馮傳欣 鄒永毅 陽彥 劉艷秋*

（江西省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心江西省出生缺陷防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌，330006）

母體血漿中胎兒游離DNA（cell-free fetal DNA，cff DNA）的發(fā)現(xiàn)以及高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，使得胎兒染色體異常的無創(chuàng)檢測(cè)成為可能［1］，這種方法被稱為無創(chuàng)產(chǎn)前篩查（non-invasive prenatal screening，NIPS）。目前NIPS已經(jīng)廣泛應(yīng)用于胎兒染色體非整倍體的篩查，對(duì)三種常見非整倍體21三體（T21）、18三體（T18）和13三體（T13）的檢出率分別為99%、96%和91%，總體假陽性率小于1%［2］。cff DNA主要來源于胎盤成熟和衰老過程中滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡或壞死。在孕5周時(shí)便可在母體血漿中檢測(cè)到cffDNA，其含量隨著孕周的增加而增加。cff DNA濃度是指母體血漿中胎兒游離DNA占總的游離DNA的比例，在孕10～20周之間約為10%～15%［3，4］。cffDNA濃度低（＜4%）會(huì)因?yàn)橄鄬?duì)高濃度的母體游離DNA而影響NIPS結(jié)果的準(zhǔn)確性，導(dǎo)致檢測(cè)失敗。Gil等［5］統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)由cffDNA濃度低導(dǎo)致的NIPS檢測(cè)失敗率為0.1%～6.1%。多種因素會(huì)影響cffDNA濃度，如胎盤的大小和功能、孕婦體重和孕周［6］。到目前為止已有大量研究對(duì)cffDNA濃度影響因素進(jìn)行了分析，但尚未達(dá)成廣泛的共識(shí)。因此，有必要對(duì)影響cffDNA濃度的相關(guān)因素進(jìn)行分析總結(jié)。此外，cffDNA主要來源于胎盤，cffDNA濃度低可能反映了較小的胎盤質(zhì)量以及胎盤功能障礙。有研究發(fā)現(xiàn)cffDNA濃度異常變化可能預(yù)示不良妊娠結(jié)局，例如妊娠高血壓、子癇前期、胎兒生長(zhǎng)受限、早產(chǎn)等［7，8］。探討cffDNA濃度與不良妊娠結(jié)局的關(guān)系，對(duì)妊娠并發(fā)癥的早期篩查具有潛在意義。本文旨在分析總結(jié)cff DNA濃度低相關(guān)因素及其對(duì)不良妊娠結(jié)局的影響。

1 影響cffDNA濃度的因素

NIPS檢測(cè)中來自母體的游離DNA片段和來自胎兒的游離DNA片段無法被真正分離，了解cffDNA濃度才能準(zhǔn)確判讀結(jié)果，因此cff DNA濃度是分析NIPS結(jié)果的一個(gè)重要參數(shù)。cffDNA濃度存在很大的個(gè)體間差異，任何影響游離DNA來源的因素都可能影響cffDNA濃度。不同的因素對(duì)cffDNA濃度的影響不一樣，例如cffDNA濃度隨孕周增加而增加，隨母親體重增加而降低［6］。目前已知一些母體因素和胎兒胎盤因素會(huì)影響cffDNA濃度。

1.1 母體因素 孕婦體重或體重指數(shù)（BMI）是影響cff DNA濃度的重要因素。大量研究發(fā)現(xiàn)cffDNA濃度與孕婦體重或體重指數(shù)（BMI）之間呈負(fù)相關(guān)。Ashoor等［9］發(fā)現(xiàn)cffDNA濃度的平均值從孕婦體重60kg時(shí)的12%下降到120kg時(shí)的6%，表明cff DNA濃度隨著孕婦體重的增加而下降。Hou等［10］研究顯示與＜18.5kg／m2組（14.54%）相比，18.5～24.9kg／m2組（13.37%）、25～29.9kg／m2組（12.20%）、30～34.9kg／m2組（11.32%）和35～39.9kg／m2組（11.57%）的cffDNA濃度顯著降低（P＜0.01），cffDNA濃度隨著孕婦BMI的增加而下降，這與另一項(xiàng)回顧性研究［11］結(jié)果一致。其原因可能是孕婦體重增大導(dǎo)致血容量增加，從而稀釋了血漿中cffDNA。此外，肥胖孕婦的脂肪組織通過脂肪細(xì)胞壞死或基底層的血管組織凋亡進(jìn)行活躍的脂肪重建增加了血漿中母體來源的游離DNA，導(dǎo)致cff DNA濃度降低［12］。鑒于孕婦體重或BMI對(duì)cff DNA濃度的影響，我國(guó)孕婦外周血游離DNA產(chǎn)前篩查與診斷技術(shù)規(guī)范將重度肥胖（BMI＞40kg／m2）孕婦列入慎用人群。

