劉嘉楠　程金金　孫星　周春麗　閆小龍　耿韌華　王冬蘭　萬群　余向陽

摘要： 施用農(nóng)藥已經(jīng)成為當(dāng)今世界十分盛行的作物保護(hù)手段。研究作物對農(nóng)藥的吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制對促進(jìn)農(nóng)藥吸收、提高農(nóng)藥利用率以及創(chuàng)制新農(nóng)藥提供科學(xué)依據(jù)。本試驗(yàn)以三氟苯嘧啶，氯蟲苯甲酰胺，噻呋酰胺為供試農(nóng)藥，以水稻（Oryza sativa L.）為研究對象，通過室內(nèi)水培結(jié)合抑制劑（水通道抑制劑、離子通道抑制劑、代謝抑制劑、蒸騰抑制劑）分析水稻各組織中農(nóng)藥含量及轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)。結(jié)果表明，3種農(nóng)藥的主要富集器官為根系，TF（轉(zhuǎn)移因子）<1；噻呋酰胺的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)與其質(zhì)量濃度無關(guān)，在1.0 mg/L和10.0 mg/L質(zhì)量濃度處理下沒有顯著差異；在1.0 mg/L質(zhì)量濃度處理下，水稻根系對三氟苯嘧啶的吸收是多通道參與的主動(dòng)過程，對氯蟲苯甲酰胺的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)則是不需要通道蛋白以及載體協(xié)助的過程，對噻呋酰胺的吸收需要能量，可能依賴陰離子通道以及蒸騰作用。

關(guān)鍵詞： 農(nóng)藥；吸收；轉(zhuǎn)運(yùn)；抑制劑；水稻

中圖分類號： S511；S482 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A 文章編號： 1000-4440（2023）01-0053-12

Absorption and transport of three commonly used pesticides in rice

LIU Jia-nan¹， CHENG Jin-jin²， SUN Xing²， ZHOU Chun-li²， YAN Xiao-long²， GENG Ren-hua²， WANG Dong-lan²， WAN Qun²， YU Xiang-yang^1，2

（1.College of Food Science and Engineering， Nanjing University of Finance and Economics/Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety， Nanjing 210023， China；2.Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China）

Abstract： The application of pesticides has become a very popular crop protection method in the world today. Studying the absorption and transport mechanism of pesticides by crops provides a scientific basis for promoting pesticide absorption， improving pesticide utilization， and creating new pesticides. In this experiment， triflumezopyrim， chlorantraniliprole and thifluzamide were used as test pesticides， and rice （Oryza sativa L.） was used as research object. The pesticide content and transport coefficient in various tissues of rice were analyzed by indoor hydroponics combined with inhibitors （water channel inhibitors， ion channel inhibitors， metabolic inhibitors， transpiration inhibitors）. The results showed that the main enrichment organ of the three pesticides was the root， and the transfer factor （TF）<1. The absorption and transport of thifluzamide were not related to its mass concentration， and there was no significant difference between the two treatments at the mass concentration of 1.0 mg/L and 10.0 mg/L. Under the treatment of 1.0 mg/L， the absorption of triflumezopyrim by rice roots was an active process involving multiple channels， while the absorption and transport of chlorantraniliprole is a process without the assistance of channel proteins and carriers. The absorption of thifluzamide required energy and may depend on anion channels and transpiration.

Key words： pesticides；absorption；transport；inhibitor；rice

研究結(jié)果表明，害蟲和病原體對全球水稻、小麥、玉米、土豆造成的損失在17%～30%^[1-2]，從統(tǒng)計(jì)的角度來看，中國的農(nóng)藥使用量幾乎占全球的30%，大量的農(nóng)藥導(dǎo)致作物中的農(nóng)藥殘留逐漸積累，并通過徑流、侵蝕、揮發(fā)等方式影響環(huán)境，通過食物鏈危害人體健康^[3]。盡管農(nóng)藥對人類和其他生物體有潛在的不利影響，但由于其控制病蟲草害和提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力的優(yōu)勢，農(nóng)藥仍被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中^[4]。近年來世界各國對環(huán)境保護(hù)日益重視，農(nóng)藥的不當(dāng)使用對環(huán)境造成的各種危害隨之引起了廣泛關(guān)注。

氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡是判斷污染物對環(huán)境生物是否造成不利影響的重要指標(biāo)。三氟苯嘧啶是防治稻飛虱的優(yōu)良農(nóng)藥，作為一種農(nóng)業(yè)害蟲，小褐飛虱對水稻、玉米、小麥等多種作物造成損失。小褐飛虱不僅直接啃食作物植株本身，更嚴(yán)重的是傳播病毒（水稻黑條矮縮病、水稻條紋病毒）^[4-6]。三氟苯嘧啶作為介離子化合物，對半翅目昆蟲褐飛虱和鱗翅目昆蟲均具有高殺蟲活性，同時(shí)對傳粉的蜜蜂也具有高毒性^[7]，而且對于蚯蚓DNA的損傷表現(xiàn)出生物累積性^[8]。并且長期廣泛使用三氟苯嘧啶還會(huì)導(dǎo)致小褐飛虱對該農(nóng)藥的抗性逐漸增強(qiáng)。氯蟲苯甲酰胺，作為雙酰胺殺蟲劑之一^[9]，為全世界第4大常用殺蟲劑^[10]，主要用于防治鱗翅目和鞘翅目害蟲^[11]，2021年全球銷售額達(dá)到1.8529×10⁹元^[12]。然而氯蟲苯甲酰胺利用效率低，流失比例高，不僅造成環(huán)境污染，還會(huì)對周圍水生生物造成毒害^[13-14]，如對大型水蚤、牡蠣和蝦均具有生殖毒性^[12]，還會(huì)引起蚯蚓，赤眼蜂的氧化應(yīng)激反應(yīng)。最近的研究報(bào)道稱，該農(nóng)藥影響脊椎動(dòng)物雞胚的生長發(fā)育，即使低劑量也會(huì)導(dǎo)致懷孕大鼠的胎兒畸形^[15]。另有試驗(yàn)結(jié)果表明，氯蟲苯甲酰胺會(huì)誘導(dǎo)斑馬魚肝臟細(xì)胞凋亡^[4]。噻呋酰胺，作為廣譜高效殺菌劑^[2]，以防治水稻紋枯病而聞名^[16]，對水生生物（斑馬魚、大型蚤）具有中等毒性^[2，17]。氯蟲苯甲酰胺能夠抑制蚯蚓的生長和繁殖，當(dāng)濃度超過1 mg/kg時(shí)，會(huì)導(dǎo)致蚯蚓的氧化應(yīng)激反應(yīng)^[18]。氯蟲苯甲酰胺還會(huì)影響真菌群落結(jié)構(gòu)，對土壤微生物群落等非目標(biāo)生物造成不利影響，抑制土壤中磷酸酶、過氧化氫酶、脲酶等的活性^[3]，影響生態(tài)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。上述農(nóng)藥殘留已經(jīng)造成了環(huán)境污染、生態(tài)毒性和人類疾病^[19]，造成了非目標(biāo)生物（斑馬魚、蚯蚓、大型水蚤、淡水蝸牛、其他無脊椎動(dòng)物和藻類）的危害^[20-21]以及人類急性和慢性疾?。ㄆつw和眼睛刺激、頭痛、心臟病、免疫系統(tǒng)減弱、內(nèi)分泌紊亂、癌癥、過敏等）^[22-24]。

根系吸收是農(nóng)藥進(jìn)入作物的主要途徑，具體方式有兩種，分別為主動(dòng)吸收和被動(dòng)吸收，兩者的主要區(qū)別在于是否消耗能量。主動(dòng)吸收是由載體介導(dǎo)的能量消耗過程，被動(dòng)吸收包括簡單的擴(kuò)散和需要載體和通道介導(dǎo)的協(xié)助擴(kuò)散，不消耗能量。當(dāng)農(nóng)藥從土壤或水環(huán)境進(jìn)入作物的根系細(xì)胞時(shí)，一部分通過主動(dòng)吸收，一部分則通過被動(dòng)吸收進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。被動(dòng)吸收經(jīng)過的通道主要包括水通道、離子通道。水通道蛋白是一種跨膜通道蛋白，主要用于維持細(xì)胞內(nèi)水平衡。劇毒的Hg²⁺會(huì)使質(zhì)膜生物化學(xué)性質(zhì)遭到破壞，多篇研究報(bào)道稱Hg²⁺通過抑制水通道蛋白可逆地抑制植物細(xì)胞內(nèi)大量水的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)^[25-28]。Ag⁺是比常用的Hg²⁺更有效的水通道蛋白抑制劑，Ag⁺與位于NPA基序附近的半胱氨酸的巰基反應(yīng)，從而達(dá)到抑制水通道蛋白的作用。植物陰離子通道根據(jù)動(dòng)力學(xué)特性可以分為快陰離子通道和慢陰離子通道^[29]，分別以DIDS和9-AC為代表。NPPB是氯離子通道抑制劑，和DIDS、9-AC均作為陰離子通道抑制劑用于驗(yàn)證農(nóng)藥的跨膜吸收轉(zhuǎn)運(yùn)是否通過陰離子通道^[30]。TEAC和Ba²⁺是鉀離子通道抑制劑，其專一性被廣泛研究。CoCl₂、EGTA和CaCl₂為鈣離子通道抑制劑。Na₃VO₄為代謝抑制劑，可以通過抑制質(zhì)膜H⁺-ATP酶活性來抑制根細(xì)胞產(chǎn)生能量^[30]。NaN₃是一種氧化磷酸化抑制劑，主要通過抑制電子傳遞系統(tǒng)和細(xì)胞色素氧化酶活性從而抑制細(xì)胞產(chǎn)生能量^[31-32]。2，4-DNP是一種典型的氧化磷酸化解耦子，能夠抑制線粒體中ATP的生物合成^[33]。

進(jìn)入根系細(xì)胞之后，農(nóng)藥隨著蒸騰流通過木質(zhì)部繼續(xù)向地上部分轉(zhuǎn)運(yùn)^[25]。化學(xué)物質(zhì)由植物根系到莖葉部分是在木質(zhì)部的蒸騰流作用下進(jìn)行傳輸?shù)?，蒸騰作用是化學(xué)物質(zhì)向上輸送的主要驅(qū)動(dòng)力，因此蒸騰流不僅能夠傳輸植物所需的營養(yǎng)物質(zhì)，還能夠傳輸對植株不利的有害物質(zhì)，ABA等植物激素除了參與離子轉(zhuǎn)運(yùn)和調(diào)節(jié)根系生長外，最重要的是會(huì)降低氣孔導(dǎo)度和蒸騰作用，促進(jìn)氣孔關(guān)閉^[34]，因此在試驗(yàn)中可以用于驗(yàn)證蒸騰作用對植株吸收轉(zhuǎn)運(yùn)農(nóng)藥的影響。

