趙干業(yè) 孔祥東*

（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院遺傳與產(chǎn)前診斷中心，河南鄭州 450000）

基于孕婦外周血中游離DNA（cell free DNA，cf DNA）的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測（non-invasive prenatal testing，NIPT）技術(shù)在篩查胎兒染色體非整倍體及染色體微缺失微重復(fù)等疾病中發(fā)揮了重要作用。cfDNA中胎兒游離DNA（cell free fetal DNA，cffDNA）所占的比例，即cffDNA濃度（fetal fraction，F(xiàn)F）是保證NIPT檢測準(zhǔn)確性的重要指標(biāo)，較低的FF會(huì)影響NIPT對胎兒染色體異常的檢出，使假陰性的風(fēng)險(xiǎn)升高，故在NIPT檢測過程中對FF設(shè)有最低的檢測閾值，若不達(dá)標(biāo)即判定為檢測失敗。FF不足已成為導(dǎo)致NIPT檢測失敗的重要因素之一?，F(xiàn)有研究表明可能影響FF的因素眾多［1］，對此的深入認(rèn)識(shí)有利于對此類人群進(jìn)行更合理的遺傳咨詢和妊娠期管理?，F(xiàn)就相關(guān)因素及后續(xù)如何處理進(jìn)行綜述。

1 孕婦外周血中的游離DNA

孕婦外周血中的cfDNA，由占據(jù)大部分的孕婦自身cf DNA和占據(jù)小部分的cffDNA共同組成，其中孕婦自身的cfDNA主要來源于造血系統(tǒng)，同時(shí)其他的母體器官包括腫瘤也會(huì)向母體血漿中釋放cfDNA［2-4］；cffDNA則主要由胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的凋亡和壞死形成［5，6］，這也是cffDNA的主要特點(diǎn)之一。此外，cffDNA含量隨孕周增大，呈上升趨勢［7］；胎兒分娩后cffDNA會(huì)被快速清除［8］；母源cfDNA片段長度比cffDNA要長；cffDNA雖為短片段，但其可拼湊出完整的胎兒基因組信息［9］。

2 胎兒游離DNA與NIPT

當(dāng)胎兒出現(xiàn)染色體異常時(shí)，其釋放入孕婦外周血中的cffDNA會(huì)使相關(guān)染色體的比例發(fā)生變化，通過高通量測序的方法對這種變化進(jìn)行檢測即可對胎兒的染色體異常情況進(jìn)行評估，這也即是NIPT的基本原理［10］。為確保對胎兒染色體異常評估的準(zhǔn)確性，充足的cffDNA是必要條件［11，12］。不同檢測平臺(tái)對FF最小閾值的設(shè)定略有差異，一般介于2%～4%之間，低于設(shè)定閾值，則判定為檢測失?。?3］。

3 胎兒游離DNA濃度低相關(guān)的因素

任何可能影響母體或胎盤cfDNA釋放的因素均可能影響FF，而通過促進(jìn)母體cfDNA的升高和／或促進(jìn)胎盤cf DNA的降低即可導(dǎo)致FF降低。與之相關(guān)的因素主要有生物因素和實(shí)驗(yàn)因素等。

3.1 生物因素 生物因素又分母體因素和胎兒因素。

3.1.1 母體因素 BMI：諸多研究表明FF與孕婦BMI呈負(fù)相關(guān)，過度肥胖的孕婦其自身因炎癥和壞死的脂肪細(xì)胞更多，使得母體來源的cfDNA增多，而胎盤來源的cffDNA不變或者可能降低，進(jìn)而使得cffDNA的濃度降低［14］。

年齡：有的研究認(rèn)為孕婦年齡與FF呈負(fù)相關(guān)［15］，而有的研究則認(rèn)為無影響［16］。

人種：來自美國的一項(xiàng)研究顯示，在低FF人群中，非裔美國人明顯占比更高［17］，而澳大利亞的一項(xiàng)研究則顯示南亞人群中更容易出現(xiàn)低FF［18］。但同時(shí)也有研究顯示低FF與人種相關(guān)性不大［19］。

