仙堿提取得率影響的研究[J]. 廣東藥學(xué)院學(xué)報， 2015， 31（1）： 14-19.

[54]劉麗麗，程利明，車紅霞，等. 雙水相萃取技術(shù)提取牛乳過氧化物酶[J]. 中國食品學(xué)報， 2016， 16（10）： 93-98.

[55]李 璐，安葉娟，喬春雷，等. 淫羊藿生物堿的超聲波-微波協(xié)同提取及其對HeLa細胞的抑制作用[J]. 植物學(xué)報， 2018， 53 （3）： 341-352.

[56]劉謀盛，石 瑤，楊亞玲.一種秋水仙堿的制備方法：CN102627576A [P]. 2012-08-08.

[57]徐龍泉，彭黔榮，楊 敏，等．膜分離技術(shù)在中藥生產(chǎn)及研究中的應(yīng)用進展[J]. 中成藥， 2013， 35（9）： 1989-1994.

[58]謝慧榮，羅忠圣，錢 余，等. 膜分離技術(shù)在天然產(chǎn)物中的應(yīng)用[J]. 食品科技， 2021， 46（5）： 104-107.

[59]GUMUSTAS M， POLAT D ， KILIC D S， et al. Comparison of seeds of Colchicum speciosum and Gloriosa superba in respect to colchicine and colchicoside contents by RP-LC[J]. Natural Product Communications， 2016， 11（3）： 397-400.

[60]ALALI F， TAWAHA K， QASAYMEH R M. Determination of colchicine in Colchicum steveni and C. hierosolymitanum （Colchicaceae）： comparison between two analytical methods[J]. Phytochemical Analysis， 2004， 15（1）： 27-29.

[61]BODOKI E， OPREAN R， VLASE L， et al. Fast determination of colchicine by TLC-densitometry from pharmaceuticals and vegetal extracts[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis， 2005， 37（5）： 971-977.

[62]楊發(fā)容，景聯(lián)鵬，顧麗莉，等. 色譜技術(shù)在黃酮類化合物分離純化中的應(yīng)用研究進展[J]. 食品與機械，2021，37（12）：202-208.

[63]KANNAN S， WESLEY S D， RUBA A， et al. Optimization of solvents for effective isolation of colchicines from Gloriosa superba L. seeds[J]. Natural Product Research， 2007， 21（5）： 469-472.

[64]JOSHI C S， PRIYA E S， MATHELA C S. Isolation and anti-inflammatory activity of colchicinoids from Gloriosa superba seeds[J]. Pharmaceutical Biology， 2010， 48（2）： 206-209.

[65]楊 敏，張?zhí)戾a，史 磊，等. 大孔吸附樹脂分離純化中藥成分影響因素探討[J]. 中草藥， 2020， 51（15）： 4050-4058.

[66]李曉靜，李 巖，程雪梅，等. 大孔樹脂分離純化秋水仙總生物堿的研究[J]. 中成藥， 2013， 35（8）： 1667-1671.

[67]NASREEN A， GUNDLACH H， ZENK M H. Incorporation of phenethylisoquinolines into colchicine in isolated seeds of Colchicum autumnale [J]. Phytochemistry， 1997， 46（1）： 107-115.

[68]AROUD G. Production of colchicine by using plant cell culture[D]. Dublin： Dublin City University， 2005.

[69]KEFI S. A novel approach for production of colchicine as a plant secondary metabolite by in vitro plant cell and tissue cultures[J]. Journal of Agricultural Science and Technology A， 2018， 3： 121-128.

[70]NETT R S， LAU W， SATTELY E S. Discovery and engineering of colchicine alkaloid biosynthesis[J]. Nature， 2020， 584（7819）： 148-153.

（責(zé)任編輯：陳海霞）