三氟苯嘧啶，氯蟲苯甲酰胺，噻呋酰胺作為稻田中常用的拌種農(nóng)藥^[35-36]，具有低成本、高效率、靶標(biāo)性強(qiáng)的特點(diǎn)，常作為種衣劑的主要成分用于防治病蟲害。目前關(guān)于這3種農(nóng)藥的田間防治效果研究較多^[37-38]，但是有關(guān)水稻對這3種農(nóng)藥的吸收機(jī)理的報(bào)道較少。研究水稻對三氟苯嘧啶，氯蟲苯甲酰胺，噻呋酰胺具體的吸收機(jī)理，對于提高農(nóng)藥利用率，降低土壤、水體等環(huán)境污染，走綠色防控路線具有極大的生態(tài)價(jià)值和指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試水稻南粳5055，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所提供。

儀器：Qtrap 5500+高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國AB Sciex公司產(chǎn)品）；Kinetex 2.6 μm F5液相色譜柱，全自動(dòng)樣品快速研磨儀（上海凈信公司產(chǎn)品）。

試劑：三氟苯嘧啶，氯蟲苯甲酰胺，噻呋酰胺原藥，純度96%，上海阿拉丁試劑公司產(chǎn)品；乙腈（色譜純，德國Merck公司產(chǎn)品）；硝酸銀（AgNO₃），氯化汞（HgCl₂），氯化鋇（BaCl₂），氯化鈷（CoCl₂），氯化鈣（CaCl₂），無水硫酸鎂（MgSO₄），N-丙基乙二胺（PSA），上海國藥集團(tuán)產(chǎn)品；9-蒽甲酸（9-AC），4，4′-二硝基二苯乙烯-2，2′-二磺酸（DIDS），5-硝基-2-（3-苯丙胺）苯甲酸（NPPB），四乙基氯化銨（TEAC），乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸（EGTA），釩酸鈉（Na₃VO₄），2，4二硝基苯酚（2，4-DNP），疊氮化鈉（NaN₃），脫落酸（ABA），上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品；水稻營養(yǎng)液干粉，北京酷來搏科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

水稻種子用3%次氯酸鈉溶液消毒5 min，用去離子水完全沖洗表面，然后用75%乙醇消毒5 min，并用去離子水完全沖洗干凈。在去離子水中浸泡24 h后，將種子轉(zhuǎn)運(yùn)到培養(yǎng)皿的濾紙上，在28 ℃黑暗中催芽48 h，并在種子剛剛露白時(shí)播種至96孔黑色水培盒，按比例加入pH為5.6～5.8的水稻營養(yǎng)液，溫室條件設(shè)置為每天30 ℃下光照處理14 h，25 ℃下黑暗處理10 h。生長25 d后，選擇長勢、大小一致的健康幼苗用于之后的水培暴露試驗(yàn)。

1.2.1 農(nóng)藥暴露試驗(yàn) 吸干水稻表面水分后分別放入含不同質(zhì)量濃度、不同農(nóng)藥的50 ml玻璃管中，并用錫紙包裹水稻根部所在的玻璃管表面，以防農(nóng)藥的光解和揮發(fā)。三氟苯嘧啶的處理質(zhì)量濃度為0.2 mg/L、1.0 mg/L；氯蟲苯甲酰胺和噻呋酰胺的處理質(zhì)量濃度均為1.0 mg/L、10.0 mg/L，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，處理時(shí)間分別為2 h、6 h、12 h、24 h、48 h、96 h，同時(shí)設(shè)置不加農(nóng)藥的空白對照組，從0 h開始取水樣。

1.2.2 不同通道抑制劑對農(nóng)藥吸收的影響 處理?xiàng)l件同方法1.2.1，三氟苯嘧啶、氯蟲苯甲酰胺、噻呋酰胺的處理質(zhì)量濃度均為1 mg/L，在加入農(nóng)藥的同時(shí)分別加入不同抑制劑，水通道抑制劑選用1 μmol/L AgNO₃和10 μmol/L HgCl₂；9-AC、DIDS、NPPB作為陰離子通道抑制劑，濃度分別為10 μmol/L、5 μmol/L、5 μmol/L； 20 μmol/L TEAC、1 mmol/L BaCl₂、20 μmol/L CoCl₂、20 μmol/L EGTA、1 mmol/L CaCl₂作為陽離子通道抑制劑；代謝抑制劑選擇0.6 mmol/L Na₃VO₄，0.5 mmol/L 2，4-DNP，0.1 mmol/L NaN₃；10 μmol/L ABA作為蒸騰抑制劑以及添加保護(hù)膜處理（Film）。同時(shí)設(shè)置不含抑制劑只含農(nóng)藥的對照組，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.3 水稻植株中農(nóng)藥含量的測定

1.3.1 樣品提取 在取樣時(shí)間將水稻植株從水培營養(yǎng)液中取出，用去離子水沖洗水稻根部，充分去除表面可能殘留的農(nóng)藥，用吸水紙吸干植株表面的水分，分離根（地下部分）和莖葉（地上部分），分別放入10 ml離心管中，并稱質(zhì)量，-20 ℃冰凍保存。提取時(shí)，加入6 ml乙腈和兩顆直徑6 mm的鋼珠，振蕩研磨20 min，加入1 g NaCl，繼續(xù)振蕩渦旋，以6 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min。吸取上清液1 ml，加入含有200 mg凈化劑（150 mg無水硫酸鎂、25 mg PSA、25 mg C18）的2 ml離心管中，充分渦旋1 min，8 000 r/min離心2 min，上清液經(jīng)過0.2 μm有機(jī)濾膜的過濾倒入進(jìn)樣小瓶中，待檢測。水樣也進(jìn)行同樣的操作，在每個(gè)取樣時(shí)間，吸取1 ml水樣于10 ml離心管中，加入2 ml乙腈渦旋振蕩5 min，加入1 g NaCl繼續(xù)渦旋震蕩5 min，充分振蕩后靜置5 min，吸取1 ml上清液經(jīng)過0.2 μm有機(jī)濾膜的過濾倒入進(jìn)樣小瓶，待檢測。