輔助生殖：有研究顯示，輔助生殖（in-vitro fertilization，IVF）樣本的FF要低于自然妊娠［20］，這一方面可能與激素治療或者胎盤功能損傷進(jìn)而影響cff DNA的釋放有關(guān)，另一方面則可能與IVF導(dǎo)致孕婦自身cf DNA升高也有關(guān)［21］；丹麥的一項(xiàng)研究顯示輔助生殖不僅可使FF降低，且移植新鮮胚胎比冷凍胚胎的FF要低［22］。但也有研究顯示IVF對FF并無影響［23，24］。

血清學(xué)指標(biāo)：PAPP-A和freeβ-hCG水平和FF正相關(guān)，檢測失敗人群中二者水平一般較低［25］，這兩者來源于胎盤的蛋白，其水平反映了胎盤功能和胎盤體積以及胎盤與母體接觸面積等情況［26，27］。

母體疾?。合到y(tǒng)性紅斑狼瘡［28］、B12缺乏［29］等與FF低而反復(fù)檢測失敗有關(guān)，而FF在治療或抑制疾病后得到改善。

藥物：為了治療母體某些疾病而使用的相關(guān)藥物與低FF也被證明有一定的相關(guān)性，如有研究報(bào)道抗凝劑如低分子肝素等的使用和低FF導(dǎo)致的檢測失敗率升高有關(guān)［30，31］，但也有研究表明導(dǎo)致FF降低的原因是低分子肝素所治療的疾病本身，而非低分子肝素的使用［32］。

運(yùn)動(dòng)：丹麥的一項(xiàng)研究顯示，在運(yùn)動(dòng)后和運(yùn)動(dòng)前相比，F(xiàn)F降低了1%～17%，但30分鐘后，該影響即消失，可能原因是運(yùn)動(dòng)提高了孕婦自身cfDNA的含量，而cff DNA的量則未變［33］。

妊娠期并發(fā)癥：低FF被發(fā)現(xiàn)與妊娠期并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，荷蘭一項(xiàng)研究顯示低FF孕婦發(fā)生妊娠期高血壓、晚發(fā)型先兆子癇和妊娠期糖尿病的概率升高，而這些異常很可能與孕早期胎盤出現(xiàn)異常有關(guān)，值的注意的是該研究顯示低FF與早發(fā)型子癇前期無相關(guān)性，但不能排除樣本量對此結(jié)論的影響［34］。美國的一項(xiàng)研究同樣顯示妊娠期高血壓疾病和子癇前期風(fēng)險(xiǎn)增加的孕婦在妊娠早期FF較低［35］。此外，對于妊娠期糖尿病，因BMI和低FF及妊娠期糖尿病都有關(guān)，有研究顯示在排除了BMI的影響后，并未發(fā)現(xiàn)低FF和妊娠期糖尿病之間有關(guān)聯(lián)［36］。

3.1.2 胎兒因素 孕周：孕周與FF呈正相關(guān)［7］。

胎兒性別：有研究顯示女胎FF比男胎的高［37］。

胎兒異常情況：出生體重較低的胎兒其FF一般較普通胎兒的要低［38］，也有研究顯示宮內(nèi)生長受限的胎兒其FF也較低［39］。多項(xiàng)研究報(bào)道低FF的胎兒13三體、18三體、45，X以及三倍體的風(fēng)險(xiǎn)增高［40，41］，但與21三體風(fēng)險(xiǎn)不相關(guān)。這與胎盤大小可能有關(guān)，有報(bào)道顯示13三體、18三體、45，X和三倍體胎兒的胎盤一般較小，其釋放的cffDNA也就較少。而對于21三體胎兒，有研究報(bào)道其胎盤質(zhì)量則相對較大。當(dāng)然，這樣的結(jié)論可能受到不同人群產(chǎn)診率不同、不同平臺(tái)不同定量方法等所影響［41］。而也有研究得出不同的結(jié)論，即低FF樣本中最終發(fā)生染色體異常的風(fēng)險(xiǎn)并無增高［42，43］。

3.2 實(shí)驗(yàn)因素

3.2.1 采血管 用普通的K3 EDTA抗凝管采血，其FF在第二天時(shí)降低48.5%，而在第4天時(shí)即可降低80%［44］，故樣本若不能立即處理，一般選用cfDNA專用保存管進(jìn)行血液采集。