孕婦年齡是否影響cffDNA濃度目前還存在爭(zhēng)議。Hou等［10］通過分析統(tǒng)計(jì)不同年齡組孕婦的cff DNA的濃度，發(fā)現(xiàn)cffDNA濃度隨孕婦年齡的增加而降低。Guo［13］等也發(fā)現(xiàn)cffDNA濃度與孕婦年齡之間存在負(fù)相關(guān)。可能的原因是孕婦隨著年齡的增加生理機(jī)制也有很大變化，如體重增加、細(xì)胞凋亡增加等，導(dǎo)致cffDNA濃度降低。然而，也有研究表明cffDNA濃度與孕婦年齡之間沒有相關(guān)性［14］。因此，孕婦年齡對(duì)cffDNA濃度的影響尚未達(dá)成共識(shí)，還需要更多的數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

Gr?mminger等［15］首先報(bào)道了使用低分子肝素（LMWH）與NIPS檢測(cè)失敗之間關(guān)系，通過回顧12例檢測(cè)失敗孕婦的用藥史發(fā)現(xiàn)其中9例正在接受低分子肝素治療。Burns等研究發(fā)現(xiàn)［16］cffDNA濃度低導(dǎo)致的NIPS檢測(cè)失敗與孕婦使用低分子肝素或依諾肝素有關(guān)。肝素可以通過減少細(xì)胞角蛋白新表位、核小體DNA形成以及E-鈣粘蛋白表達(dá)等機(jī)制來減少滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡并提高滋養(yǎng)層細(xì)胞存活［17，18］。因此，抑制胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡可能是肝素導(dǎo)致cffDNA濃度下降的機(jī)制。此外，其他一些藥物的使用也可能影響cffDNA濃度。Maggie等［19］發(fā)現(xiàn)服用二甲雙胍會(huì)導(dǎo)致cffDNA濃度降低，服用兩種或兩種以上藥物組的cffDNA濃度明顯低于未服用任何藥物組。Joshua等［20］發(fā)現(xiàn)低劑量阿司匹林的使用會(huì)增加NIPS檢測(cè)失敗率，但是阿司匹林的影響小于肝素。然而，一項(xiàng)納入9867例單胎妊娠孕婦的研究［21］表明肝素治療對(duì)NIPS檢測(cè)沒有影響，自身免疫性疾病才是檢測(cè)失敗的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。Hui［22］等報(bào)道了一名患有嚴(yán)重自身免疫性血小板減少癥及自身免疫性中性粒細(xì)胞減少癥的孕婦由于cffDNA濃度低導(dǎo)致多次NIPS檢測(cè)失敗。Chan等［23］對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血漿DNA生物學(xué)特征分析發(fā)現(xiàn)了大量的血漿DNA異常，這些異常血漿DNA可能會(huì)干擾cffDNA，從而影響NIPS的檢出率。此外，其他的母體疾病，如嚴(yán)重的β-血紅蛋白病，也會(huì)引起cffDNA濃度低從而導(dǎo)致檢測(cè)失敗［24］。

輔助生殖妊娠也可能影響cffDNA濃度。一項(xiàng)包含自然妊娠和體外受精（IVF）妊娠的回顧性研究［25］發(fā)現(xiàn)IVF妊娠cffDNA濃度中位數(shù)顯著低于自然妊娠，這與Chen［26］等的結(jié)果一致?？赡茉虬ǎ孩買VF妊娠過程中的激素治療或胎盤受損可能影響了cffDNA的產(chǎn)生［25］；②IVF妊娠孕婦炎癥和內(nèi)皮損傷的增加使得母體來源的游離DNA增加導(dǎo)致cffDNA濃度相對(duì)降低［27］。然而，也有研究發(fā)現(xiàn)不一致的結(jié)果，IVF妊娠和自然妊娠表現(xiàn)出相似水平的游離DNA，兩組之間的cffDNA濃度沒有顯著差異［28，29］。輔助生殖妊娠對(duì)cffDNA濃度的影響仍需進(jìn)一步分析。