1.3.2 檢測條件 通過AB-Sciex Exion液相色譜結(jié)合AB-Sceix Qtrap 5500+三重四極質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）進(jìn)行檢測。使用Kinetex柱（F5，2.6 μm，100 cm×30 mm）在30 ℃下實(shí)現(xiàn)色譜分離，進(jìn)樣體積設(shè)置為2 μl，流動(dòng)相為10%甲酸水和90%乙腈，每次樣品運(yùn)行前的平衡時(shí)間為2 min，流速0.3 ml/min，保留時(shí)間5 min。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過IBM SPSSS Statistics 26.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析，利用Microsoft Excel 2019軟件進(jìn)行處理并繪圖，利用Origin 2019軟件進(jìn)行吸收濃度和吸收速率的方程擬合，水稻根部從營養(yǎng)液中富集農(nóng)藥的程度用根部生物富集因子（RCF）表示，莖葉部分富集農(nóng)藥的程度用莖葉部生物富集因子（SCF）表示，由地下部分（根部）向地上部分（莖葉部分）的轉(zhuǎn)運(yùn)能力用轉(zhuǎn)移因子（TF）表示，水稻根系對3種農(nóng)藥的吸收量和吸收速率與吸收時(shí)間之間的關(guān)系采用Elovich方程進(jìn)行擬合，計(jì)算公式如下：

RCF=C_root/C_water

SCF=C_stem+leaf/C_water

TF=C_stem+leaf/C_root

公式中C_root：根中農(nóng)藥濃度，C_stem+leaf：莖葉中農(nóng)藥濃度，C_water：營養(yǎng)液中農(nóng)藥濃度。

C_t= C₀+kln（t/2）

V_t= V₀×e^-kt

公式中C_t為t時(shí)刻水稻根系/莖葉（鮮質(zhì)量）中農(nóng)藥的吸收量（mg/kg）；C₀為初始時(shí)刻的吸收量（mg/kg），t為吸收時(shí)間（h），k表示吸收速率常數(shù)[mg/（kg·h）]。V_t表示t時(shí)間段內(nèi)水稻根系的平均吸收速率[mg/（kg·h）]，V₀表示初始時(shí)刻的吸收速率[mg/（kg·h）]。

1.5 方法驗(yàn)證

在水稻根、莖葉、營養(yǎng)液中分別加入三氟苯嘧啶、氯蟲苯甲酰胺、噻呋酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加水平為0.05 mg/kg、0.10 mg/kg和1.00 mg/kg，每個(gè)處理5次重復(fù)。結(jié)果顯示3種農(nóng)藥的平均回收率為83%～97%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.85%～4.40%，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的決定系數(shù)均大于0.990，符合農(nóng)藥殘留分析的要求。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻對農(nóng)藥的吸收積累

在每個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)，與對照組相比水稻沒有受到明顯的藥害作用，水稻根系和莖葉中農(nóng)藥含量隨時(shí)間的變化趨勢見圖1，三氟苯嘧啶、氯蟲苯甲酰胺、噻呋酰胺在地下部分和地上部分的積累均符合一級動(dòng)力學(xué)方程。處理農(nóng)藥為三氟苯嘧啶時(shí)， 0.2 mg/L質(zhì)量濃度下，水稻根系在0～2 h快速吸收三氟苯嘧啶，在2～48 h內(nèi)緩慢吸收三氟苯嘧啶，并逐漸達(dá)到平穩(wěn)狀態(tài)，最終根系中三氟苯嘧啶含量維持在0.95 mg/kg； 1.0 mg/L質(zhì)量濃度下，根系中三氟苯嘧啶含量在前2 h內(nèi)快速升高，在6 h達(dá)到吸收峰值（2.47 mg/kg），后開始呈下降趨勢，逐漸達(dá)到平穩(wěn)狀態(tài)并最終含量保持在2.30 mg/kg，莖葉中三氟苯嘧啶富集呈現(xiàn)持續(xù)緩慢上升的趨勢（圖1A、圖1B）。處理農(nóng)藥為氯蟲苯甲酰胺時(shí)，1.0 mg/L 和10.0 mg/L質(zhì)量濃度下，富集趨勢相同，其中根系中的氯蟲苯甲酰胺含量在前2 h快速升高，分別達(dá)到5.40 mg/kg和26.50 mg/kg，在2～12 h快速下降，24 h之后達(dá)到平穩(wěn)狀態(tài)，最終含量分別維持在3.80 mg/kg和14.80 mg/kg；莖葉中氯蟲苯甲酰胺含量在0～2 h快速升高，之后小幅度下降后保持平穩(wěn)，最終含量分別維持在2.40 mg/kg和12.60 mg/kg （圖1C、圖1D）。處理農(nóng)藥為噻呋酰胺時(shí)， 1.0 mg/L 和10.0 mg/L質(zhì)量濃度處理下，根系吸收峰值也均在2 h出現(xiàn)，最高含量分別為0.59 mg/kg和4.05 mg/kg；莖葉中富集量都在48 h達(dá)到最大值，分別為0.26 mg/kg和2.59 mg/kg，之后保持平穩(wěn)狀態(tài)（圖1E、圖1F）。