3.2.2 運(yùn)輸溫度 一項(xiàng)研究顯示當(dāng)運(yùn)輸溫度維持在4℃左右，母源cfDNA就會(huì)變多，進(jìn)而使總的cfDNA增多，而cffDNA不變，最終使FF降低［45］，而運(yùn)輸溫度過高也會(huì)影響cfDNA的組成［46］，因此一般選用常溫進(jìn)行運(yùn)輸。

3.2.3 樣本的保存方式 有研究顯示凍融后的血漿，其FF會(huì)降低［47］。一項(xiàng)研究顯示血漿中FF在-25℃條件下保存2年后即會(huì)出現(xiàn)下降趨勢。然而，提取后的cfDNA，在-25℃保存18個(gè)月后FF依然沒有變化，但保存3年后，和立即檢測相比，F(xiàn)F增加了27%［48］。

3.2.4 FF的計(jì)算方法［49］FF的計(jì)算一般皆基于母源cfDNA和cffDNA之間的不同之處，而用于FF的計(jì)算方法有很多種，主要有①基于Y染色體估算法：因孕婦血漿中的Y染色體序列只可能來自于胎兒，故基于此對男性胎兒的游離DNA進(jìn)行準(zhǔn)確計(jì)算，但其無法應(yīng)用于女胎樣本。②基于SNP的方法：選取父親和母親皆為純合但基因型不同的位點(diǎn)，運(yùn)用胎兒特異性的位點(diǎn)進(jìn)行胎兒游離DNA濃度的計(jì)算，所得濃度準(zhǔn)確，但需要獲得父親基因型。升級版的方法如FetalQuant和FetalQuantSD，不需要父親基因型，但需要提高測序深度或者構(gòu)建適用于不同群體和平臺(tái)的參數(shù)模型。③seqFF：基于胎兒游離DNA和母源游離DNA測序時(shí)所得數(shù)據(jù)的不同特點(diǎn)來進(jìn)行，可直接利用NIPT測序過程中所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，但當(dāng)cffDNA濃度低于5%時(shí)準(zhǔn)確性差。④基于甲基化的方法：基于胎兒游離DNA和母源游離DNA甲基化不同，但甲基化測序成本較高。⑤基于cf DNA長度差異：根據(jù)胎兒cfDNA片段較母體cfDNA片段短的特點(diǎn)來進(jìn)行檢測，但準(zhǔn)確性一般。⑥基于核小體的方法：由于核小體的影響，母源游離DNA和胎兒游離DNA的測序序列各有自己的一些特點(diǎn)，基于此可進(jìn)行游離DNA濃度檢測，但其測定的準(zhǔn)確性差，需進(jìn)一步優(yōu)化。

FF計(jì)算方法多樣，各有優(yōu)缺點(diǎn)及適用場景，但不同方法之間計(jì)算有差異，同樣的樣品運(yùn)用不同的方法所得到的濃度有不同，有研究顯示運(yùn)用基于SNP的方法計(jì)算濃度和基于Y染色體的方法相比，其濃度會(huì)降低7%［50］，因此有研究建議可聯(lián)合使用多種方法進(jìn)行FF的計(jì)算，特別是對于FF低的樣本，以避免由于計(jì)算方法誤差導(dǎo)致的假性FF降低［51］。

4 胎兒游離DNA濃度低后續(xù)處理

4.1 重采血 FF隨孕周升高而升高，因此在較大孕周再次采血可提高檢測成功率，但重采血的成功率不同研究報(bào)道有差異，50%～94.12%不等［13，43］。

4.2 通過實(shí)驗(yàn)方法提高cffDNA濃度 通過在實(shí)驗(yàn)流程中對相關(guān)步驟進(jìn)行優(yōu)化，可在一定程度上提高FF，如cfDNA的富集、測序條件的優(yōu)化、生物信息學(xué)算法的改進(jìn)等［52，53］。有研究從總cf DNA中篩選較短的cfDNA片段，使FF增加了99%～359%［53］，但缺點(diǎn)是增加了檢測成本。

4.3 侵入性產(chǎn)前診斷 因有研究表明FF低胎兒異常妊娠率會(huì)增高，故有些專家建議直接進(jìn)行侵入性產(chǎn)前診斷［54］。

4.4 選擇其他聯(lián)合篩查方式 若通過重采血等方式依然無法解決NIPT檢測失敗的問題，同時(shí)孕婦又拒絕侵入性產(chǎn)前診斷的方式，則只能選擇目前已有的其他常用的篩查方式，如結(jié)合血清學(xué)篩查和超聲等方式對胎兒的情況進(jìn)行綜合評估［55］，但若篩查結(jié)果伴隨嚴(yán)重的結(jié)構(gòu)異常等，仍需要進(jìn)一步建議其進(jìn)行侵入性產(chǎn)前診斷。

