楊春妹　李志明　范先婷　沈宏

摘要： 為明確福林酚比色法測(cè)定海藻多酚含量的反應(yīng)條件，本研究采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)相結(jié)合的方法，優(yōu)化了福林酚用量、碳酸鈉用量、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度等福林酚法測(cè)海藻多酚含量的檢測(cè)條件；并進(jìn)一步分析了外源物質(zhì)（有機(jī)物質(zhì)、無(wú)機(jī)離子）對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。結(jié)果表明，應(yīng)用福林酚比色法測(cè)定海藻多酚的最佳反應(yīng)條件為：12%福林酚5 ml、3%碳酸鈉4 ml、反應(yīng)溫度37 ℃、反應(yīng)時(shí)間30 min、最佳吸收波長(zhǎng)730 nm；該方法的加標(biāo)回收率為96.70%-103.67%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差2.68%。優(yōu)化的福林酚法測(cè)得7種藻類的多酚含量為120.0～273.0 mg/L，其測(cè)定結(jié)果與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)茶多酚檢測(cè)法的檢測(cè)結(jié)果一致。外源添加1%或5%的Cu²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺、Cl^-、I^-、蛋白質(zhì)、可溶性淀粉測(cè)定結(jié)果增加2.31%-149.79%;添加5%的Zn²⁺、CO^2-₃、NO^-₃、PO^3-₄測(cè)定結(jié)果顯著降低，而山梨酸鉀、葡萄糖、D-山梨醇對(duì)福林酚比色法檢測(cè)海藻多酚含量無(wú)明顯影響。本研究建立的海藻多酚檢測(cè)法的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性以及加標(biāo)回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差均低于3%，符合檢測(cè)要求。

關(guān)鍵詞： 海藻多酚；福林酚比色法；海藻；有機(jī)物質(zhì)；無(wú)機(jī)離子

中圖分類號(hào)： TS201.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 1000-4440（2023）01-0238-08

Study on determination conditions of seaweed polyphenols by Folin-Ciocalteu colorimetry

YANG Chun-mei， LI Zhi-ming， FAN Xian-ting， SHEN Hong

（College of Resource and Environment， South China Agricultural University， Guangzhou 510642， China）

Abstract： In order to clarify the reaction conditions for the determination of seaweed polyphenol content by Folin-Ciocalteu colorimetric method， single factor test and orthogonal test were used to optimize the amount and concentration of Folin phenol， the amount and concentration of sodium carbonate， the reaction time and the reaction temperature. The effects of exogenous substances （organic substances and inorganic ions） on the determination results were further analyzed. The results showed that the optimum conditions for the determination of seaweed polyphenols by Folin-Ciocalteu colorimetric method were 12% Folin phenol 5 ml， 3% sodium carbonate 4 ml， reaction temperature 37 ℃， reaction time 30 min and the best absorption wavelength 730 nm. The recovery of this method was 96.70%-103.67%， and the relative standard deviation was 2.68%. The polyphenol content of seven kinds of algae measured by the optimized Folin-Ciocalteu colorimetric method was 120.0-273.0 mg/L， which was consistent with the results of national standard tea polyphenol detection method. Exogenous addition of 1% or 5% Cu²⁺， Ni²⁺， Mn²⁺， Cl^-， I^-， protein， soluble starch would increase the determination results by 2.31%-149.79%. The addition of 5% Zn²⁺， CO^2-₃， NO^-₃， PO^3-₄significantly reduced the determination results， while glycine， potassium sorbate， glucose and D-sorbitol had no significant effect on the determination of algae polyphenol content by Folin-Ciocalteu colorimetric method. The relative standard deviations of stability， reproducibility and the recovery of seaweed polyphenols detection method established in this study were all lower than 3%， which met the detection requirements.

Key words： seaweed polyphenols;Folin-Ciocalteu colorimetry;algae;organic matter;inorganic ions

海藻是重要的生物資源，其自身細(xì)胞為了適應(yīng)低溫、高鹽、寡照等惡劣的海洋環(huán)境，產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物來(lái)保護(hù)自身細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損傷^[1]。次級(jí)代謝產(chǎn)物主要包括海藻酸、海藻多酚、甘露醇、甜菜堿等^[2-3]，其中海藻多酚是以間苯三酚為基本結(jié)構(gòu)單位，通過(guò)不同連接方式而構(gòu)成的一類酚羥基化合物^[4]，已被證實(shí)具有較強(qiáng)的抗氧化、抗菌、抗癌等生物活性，廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域^[5]。