為進(jìn)一步探討水稻對3種農(nóng)藥在處理時(shí)間96 h內(nèi)的吸收速率與吸收時(shí)間的關(guān)系，擬合吸收速率曲線如圖2所示，在三氟苯嘧啶處理下，質(zhì)量濃度為0.2 mg/L 和1.0 mg/L時(shí)，根系在0～2 h內(nèi)吸收速率快速升高，峰值分別達(dá)到0.34 mg/（kg·h）和1.17 mg/（kg·h），在2～6 h吸收速率下降較快，在6～48 h下降幅度較緩，在48～96 h吸收速率接近0，在第6 h的吸收速率分別是第2 h的40.4%和35.1%，在第48 h的吸收速率分別是第2 h的6%和4%（圖2A、圖2B）。在氯蟲苯甲酰胺處理下，質(zhì)量濃度為1.0 mg/L 和10.0 mg/L時(shí)，根系和莖葉均在0～2 h內(nèi)吸收速率快速升高，根系吸收速率分別達(dá)到1.34 mg/（kg·h） 和6.62 mg/（kg·h），莖葉吸收速率分別達(dá)到0.26 mg/（kg·h）和1.17 mg/（kg·h）；在6～48 h吸收速率減慢，48～96 h保持接近0的狀態(tài) （圖2C、圖2D）。噻呋酰胺在1.0 mg/L 和10.0 mg/L質(zhì)量濃度下，根系在0～2 h的吸收速率最高分別達(dá)到0.15 mg/（kg·h） 和1.02 mg/（kg·h），之后吸收速率逐漸下降，最后保持接近0的狀態(tài)，莖葉吸收速率始終保持接近0的平穩(wěn)狀態(tài)（圖2E、圖2F）。從圖2中水稻根系對3種農(nóng)藥的吸收速率曲線可以看出，水稻根系對3種農(nóng)藥的吸收速率均呈現(xiàn)前2 h快速升高后又快速下降然后呈現(xiàn)平穩(wěn)接近0的趨勢；同時(shí)對比同種農(nóng)藥的不同質(zhì)量濃度處理下，擬合的吸收速率曲線趨勢吻合，說明吸收速率與農(nóng)藥的質(zhì)量濃度無關(guān)。對比水稻根系和莖葉對3種農(nóng)藥的吸收速率可以看出，根是主要農(nóng)藥富集器官，水稻將農(nóng)藥向莖葉部分轉(zhuǎn)運(yùn)的能力較差。

2.2 農(nóng)藥在水稻植株中的轉(zhuǎn)運(yùn)規(guī)律

由圖3A所示，三氟苯嘧啶處理下，質(zhì)量濃度為0.2 mg/L時(shí)，轉(zhuǎn)移因子隨時(shí)間緩慢升高；質(zhì)量濃度為1.0 mg/L時(shí)，轉(zhuǎn)移因子快速升高，在0～96 h的處理時(shí)間內(nèi)，TF<1；由圖3B所示，氯蟲苯甲酰胺處理下，質(zhì)量濃度為1.0 mg/L時(shí)，轉(zhuǎn)移因子先快速升高，24 h后達(dá)到平穩(wěn)的趨勢；質(zhì)量濃度為10.0 mg/L時(shí)，0～48 h快速升高達(dá)到峰值后下降；由圖3C所示，噻呋酰胺處理下，質(zhì)量濃度為1.0 mg/L和10.0 mg/L時(shí)，兩種質(zhì)量濃度下水稻的轉(zhuǎn)移因子趨勢吻合，0～48 h快速升高，48～96 h趨于平穩(wěn)。水稻分別在不同質(zhì)量濃度的三氟苯嘧啶、氯蟲苯甲酰胺、噻呋酰胺處理下，TF<1，再次印證了之前的結(jié)論：三氟苯嘧啶、氯蟲苯甲酰胺、噻呋酰胺主要富集在水稻的根系，水稻將其由地下部分向地上部分的轉(zhuǎn)運(yùn)能力較差。噻呋酰胺處理下，1.0 mg/L和10.0 mg/L兩種質(zhì)量濃度下水稻轉(zhuǎn)移因子趨勢重合，說明噻呋酰胺在水稻植株中的轉(zhuǎn)運(yùn)與其質(zhì)量濃度無關(guān)。

2.3 抑制劑對水稻吸收農(nóng)藥的影響

為了研究水稻對三氟苯嘧啶、氯蟲苯甲酰胺、噻呋酰胺的吸收機(jī)制，我們利用多種水通道蛋白抑制劑、陰離子通道抑制劑、陽離子通道抑制劑、代謝抑制劑、蒸騰抑制劑進(jìn)行區(qū)分，多種抑制劑對于水稻吸收轉(zhuǎn)運(yùn)農(nóng)藥的抑制情況在圖4～圖6中顯示。

2.3.1 抑制劑對水稻吸收三氟苯嘧啶的影響 多種抑制劑對水稻吸收轉(zhuǎn)運(yùn)三氟苯嘧啶的影響如圖4所示。水通道蛋白抑制劑：在添加AgNO₃的三氟苯嘧啶水稻營養(yǎng)液中培養(yǎng)水稻48 h，與沒有添加抑制劑的對照相比，根系中的農(nóng)藥含量降低了28%，莖葉中農(nóng)藥含量下降了53%，由根系向莖葉中的轉(zhuǎn)運(yùn)抑制率達(dá)到34%；添加HgCl₂的處理與對照相比，水稻根系中農(nóng)藥含量僅降低了18%，莖葉中農(nóng)藥含量降低了34 %，HgCl₂對三氟苯嘧啶轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制作用達(dá)到20%。