1.2 胎兒胎盤因素 采血時(shí)的孕周與cffDNA濃度呈正相關(guān)。Wang等［6］研究表明cffDNA濃度與孕周成正比，cffDNA濃度從孕10周至21周總共增加了1%，而孕21周后每周增加1%。Kinnings等［30］也發(fā)現(xiàn)cffDNA濃度在孕12.5～20周期間每周增加0.083%，而在孕20周后每周增加0.821%，表明cffDNA濃度隨孕周增加而增加，且增加的幅度在不同孕周有所不同。以上研究均表明孕周與cffDNA濃度呈強(qiáng)正相關(guān)，可能的原因是隨著孕周的增加胎盤體積也逐漸增大，凋亡的滋養(yǎng)層細(xì)胞增多，因此更多的胎兒游離DNA片段釋放到孕婦血漿中，導(dǎo)致cffDNA濃度增加。

隨著促排卵藥物以及輔助生殖技術(shù)的應(yīng)用，雙胎妊娠比例逐漸增高。研究顯示雙胎妊娠NIPS檢測(cè)失敗率高于單胎妊娠［31］。Gil等［32］研究發(fā)現(xiàn)雙胎妊娠cffDNA濃度中位數(shù)低于單胎妊娠，可能是導(dǎo)致雙胎妊娠孕婦檢測(cè)失敗率更高的原因之一。Hedriana等［33］研究表明雙胎妊娠總cffDNA濃度比單胎妊娠高32%，其中雙絨毛膜妊娠和單絨毛膜妊娠總cff DNA濃度分別比單胎高35%和26%，但是雙絨毛膜妊娠中每個(gè)胎兒的cffDNA濃度平均比單胎低32%。雙絨毛膜妊娠每個(gè)胎兒釋放到母體循環(huán)中的cffDNA數(shù)量不同，其差異可能接近兩倍［34］。NIPS在雙胎妊娠中篩查時(shí)為了避免假陰性結(jié)果，會(huì)選擇雙胎中cffDNA濃度較低的一個(gè)而不是總的cffDNA進(jìn)行非整倍體風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估［35］。因此，雙絨毛膜妊娠在NIPS檢測(cè)中更容易檢測(cè)失敗。

研究發(fā)現(xiàn)NIPS檢測(cè)失敗與細(xì)胞遺傳學(xué)異常風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)［36］。Norton等［37］研究發(fā)現(xiàn)NIPS檢測(cè)失?。╟ffDNA濃度低于4%）的群體中非整倍體的發(fā)生率為4.7%，相比之下整個(gè)隊(duì)列人群中的非整倍體的發(fā)生率僅為0.4%。不同類型胎兒染色體非整倍體對(duì)cff DNA濃度的影響不一樣。cffDNA濃度在18三體組和13三體組中明顯低于整倍體組，而在21三體組中高于整倍體組［38］，這可能是臨床上T21篩查效果更佳的原因之一。Becking等［39］發(fā)現(xiàn)NIPS檢測(cè)中的cffDNA濃度低與胎兒13三體、18三體、X單體和三倍體的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。胎盤質(zhì)量低、胎盤病理性改變等可能解釋了這些染色體非整倍體與cffDNA濃度低之間的相關(guān)性［40，41］。因此，對(duì)于因cffDNA濃度低導(dǎo)致的檢測(cè)失敗的群體有必要提供遺傳咨詢并完善產(chǎn)前診斷。