海藻多酚的種類多樣，易氧化，且結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，因此在盡可能保持海藻多酚原有結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上采用適宜的檢測(cè)方法才能準(zhǔn)確測(cè)定海藻多酚含量。目前關(guān)于化合物多酚含量的檢測(cè)方法有光譜法、色譜法、質(zhì)譜法3種^[6]。色譜法和質(zhì)譜法靈敏性高，檢測(cè)時(shí)間短，但操作復(fù)雜且設(shè)備昂貴。光譜法中的福林酚比色法是在堿性環(huán)境下，酚類化合物將鎢鉬酸還原，生成藍(lán)色的化合物。其具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、準(zhǔn)確性高等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用^[7-8]。但由于多酚類物質(zhì)的來(lái)源、化學(xué)結(jié)構(gòu)和含量不同^[9]，文獻(xiàn)所報(bào)道的福林酚比色法檢測(cè)條件（福林酚和碳酸鈉濃度和用量等）都不盡相同。張洋婷等用福林酚1.0 ml，10%碳酸鈉8 ml測(cè)定酸漿宿萼總多酚的含量^[10]；吳曉青等用福林酚3.0 ml，10%碳酸鈉4.0 ml測(cè)定檀香橄欖總多酚的含量^[11]；高志遠(yuǎn)等用15%福林酚1 ml、5%碳酸鈉0.8 ml測(cè)定甘薯塊根多酚的含量^[12]；茶多酚測(cè)定的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 8313—2018中用的是10%福林酚5.0 ml，7.5%碳酸鈉4.0 ml^[13]。而不同的試劑用量又影響到檢測(cè)結(jié)果，因此一些學(xué)者還采用單因素試驗(yàn)法開展了福林酚比色法的優(yōu)化條件研究^[10，12]。但目前采用福林酚法檢測(cè)海藻多酚的報(bào)道還比較少見。此外，海藻中富含K⁺、CI^-、Ca²⁺等無(wú)機(jī)離子及蛋白質(zhì)、淀粉等有機(jī)物，這些物質(zhì)對(duì)海藻多酚含量的檢測(cè)是否存在影響還鮮有報(bào)道。

針對(duì)上述問(wèn)題，本研究首先采用單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化了福林酚法檢測(cè)海藻多酚的反應(yīng)條件，然后對(duì)此方法的穩(wěn)定性和可靠性進(jìn)行評(píng)價(jià)，并用優(yōu)化的福林酚法和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)茶多酚檢測(cè)法測(cè)定了不同藻類中多酚的含量，最后分析了外源物質(zhì)對(duì)海藻多酚含量測(cè)定的影響，以期為海藻多酚的測(cè)定及應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

海藻液及7種藻類[羊棲菜 （Hizikia fusifarme）、海帶（Laminaria japonica）、馬尾藻 （Sargassum fusiforme）、泡葉藻（Ascophyllum nodosum）、面條藻（Durvillaea antarctica）、N藻（Lessonia Nigrescens）、F藻（Lessonia Flavicans）]購(gòu)于廣州申晶雅農(nóng)業(yè)科技有限公司。

1.2 儀器和設(shè)備

恒溫水浴鍋（HWS-5A），上海百典儀器設(shè)備有限公司制造；離心機(jī)（H1850R），湘儀離心機(jī)儀器有限公司制造；754型紫外可見分光光度計(jì)，上海舜宇恒平儀器有限公司制造；恒溫?fù)u床（BSD-YX 3200），上海博迅實(shí)業(yè)公司制造。

1.3 最佳吸收波長(zhǎng)的選擇

參考茶多酚檢測(cè)的反應(yīng)條件，分別吸取1.0 ml樣液（海藻液）和標(biāo)液（0.1 mg/mL沒(méi)食子酸）于試管，在每個(gè)試管中分別加入10%（體積分?jǐn)?shù)）福林酚5.0 ml，搖勻。反應(yīng)5 min后，加質(zhì)量濃度7.5%碳酸鈉溶液4.0 ml，搖勻，室溫下暗反應(yīng)45 min后，在500～800 nm波長(zhǎng)以1 nm為步長(zhǎng)測(cè)定吸光值，選擇最佳吸收波長(zhǎng)。