陰離子通道抑制劑：在分別添加9-AC、DIDS、NPPB的三氟苯嘧啶水稻營養(yǎng)液處理中，水稻根系對三氟苯嘧啶的吸收分別降低了22%、10%、19%，莖葉中三氟苯嘧啶含量顯著降低了34%、54%、53%，三氟苯嘧啶地下部分向地上部分的轉(zhuǎn)運(yùn)抑制率分別達(dá)到15%、49%、41%。說明陰離子通道抑制劑部分抑制水稻對三氟苯嘧啶的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)。

陽離子通道抑制劑：三氟苯嘧啶作為介離子農(nóng)藥，分子結(jié)構(gòu)中同時(shí)包含陰離子和陽離子。通過添加陽離子抑制劑驗(yàn)證水稻對該農(nóng)藥的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)中陽離子通道的作用，在分別添加TEAC、BaCl₂、CoCl₂、EGTA、CaCl₂的處理中，根系對三氟苯嘧啶的吸收分別降低了27%、28%、25%、24%、-24%，莖葉中對農(nóng)藥的積累降低了45%、21%、26%、7%、29%，對三氟苯嘧啶轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制率達(dá)到29%、-13%、2%、-24%、43%。結(jié)果表明部分鉀離子和鈣離子通道抑制劑抑制了水稻對三氟苯嘧啶的吸收，部分陽離子通道是農(nóng)藥進(jìn)入根系的通道之一，CaCl₂反而促進(jìn)了根系對三氟苯嘧啶的吸收，但是抑制了其向上轉(zhuǎn)運(yùn)的能力。

代謝抑制劑：Na₃VO₄，2，4-DNP，NaN₃，分別對根系三氟苯嘧啶吸收抑制率達(dá)到11%、35%、42%，莖葉中三氟苯嘧啶含量分別下降43%、24%、38%，對三氟苯嘧啶根系向莖葉轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制率達(dá)到34%、-19%、-6%。表明三氟苯嘧啶的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)部分依賴能量。

蒸騰抑制劑：分別采用手動(dòng)添加保鮮膜制造黑暗場景和添加ABA抑制水稻蒸騰作用2種方式驗(yàn)證蒸騰作用對水稻吸收轉(zhuǎn)運(yùn)農(nóng)藥的影響，2種方式分別對根系三氟苯嘧啶吸收抑制率達(dá)到45%、26%，莖葉中三氟苯嘧啶含量分別下降了35%和21%，但2種方式對三氟苯嘧啶轉(zhuǎn)運(yùn)沒有明顯抑制作用。

2.3.2 抑制劑對水稻吸收氯蟲苯甲酰胺的影響 圖5顯示，分別添加不同的水通道蛋白抑制劑和陰離子通道抑制劑的試驗(yàn)組與對照相比，沒有顯著差異，說明氯蟲苯甲酰胺在水稻根系中富集以及向莖葉中的轉(zhuǎn)運(yùn)不依賴水通道蛋白和陰離子通道。在添加代謝抑制劑Na₃VO₄、2，4-DNP、NaN₃后，氯蟲苯甲酰胺在根系中富集量提升，分別達(dá)43%、37%、139%，代謝抑制劑對于莖葉中農(nóng)藥的富集量則沒有顯著影響，氯蟲苯甲酰胺由地下部分向地上部分的轉(zhuǎn)運(yùn)則分別被抑制了28%、29%、58%，表明代謝抑制劑提升了氯蟲苯甲酰胺在根系中富集，抑制其向上轉(zhuǎn)運(yùn)。

由添加保鮮膜和添加蒸騰抑制劑ABA處理中發(fā)現(xiàn)，根系氯蟲苯甲酰胺的富集量分別顯著提高了110%和32%，兩種處理對氯蟲苯甲酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制率分別為67%和27%，表明蒸騰作用被抑制后，農(nóng)藥跟隨水分及營養(yǎng)物質(zhì)沿蒸騰流向上傳輸大幅度削減，說明蒸騰作用是影響氯蟲苯甲酰胺從水稻根系向莖葉轉(zhuǎn)運(yùn)的重要因素之一。

2.3.3 抑制劑對水稻吸收噻呋酰胺的影響 如圖6所示，添加水通道蛋白抑制劑AgNO₃對水稻根系和莖葉中噻呋酰胺的富集沒有顯著影響，但是噻呋酰胺由地下部分向地上部分的轉(zhuǎn)運(yùn)提高了31%，HgCl₂對噻呋酰胺的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)沒有顯著的抑制作用。在添加陰離子通道抑制劑9-AC、DIDS、NPPB后，根系對噻呋酰胺的吸收分別被抑制了55%、29%、39%，陰離子通道抑制劑促進(jìn)噻呋酰胺由根系向莖葉中的轉(zhuǎn)運(yùn)，分別提高了50%、112%、96%。

代謝抑制劑Na₃VO₄、2，4-DNP、NaN₃對根系富集噻呋酰胺的抑制率分別為31%、43%、50%，對莖葉的富集抑制率達(dá)到-21%、13%、34%，對噻呋酰胺由地下部分向地上部分的轉(zhuǎn)運(yùn)分別提高了81%、54%、34%，說明噻呋酰胺的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)依賴能量，是一個(gè)主動(dòng)吸收的過程。