4.5 各個(gè)指南中的建議 目前國際上各個(gè)相關(guān)協(xié)會(huì)和組織針對FF低問題，也有相應(yīng)的建議和指導(dǎo)。

國際產(chǎn)前診斷協(xié)會(huì)（International Society for Prenatal Diagnosis，ISPD）在2015年的聲明中表示FF降低的意義仍在研究中，是否與染色體異常有關(guān)尚無明確結(jié)論，而選擇重采血有1／3的失敗率，故建議需結(jié)合孕周、超聲結(jié)果以及孕婦個(gè)人意愿等重新評估選擇是否重采血［56］。2020年發(fā)布的關(guān)于雙胎NIPT檢測的聲明顯示FF低選擇重采血的成功率為53%～83%，對FF低的建議是進(jìn)行超聲檢測或者產(chǎn)前診斷，只有在時(shí)間允許情況下可考慮重采血［57］。2023年發(fā)布的最新聲明顯示，針對FF低樣本可選擇進(jìn)一步詳細(xì)的超聲檢查、重采血進(jìn)行NIPT二次檢測、其他的篩查方法或者產(chǎn)前診斷等方式［58］。

美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）2016年發(fā)布的指南建議FF低孕婦行產(chǎn)前診斷，而非重采血［54］，但其于2023年發(fā)布的最新指南則去掉了這一條，并未給出明確建議［59］。

美國婦產(chǎn)科醫(yī)師學(xué)會(huì)（Americal college of Obstetricians and Gynecologists，ACOG）和母胎醫(yī)學(xué)會(huì)（Society for Maternal-Fetal Medicine，SMFM）于2015年和2020年發(fā)布的指南皆顯示需告知NIPT檢測失敗孕婦胎兒染色體異常風(fēng)險(xiǎn)升高，需進(jìn)一步接受綜合的遺傳咨詢，并接受進(jìn)一步的超聲檢測和診斷。是否選擇重采血?jiǎng)t需要結(jié)合胎兒的孕周以及其他的檢測結(jié)果綜合判定，若胎兒孕周較大可能影響后續(xù)的產(chǎn)診或者超聲已有提示較嚴(yán)重的異常，則不建議重采血［60，61］。

5 小結(jié)

隨著相關(guān)研究的不斷增多，和FF低相關(guān)的因素越來越多的被報(bào)道，其中和母體相關(guān)的因素有BMI、年齡、人種、輔助生殖、母體自身疾病、藥物的使用以及血清學(xué)標(biāo)志物如PAPP-A和freeβ-hCG水平等，和胎兒自身相關(guān)的因素則有孕周、胎兒性別以及胎兒的異常情況如18三體、13三體及宮內(nèi)生長受限等，和NIPT檢測過程中相關(guān)的因素有樣本采集、運(yùn)輸、保存及FF的計(jì)算方法等。但其中也有諸多因素在不同的研究中有不一致的結(jié)論，如孕婦年齡、輔助生殖、人種及胎兒染色體異常情況等，因此未來需要更深入的研究來進(jìn)一步探討這些影響因素。而對于FF低的后續(xù)處理，一方面，實(shí)驗(yàn)室人員可通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)流程如通過富集cffDNA提高FF、優(yōu)化相關(guān)算法等方式降低因FF低而導(dǎo)致的失敗率，另一方面，遺傳咨詢醫(yī)生則需結(jié)合孕婦的孕周、超聲等其他檢測結(jié)果及其個(gè)人意愿進(jìn)行咨詢。在無嚴(yán)重超聲異常及孕周適中的情況下，可選擇重采血進(jìn)行二次檢測，反之，則建議進(jìn)行侵入性產(chǎn)前診斷，當(dāng)拒絕重采血和侵入性產(chǎn)前診斷時(shí)，則可通過聯(lián)合其他如超聲和血清學(xué)篩查的方式對胎兒的異常情況進(jìn)行綜合評估。