1.4 福林酚比色法檢測(cè)海藻多酚含量的條件優(yōu)化

以上述反應(yīng)條件為基礎(chǔ)，依次改變福林酚用量（2.0 ml、3.0 ml、4.0 ml、5.0 ml 、6.0 ml、7.0 ml、8.0 ml）、福林酚體積分?jǐn)?shù)（2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%）、碳酸鈉用量（1.0 ml、2.0 ml、3.0 ml、4.0 ml、5 ml、6.0 ml、7.0 ml）、碳酸鈉質(zhì)量濃度（1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%）、反應(yīng)溫度（32 ℃、37 ℃、42 ℃、47 ℃、52 ℃、57 ℃、62 ℃）、暗反應(yīng)時(shí)間（10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、35 min、40 min） 6個(gè)因素中的一個(gè)，開展海藻多酚檢測(cè)條件的單因素優(yōu)化試驗(yàn)。

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)海藻多酚含量檢測(cè)敏感因素各自最好的3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，每個(gè)處理重復(fù)3次。進(jìn)而明確海藻多酚含量檢測(cè)的最優(yōu)條件。

1.5 檢測(cè)方法的評(píng)價(jià)

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，配制質(zhì)量濃度為0 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L的沒(méi)食子酸工作液，用優(yōu)化的福林酚法測(cè)定其吸光值。以吸光值為Y軸，沒(méi)食子酸濃度為x軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

重復(fù)性評(píng)價(jià)：用優(yōu)化的福林酚法測(cè)定5份海藻液的吸光值。計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，評(píng)價(jià)該方法的重復(fù)性。

穩(wěn)定性評(píng)價(jià)：海藻液在最佳條件下反應(yīng)30 min后，在5 h內(nèi)每隔1 h測(cè)定一次吸光值，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，分析該方法在一定時(shí)間內(nèi)的穩(wěn)定性。

加標(biāo)回收率試驗(yàn)：分別取0.5 ml質(zhì)量濃度為10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L的標(biāo)液于試管中，且每個(gè)試管加0.5 ml已知多酚含量的樣液，用優(yōu)化的福林酚法測(cè)其吸光值，評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確性。加標(biāo)回收率的計(jì)算按下式進(jìn)行：

加標(biāo)回收率=（加標(biāo)后測(cè)定的含量-樣品含量）/加標(biāo)量×100%。

1.6 優(yōu)化的福林酚法和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)茶多酚檢測(cè)法測(cè)定不同藻類中多酚含量

海藻經(jīng)清洗、烘干、粉碎后，過(guò)0.15 mm篩備用。分別稱取3.00 g樣品，加水至100 ml，調(diào)節(jié)體系pH為8.5，加1.5 ml純海藻酸裂解酶^[14]，在180 r/min、40 ℃條件下降解18 h。降解結(jié)束后，離心，收集上清液，分別用優(yōu)化的福林酚法和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)茶多酚檢測(cè)法測(cè)定多酚的含量。

1.7 有機(jī)物質(zhì)或無(wú)機(jī)離子對(duì)福林酚法測(cè)海藻多酚的影響

每個(gè)試管依次添加質(zhì)量濃度1%或5%陽(yáng)離子（Ca²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺）、陰離子（F^-、Cl^-、I^-、CO^2-₃、NO^-₃、PO^3-₄）、有機(jī)物質(zhì)（甘氨酸、山梨酸鉀、蛋白質(zhì)、可溶性淀粉、葡萄糖、D-山梨醇）的樣液1 ml，用優(yōu)化的福林酚法測(cè)其吸光值。以不添加其他成分的樣液為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)三次。

1.8 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

采用 Excel 2016 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用 SPSS statistic 25 的Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行處理間差異的顯著性分析，用 Origin 2017作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳吸收波長(zhǎng)的確定

研究結(jié)果表明福林酚與多酚的反應(yīng)物在680～780 nm處有較大吸收^[10]。將樣液（海藻液）、標(biāo)液（沒(méi)食子酸）與福林酚反應(yīng)后，于500～800 nm波長(zhǎng)掃描，其光譜吸收曲線如圖1。從圖1可知樣液、標(biāo)液的吸光值均隨波長(zhǎng)的增加而先增后減，在730 nm處達(dá)最大值，故選730 nm為福林酚法測(cè)定海藻多酚的最佳吸收波長(zhǎng)。