保鮮膜處理抑制了水稻根系對噻呋酰胺的吸收，抑制率為62%，對莖葉中累積抑制率為13%，噻呋酰胺由根系向莖葉中的轉(zhuǎn)運(yùn)提高了120%；ABA對水稻根系噻呋酰胺的富集抑制了60%，對于莖葉中噻呋酰胺的富集提高了18%，由根系向莖葉的轉(zhuǎn)運(yùn)提高了193%。

3 討論

在本研究中，三氟苯嘧啶、氯蟲苯甲酰胺、噻呋酰胺均可以被水稻根系吸收且部分向地上部莖葉轉(zhuǎn)運(yùn)。在相同農(nóng)藥不同質(zhì)量濃度處理下，根系和莖葉中累積量隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)趨勢沒有顯著差異，說明水稻對這3種農(nóng)藥的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)可能與農(nóng)藥的質(zhì)量濃度無關(guān)，而與農(nóng)藥的類別有關(guān)。水稻對不同農(nóng)藥的富集趨勢不同，但均在前2 h根系中累積量快速升高，這可能是由于前期水稻從營養(yǎng)液中快速吸收，后期逐漸趨于飽和達(dá)到平穩(wěn)狀態(tài)的結(jié)果。Liu等^[39]關(guān)于小麥中11種農(nóng)藥的吸收動(dòng)力學(xué)研究中也發(fā)現(xiàn)相似的吸收動(dòng)態(tài)趨勢，小麥分別在含有樂果、噻唑膦有機(jī)磷農(nóng)藥、抗蚜威氨基甲酸酯類殺蟲劑、阿特拉津三嗪類除草劑、三唑酮、戊唑醇?xì)⒕鷦┑臓I養(yǎng)液中暴露144 h，在96 h均達(dá)到吸收平衡，氟硅唑和苯醚甲環(huán)唑在48 h就達(dá)到吸收動(dòng)態(tài)平衡，之后保持平穩(wěn)狀態(tài)；Ju等^[40]關(guān)于小麥中6種農(nóng)藥吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的試驗(yàn)中同樣得到在6～24 h小麥根系中農(nóng)藥含量快速升高，后期有所下降并維持在一個(gè)穩(wěn)定水平，達(dá)到穩(wěn)定的時(shí)間不同可能是由于農(nóng)藥的類別不同以及植物不同造成的。Yu等^[31]研究小白菜對抗生素的吸收，發(fā)現(xiàn)在抗生素處理后72 h內(nèi)并沒有達(dá)到吸收平衡；張碩佳等^[36]在水稻暴露在噻呋酰胺試驗(yàn)中也得到相似結(jié)果，水稻前期快速吸收噻呋酰胺后，達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，三氟苯嘧啶、氯蟲苯甲酰胺、噻呋酰胺這3種農(nóng)藥的主要富集器官為根系，TF<1，說明向上轉(zhuǎn)運(yùn)的能力較差，F(xiàn)an等^[41]在玉米中關(guān)于氯蟲苯甲酰胺的研究也得到相似的結(jié)果，根為其主要富集器官；張碩佳等^[36]關(guān)于水稻對多種殺菌劑的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)性能的研究發(fā)現(xiàn)，水稻地下部分噻呋酰胺的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于地上部分，TF<1，說明根系吸收的農(nóng)藥只有部分可以向上轉(zhuǎn)運(yùn)，在營養(yǎng)液和營養(yǎng)土的不同培養(yǎng)條件下也得到相似的結(jié)果。

利用通道抑制劑驗(yàn)證植物對農(nóng)藥的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)所依賴的通道是學(xué)者常采用的研究手段，然而不同的植物可能有不同的吸收路徑，同種類型的農(nóng)藥在被植物吸收時(shí)的路徑也可能不同。Zhang等^[42]利用汞離子抑制水通道蛋白活性的研究中發(fā)現(xiàn)，玉米對抗生素的吸收受水通道蛋白的影響。汞離子通過共價(jià)修飾水通道蛋白的其他區(qū)域的晶體殘基，造成水通道阻塞，從而抑制紫花苜蓿對水以及土霉素的吸收，由于汞離子自身的毒性作用，用同樣為水通道蛋白抑制劑的銀離子和甘油進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)土霉素的吸收與水通道無關(guān)^[43]。由此得出在驗(yàn)證水通道在作物吸收轉(zhuǎn)運(yùn)農(nóng)藥的過程中，銀離子比汞離子更有說服力，同時(shí)采用多種水通道抑制劑進(jìn)行驗(yàn)證也更有說服力。植物中的水通道和陰離子通道是一種膜蛋白，可以根據(jù)膜蛋白上的孔和電荷來運(yùn)輸水和陰離子，由于PFHxPA（全氟己基磷酸）相對分子質(zhì)量小，親水性中等（1ow<4），因此可以利用這些通道來運(yùn)輸^[33]。在本研究中三氟苯嘧啶的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)受到硝酸銀的抑制，氯蟲苯甲酰胺的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)則與水通道蛋白無關(guān)；噻呋酰胺的吸收與水通道蛋白沒有顯著關(guān)聯(lián)，但是轉(zhuǎn)運(yùn)卻由于硝酸銀的抑制而提升，說明水通道對于噻呋酰胺的轉(zhuǎn)運(yùn)提供了幫助。