2 cff DNA濃度與不良妊娠結(jié)局的關(guān)系

cffDNA主要來源于胎盤，母體循環(huán)中cffDNA濃度可以反映胎盤的健康和功能。胎盤的一些病理性變化如胎盤炎性因子的釋放或胎盤血管異常導(dǎo)致胎盤灌注不足等，可導(dǎo)致妊娠并發(fā)癥的發(fā)生［42］。因此，cffDNA濃度有可能成為預(yù)測(cè)不良妊娠結(jié)局的重要參數(shù)。已經(jīng)有研究表明cffDNA濃度異常與不良妊娠結(jié)局相關(guān)，如妊娠高血壓、子癇前期、胎兒生長(zhǎng)受限、早產(chǎn)等［43］。

研究發(fā)現(xiàn)cffDNA濃度低與妊娠期高血壓和重度子癇前期相關(guān)［7］。Becking等［43］發(fā)現(xiàn)，由于cff DNA濃度低而導(dǎo)致NIPS檢測(cè)失敗的女性中妊娠期高血壓和子癇前期的發(fā)生率較普通人群偏高，與之前Suzumori［44］以及Rolnik等［45］的研究結(jié)果一致。妊娠高血壓常伴有肥胖或高BMI，在分析cffDNA濃度低與妊娠期高血壓的關(guān)系時(shí)需要考慮BMI帶來的影響。隨后Deeksha等［46］在排除了孕婦BMI影響后，仍發(fā)現(xiàn)較低的cffDNA濃度和妊娠期高血壓之間存在相關(guān)性。

胎盤功能障礙是胎兒生長(zhǎng)受限的主要原因，推測(cè)胎兒生長(zhǎng)受限可能受異常cffDNA濃度的影響。Clapp［47］等研究發(fā)現(xiàn)cffDNA濃度低與出生體重低于第10和第5個(gè)百分位數(shù)有關(guān)，表明cffDNA濃度低與胎兒生長(zhǎng)受限風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)。Yuan等［48］也發(fā)現(xiàn)cffDNA濃度低（低于第5百分位）與低出生體重嬰兒的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)（＜2500g）。然而，也有一些研究顯示cffDNA濃度與胎兒生長(zhǎng)受限之間沒有相關(guān)性［8，46］。因此還需要更多的研究來確定兩者是否存在相關(guān)性。

早產(chǎn)是一種具有多種病因和表型特征的綜合征。Krishna等［8］研究發(fā)現(xiàn)，cffDNA濃度低的孕婦與cffDNA濃度正常的孕婦早產(chǎn)的發(fā)生率有顯著差異，其中40.9%的cffDNA濃度低的孕婦早產(chǎn)。Yuan等［48］也發(fā)現(xiàn)cffDNA濃度低（低于第10百分位）與早期早產(chǎn)（小于34周）風(fēng)險(xiǎn)增高相關(guān)。然而這兩項(xiàng)研究沒有區(qū)分自發(fā)性早產(chǎn)和具有醫(yī)學(xué)指征（高血壓等）的早產(chǎn)。Gerson等［7］在排除了具有醫(yī)學(xué)指征的孕婦后發(fā)現(xiàn)cffDNA濃度與早產(chǎn)之間沒有相關(guān)性。此外，目前的研究表明其他一些妊娠并發(fā)癥，如胎盤早剝［8］、胎盤增生和前置胎盤［44］、妊娠肝內(nèi)膽汁淤積［48］和妊娠期糖尿病［49］等暫未發(fā)現(xiàn)與cff DNA濃度之間存在相關(guān)性。

綜上所述，cffDNA受多種因素的影響，其中孕婦體重和孕周對(duì)cffDNA濃度的影響基本明確，孕婦體重越大、孕周越小，cffDNA濃度越低。母體疾病或藥物治療也是影響cffDNA濃度的重要因素，采血前避免使用肝素等藥物。雙胎和輔助生殖妊娠可能會(huì)降低cffDNA濃度，可以適當(dāng)推遲采血時(shí)間以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。cffDNA濃度低導(dǎo)致的檢測(cè)失敗人群中胎兒非整倍體風(fēng)險(xiǎn)更高，所以建議對(duì)檢測(cè)失敗的人群提供遺傳咨詢并完善產(chǎn)前診斷。cff DNA水平還與妊娠并發(fā)癥相關(guān)，如妊娠高血壓和子癇前期，兩者關(guān)系的進(jìn)一步研究將有利于發(fā)掘其在預(yù)測(cè)不良妊娠結(jié)局中的價(jià)值。