2.2 福林酚法測(cè)海藻多酚的反應(yīng)條件優(yōu)化

福林酚劑量和體積分?jǐn)?shù)對(duì)福林酚法測(cè)定海藻多酚的影響如圖2A、圖2B所示。隨著福林酚用量或體積分?jǐn)?shù)的不斷增加，吸光值呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，福林酚試劑用量在6 ml時(shí)吸光值達(dá)最大，顯色效果最好（圖2A）；當(dāng)福林酚試劑的體積分?jǐn)?shù)為12%時(shí)吸光值最大，其吸光值比體積分?jǐn)?shù)為2%時(shí)增加79.18%（圖2B）。

碳酸鈉溶液是顯色介質(zhì)，其用量或質(zhì)量濃度較低時(shí)，顯色液呈草綠色，顯色效果差，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏低^[15]。碳酸鈉劑量和質(zhì)量濃度對(duì)福林酚法測(cè)海藻多酚的影響如圖2C、圖2D所示。吸光值隨碳酸鈉劑量和質(zhì)量濃度的增加也呈現(xiàn)先增加后減少的特征。碳酸鈉劑量為2 ml時(shí)，吸光值最大。當(dāng)碳酸鈉用量大于3 ml時(shí)，吸光值反而因堿性過(guò)強(qiáng)而下降（圖2C）；當(dāng)碳酸鈉質(zhì)量濃度小于3%或大于7%時(shí)，吸光值均較低。當(dāng)碳酸鈉質(zhì)量濃度為3%時(shí)，吸光值最大，其值比1%增加了80.24%（圖2D）。

溫度對(duì)福林酚法測(cè)定海藻多酚的影響如圖2E所示。隨反應(yīng)溫度的升高，730 nm吸光值亦表現(xiàn)出先增加后減少的趨勢(shì)。當(dāng)反應(yīng)溫度37 ℃時(shí)，吸光值最高；62 ℃的反應(yīng)溫度下，海藻液吸光值僅為0.489 7，相比于37 ℃時(shí)減少了24.82%。

福林酚試劑與多酚類物質(zhì)的顯色需要一定的時(shí)間，反應(yīng)時(shí)間對(duì)顯色效果的影響如圖2F所示。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間介于10～30 min時(shí)，吸光值隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加；反應(yīng)時(shí)間30 min時(shí)的海藻液吸光值比10 min時(shí)增加了75.36%。而當(dāng)反應(yīng)時(shí)間進(jìn)一步增加時(shí)，海藻液吸光值無(wú)顯著變化。這說(shuō)明，只要反應(yīng)時(shí)間達(dá)30 min后，反應(yīng)時(shí)間對(duì)吸光值將無(wú)顯著影響。

上述單因素試驗(yàn)結(jié)果表明福林酚用量與體積分?jǐn)?shù)、碳酸鈉用量與質(zhì)量濃度以及反應(yīng)溫度對(duì)海藻液730 nm吸光值有較大影響，而反應(yīng)時(shí)間大于30 min后，對(duì)吸光值影響不大。進(jìn)一步根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，選取各單素最優(yōu)的3個(gè)水平（表1）進(jìn)行正交試驗(yàn)，以確定最優(yōu)的福林酚法測(cè)定海藻多酚的反應(yīng)條件。

進(jìn)一步利用上述5因素3水平進(jìn)行L₁8（3⁵）正交試驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。從表2中可以看出福林酚劑量和體積分?jǐn)?shù)、碳酸鈉劑量和質(zhì)量濃度、反應(yīng)溫度對(duì)吸光值有較大的影響，優(yōu)化的測(cè)試條件為12%福林酚5 ml，3%碳酸鈉4 ml，溫度37 ℃。從表3中可以看出，不同水平下，福林酚劑量、碳酸鈉劑量、福林酚體積分?jǐn)?shù)、碳酸鈉質(zhì)量濃度、反應(yīng)溫度的吸光值極差分別為0.051、0.112、0.086、0.012、0.111。因此，影響吸光值的5個(gè)因素的順序大小依次為：碳酸鈉劑量>溫度>福林酚體積分?jǐn)?shù)>福林酚劑量>碳酸鈉質(zhì)量濃度。

2.3 檢測(cè)方法評(píng)價(jià)

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 按優(yōu)化的福林酚法測(cè)定質(zhì)量濃度分別為0 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液（沒(méi)食子酸）的吸光值，結(jié)果表明在0～50? mg/L，標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光值和質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為Y=0.006 5x-0.000 5（R²=0.999 9）。其中Y為吸光值，x為標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（mg/L）。