9-AC、DIDS被廣泛用于驗(yàn)證植物吸收轉(zhuǎn)運(yùn)是否經(jīng)過陰離子通道。在濕地植物澤瀉中，陰離子通道抑制劑9-AC對PFOS（全氟辛烷磺酸）的抑制率達(dá)11.1%，DIDS對PFOA（全氟辛酸）的抑制率達(dá)16.4%，NPPB對PFOS和PFOA的抑制率分別為27.6%和23.9%^[24]。DIDS和9-AC被用來驗(yàn)證大白菜對DNBP的吸收，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該過程不涉及陰離子通道，DIDS和9-AC對DEHP的吸收抑率分別為13.4%～15.5%和4.0%～9.5%，該研究結(jié)果表明，DEHP的吸收可能與水通道蛋白無關(guān)^[44]。在本研究中，水稻對三氟苯嘧啶的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)受到陰離子通道抑制劑9-AC的顯著抑制，轉(zhuǎn)運(yùn)也受到離子通道抑制劑DIDS和NPPB的顯著抑制；水稻對氯蟲苯甲酰胺的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)則完全不受陰離子通道抑制劑的影響。陰離子通道抑制劑對噻呋酰胺的影響則是抑制其被水稻吸收，但是卻促進(jìn)了其轉(zhuǎn)運(yùn)。

三氟苯嘧啶是同時(shí)含有陰離子和陽離子的介離子型農(nóng)藥，不同于其他兩種農(nóng)藥，在吸收轉(zhuǎn)運(yùn)過程中可能涉及陽離子通道的參與，比如鉀離子通道、鈣離子通道，很多研究者也利用陽離子通道抑制劑進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。作為鉀離子通道抑制劑，TEAC和Ba²⁺均顯著抑制了鉀離子的內(nèi)流，凌桂芝等^[45]發(fā)現(xiàn)添加TEAC后黑麥根尖中鉀離子含量顯著下降。鈣離子對于花粉的萌發(fā)是必要元素，利用鈣離子通道抑制劑EGTA處理花粉，發(fā)現(xiàn)顯著抑制了花粉的萌發(fā)^[46]，推測這是由于鈣離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部需要通過鈣離子通道。在本研究中，水稻對三氟苯嘧啶的吸收受部分陽離子通道尤其是K⁺通道的影響。

Ju等^[32]在研究小麥植株對吡蟲啉的吸收試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)添加NaN₃后，吡蟲啉的根系吸收沒有受到抑制，反而增加了30% ，說明根系吸收吡蟲啉不存在能量依賴性。代謝抑制劑2，4-DNP顯著抑制了紫花苜蓿根系對土霉素的吸收，這是因?yàn)橥撩顾剡M(jìn)入紫花苜蓿根系是一個(gè)能量依賴過程，需要選擇性結(jié)合位點(diǎn)^[43]。小白菜根系對雙性化合物四環(huán)素的吸收是依賴水通道蛋白和能量的主動(dòng)吸收，抗生素進(jìn)入小白菜根系細(xì)胞后經(jīng)過木質(zhì)部導(dǎo)管和水一起進(jìn)入嫩枝，可能受水通道蛋白活性和蒸騰作用的影響^[31]。玉米和苜蓿對抗生素的吸收都是主動(dòng)吸收，需要水通道蛋白的參與。這可能是由于不同作物對相同農(nóng)藥的吸收存在不同的路徑造成的。在本研究中，同樣作為介離子化合物的三氟苯嘧啶，根系細(xì)胞吸收和向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)需要能量的支持，說明主動(dòng)吸收和蒸騰拉力起到作用，氯蟲苯甲酰胺和噻呋酰胺的轉(zhuǎn)運(yùn)也都同樣需要能量。

蒸騰抑制劑ABA顯著抑制了氯蟲苯甲酰胺在玉米中的轉(zhuǎn)運(yùn)，說明蒸騰作用促進(jìn)了氯蟲苯甲酰胺的頂端轉(zhuǎn)運(yùn)^[41]，而在該研究中，蒸騰抑制劑ABA顯著抑制了氯蟲苯甲酰胺在水稻中的向上轉(zhuǎn)運(yùn)。對三氯苯嘧啶的向上轉(zhuǎn)運(yùn)沒有作用，反而促進(jìn)了噻呋酰胺的向上轉(zhuǎn)運(yùn)。說明氯蟲苯甲酰胺的向上轉(zhuǎn)運(yùn)依靠蒸騰拉力的作用，而三氟苯嘧啶和噻呋酰胺的向上轉(zhuǎn)運(yùn)可能不受蒸騰拉力的作用。

本研究中，水通道、陰離子通道、陽離子通道均參與了三氟苯嘧啶的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)，根系跨膜吸收三氟苯嘧啶需要能量的支持，是一個(gè)主動(dòng)吸收的過程，降低蒸騰速率可以顯著減緩農(nóng)藥進(jìn)入根系的速率，根系中吸收的農(nóng)藥不能隨蒸騰流向上傳輸，吸收速率受到抑制，從而導(dǎo)致莖葉中農(nóng)藥的積累也受到抑制。氯蟲苯甲酰胺的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)過程不需要水通道、陰離子通道的協(xié)助，蒸騰拉力是農(nóng)藥隨蒸騰流向上轉(zhuǎn)運(yùn)的驅(qū)動(dòng)力，噻呋酰胺的吸收是一個(gè)需要陰離子通道的主動(dòng)吸收過程?？傊?，三氟苯嘧啶在水稻中的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)是一個(gè)多通道相結(jié)合的主動(dòng)吸收過程，氯蟲苯甲酰胺的吸收不需要通道蛋白以及載體協(xié)助，但向上轉(zhuǎn)運(yùn)需要耗能以及蒸騰拉力的驅(qū)動(dòng)。

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（責(zé)任編輯：成紓寒）