2.3.2 重復(fù)性評(píng)價(jià) 按優(yōu)化的福林酚法測(cè)定5份海藻液的吸光值，其結(jié)果如表4所示。5份樣液的均值為0.771，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差0.84%，表明優(yōu)化的福林酚法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性評(píng)價(jià) 海藻液在最佳條件下反應(yīng)30 min后，5 h內(nèi)每隔1 h測(cè)定一次吸光值，結(jié)果如表5所示。其體系反應(yīng)30 min后在放置的5 h內(nèi)吸光值較穩(wěn)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差為0.61%，表明優(yōu)化的福林酚法穩(wěn)定性良好。

2.3.4 加標(biāo)回收率 向已知多酚含量的海藻液中分別加入不同質(zhì)量的沒(méi)食子酸，對(duì)加標(biāo)后樣品的總酚含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表6所示。其平均回收率為100.28%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差2.68%，說(shuō)明優(yōu)化的福林酚法測(cè)定海藻多酚含量較為準(zhǔn)確。

2.4 優(yōu)化法和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)茶多酚檢測(cè)法測(cè)定不同藻類中多酚的含量

海藻生長(zhǎng)環(huán)境條件差異大，且種類、發(fā)育階段、采收季節(jié)等都會(huì)影響海藻多酚的種類和含量。采用優(yōu)化法和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)茶多酚檢測(cè)法測(cè)定7種海藻中多酚的含量，測(cè)定結(jié)果如圖3所示。優(yōu)化的福林酚法測(cè)得7種海藻的多酚含量為120.0～273.0? mg/L，且不同藻類的多酚含量從高到低依次為：羊棲菜>馬尾藻>海帶>泡葉藻>面條藻>N藻>F藻，其結(jié)果與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)茶多酚檢測(cè)法相一致。值得一提的是，羊棲菜中海藻多酚的含量顯著高于其他藻類，而海帶、馬尾藻中的多酚含量也較高，均在225.0? mg/L以上。

2.5 外源物質(zhì)對(duì)福林酚法測(cè)定海藻多酚的影響

不同質(zhì)量濃度陽(yáng)離子對(duì)海藻多酚檢測(cè)結(jié)果的影響如圖4A所示。海藻樣品中添加1%或5%的Cu²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺以及5%的Fe³⁺均使吸光值顯著偏高，其中樣品中添加1%和5%的Mn²⁺時(shí)，吸光值比對(duì)照分別增加了97.23%和149.79%；而添加1%或5%的Zn²⁺時(shí)，吸光值顯著低于對(duì)照。樣品中添加1%或5% Ca²⁺以及1 % Fe³⁺對(duì)海藻多酚的檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯影響。

不同質(zhì)量濃度陰離子對(duì)海藻多酚的檢測(cè)結(jié)果的影響如圖4B所示。Cl^-、I^-對(duì)福林酚法測(cè)定多酚影響較大，含Cl^-或I^-時(shí)，吸光值分別比對(duì)照增加了2.31%～3.97%、39.05%～69.77%。與對(duì)照相比，樣品中添加5%的CO^2-₃、NO^-₃、PO^3-₄使吸光值顯著低于對(duì)照，而1%的CO^2-₃、NO^-₃、PO^3-₄對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯影響。此外，與對(duì)照相比，1% F^-使測(cè)定值偏低（P<0.05），而5% F^-使測(cè)定值偏高（P<0.05）。

不同質(zhì)量濃度有機(jī)物對(duì)海藻多酚檢測(cè)結(jié)果的影響如圖4C所示。樣品中添加不同質(zhì)量濃度的蛋白質(zhì)或可溶性淀粉時(shí)，其吸光值分別比對(duì)照增加了45.04%～127.07%、10.61%～19.73%，并且濃度越高，對(duì)其影響越大。而樣品中添加1%或5%的山梨酸鉀、葡萄糖、D-山梨醇時(shí)，其吸光值與對(duì)照均無(wú)顯著差異。

3 討論

3.1 反應(yīng)條件對(duì)福林酚法測(cè)定海藻多酚的影響

在測(cè)定多酚的眾多方法中，福林酚法操作簡(jiǎn)單，重現(xiàn)性好，是目前多酚含量測(cè)定的常用方法。其原理是在堿性溶液中，酚類化合物將鎢鉬酸還原（W⁶⁺變?yōu)閃⁵⁺），生成藍(lán)色的化合物，顏色的深淺與多酚含量成正比^[16]。本研究得到的優(yōu)化福林酚法和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)茶多酚檢測(cè)法在測(cè)定海藻多酚含量雖然結(jié)果基本一致，但兩者在碳酸鈉的使用質(zhì)量濃度上有較大差異。前者用的是3.0%碳酸鈉4.0 ml，后者是7.5%碳酸鈉4.0 ml，這說(shuō)明在福林酚法測(cè)定多酚含量的體系中，碳酸鈉質(zhì)量濃度并不是最重要的影響因素，其主要作用是提供一個(gè)堿性環(huán)境，只有當(dāng)碳酸鈉質(zhì)量濃度超過(guò)一定值時(shí)，其稀釋了體系中藍(lán)色絡(luò)合物，使吸光值降低^[17]。

福林酚與多酚類物質(zhì)的反應(yīng)需一定時(shí)間，升溫可加速反應(yīng)，促進(jìn)有色物質(zhì)生成，縮短反應(yīng)時(shí)間^[18]，但溫度過(guò)高會(huì)破壞多酚類物質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)，且影響有色物質(zhì)的生成^[19]。張婭等^[20]在測(cè)定葡萄酒中多酚含量以及詹莉莉等^[21]在測(cè)定露兜簕果實(shí)中多酚含量時(shí)均發(fā)現(xiàn)，當(dāng)反應(yīng)溫度高于40 ℃時(shí)，吸光值驟降，本試驗(yàn)結(jié)果亦印證了這一觀點(diǎn)。這說(shuō)明高溫可能導(dǎo)致多酚類物質(zhì)降解或反應(yīng)體系生成的藍(lán)色物質(zhì)在高溫下穩(wěn)定性變差。

3.2 有機(jī)物質(zhì)或無(wú)機(jī)離子對(duì)福林酚法測(cè)定海藻多酚的影響

多酚類化合物具有多個(gè)酚基團(tuán)，分子結(jié)構(gòu)獨(dú)特，其結(jié)構(gòu)中的酚羥基有很好的螯合性能，能與金屬離子發(fā)生螯合反應(yīng)，且螯合產(chǎn)物有明顯的色澤變化，進(jìn)而對(duì)多酚含量測(cè)定產(chǎn)生干擾^[22]。本試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了這點(diǎn)，即樣品中添加了Cu²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺、Fe³⁺等金屬離子時(shí)，其吸光值與對(duì)照差異顯著。

福林酚試劑中的磷鉬酸-磷鎢酸鹽易被蛋白質(zhì)中的酪氨酸、色氨酸等殘基還原， 產(chǎn)生藍(lán)色混合物，因此被測(cè)樣品中如果含有蛋白質(zhì)，福林酚法測(cè)定的多酚含量會(huì)有一定偏差^[23]。本研究結(jié)果同樣表明海藻樣品中含蛋白質(zhì)后，其吸光值偏高。此外，趙曉娟等^[24]研究結(jié)果表明山梨酸鉀會(huì)明顯干擾蘋果醋中多酚含量的測(cè)定，而本研究海藻液中含山梨酸鉀時(shí)測(cè)定的吸光值與對(duì)照無(wú)明顯差異。這可能是不同物質(zhì)中多酚的種類及含量不同造成的。有關(guān)可溶性淀粉或陰離子干擾福林酚法測(cè)定海藻液中多酚含量的原因還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

福林酚法測(cè)定海藻多酚的最佳反應(yīng)條件為12%福林酚5 ml、3%碳酸鈉4 ml、溫度37℃、反應(yīng)時(shí)間30 min、吸收波長(zhǎng)730 nm。該條件下測(cè)得的結(jié)果準(zhǔn)確性高，重復(fù)性好，與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)茶多酚測(cè)定法中的反應(yīng)條件10.0%福林酚5 ml、7.5%碳酸鈉4 ml、室溫反應(yīng)60 min、波長(zhǎng)765 nm有一定差異，但兩者均可高效測(cè)定不同藻類中的多酚含量，且測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著差異。海藻樣品中含蛋白質(zhì)、淀粉等有機(jī)物質(zhì)以及1%或5% Cu²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺、Cl^-、I^-等無(wú)機(jī)離子時(shí)，均導(dǎo)致吸光值增加；含1%或5% Zn²⁺以及5% CO^2-₃、NO^-₃、PO^3-₄時(shí)，吸光值顯著降低；山梨酸鉀、葡萄糖、D-山梨醇則對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯影響。

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