蔡 夢，閻漢英，王曉靜（河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，河北張家口 075000）

胃癌（gastric carcinoma，GC）在中國所有惡性腫瘤中的發(fā)病率位居第二位[1-2]，是全球癌癥死亡的第三大原因[3]。EB 病毒相關(guān)胃癌（EBV-associated gastric carcinoma，EBVaGC）是一種與EBV感染相關(guān)的常見惡性腫瘤。根據(jù)地理分布，EBVa-GC 約占所有胃癌的1.3%～30.9%，全球平均占所有胃癌的8.9%，每年約有75 000 例新診斷[4-5]。因此，尋找有效的分子靶點(diǎn)以促進(jìn)對EBVaGC 患者的診斷及預(yù)后非常重要。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNAs，LncRNAs）是不編碼蛋白質(zhì)的功能性RNA[6]。新出現(xiàn)的證據(jù)表明LncRNA 與GC腫瘤發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)[7]。LncRNA 肺腺癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄物1（metastasis-associated lung adenocarcinoma tran 1，MALAT1）長6.5 kb，最初發(fā)現(xiàn)于肺腫瘤組織中[7]。研究表明LncRNA MALAT1 在多種腫瘤組織中呈高表達(dá)，包括胃癌組織[9]。但其在EBVaGC患者血清中的表達(dá)及其診斷與預(yù)后評估價值尚不明確，基于此，本研究通過檢測EBVaGC 患者血清中LncRNA MALAT1 的表達(dá)情況，探討其對EBVaGC疾病的診斷以及預(yù)后評估價值，以期為EBV 相關(guān)胃癌的診斷、治療提供一定參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2015年1月～2017年1月河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科收治的233 例患者為研究對象，采集各組外周靜脈血并采用熒光定量PCR 法檢測EBV-DNA，并根據(jù)EBV DNA 結(jié)果將患者分為EBV DNA 陽性組（n=123），男性96例，女性27 例，年齡38～79（62.35±8.59）歲；EBV DNA 陰性組（n=110），男性75 例，女性25例，年齡38～78（61.29±8.21）歲；同時選取在本院進(jìn)行健康體檢的志愿者100 例為對照組，其中男性68 例，女性32 例，年齡38～78（61.95±7.66）歲，三組年齡、性別比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有受試者均經(jīng)組織病理學(xué)確診；②EBVaGC 患者均為幽門螺旋桿菌陰性；③未接受任何術(shù)前治療；④健康體檢人群EB 病毒檢測均為陰性。排除標(biāo)準(zhǔn)：①繼發(fā)性惡性腫瘤；②存在嚴(yán)重的心臟病，如急性心肌梗死、心律失常和心力衰竭；③存在全身性疾病，如肝衰竭、多器官功能障礙綜合征和慢性腎??；④臨床資料不完整者。研究經(jīng)過我院道德倫理委員會批準(zhǔn)通過，樣品采集均獲得所有參與者的知情同意，符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》。

1.2 儀器與試劑 Trizol 試劑[賽默飛世爾科技（中國）有限公司，貨號：15596026]，Prime Script II 1st Strand cDNA 合成試劑盒（上海百賽生物技術(shù)股份有限公司，貨號：RR055B），SYBR Premix Ex Taq 試劑盒（武漢科昊佳生物科技有限公司，貨號：RR420A），Bio-Rad Real-Time PCR System（美國Applied Biosystems 公司）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集：所有研究對象均于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下采集靜脈血4～5 ml，常規(guī)靜置30 min，在3 000 r/min 條件下離心10 min，分離提取上層血清，置于低溫冰箱中，-80℃保存待測。

1.3.2 qRT-PCR 法檢測血清中LncRNA MALAT1水平：根據(jù)制造商的說明，使用Trizol 提取試劑盒從血清中提取總RNA。用Prime Script II 1st Strand cDNA 合成試劑盒（TaKaRa Bio）對總RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

使用SYBR Premix Ex Taq（TliRNase H Plus；TaKaRa Bio）試劑盒在Bio-Rad Real-Time PCR System（Bio-Rad，美國）上進(jìn)行qRT-PCR 測定。PCR反應(yīng)條件為：95℃ 15 min；95℃ 10 s，60℃ 20 s，40 個循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt方法對血清中LncRNA MALAT1 表達(dá)水平進(jìn)行相對定量分析。PCR 引物序列: LncRNA MALAT1 正向引物5’- TGGGATGGTCTTAACAGGGA-3’,反向引物5’-CCTGAAGGTGTTCGTGCCAA-3’,GAPDH 正向引物5’- AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’,反向引物5’- AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’。

1.3.3 隨訪：每3 個月以門診或電話的形式進(jìn)行一次定期隨訪，詢問記錄患者的生存時間，隨訪開始時間從出院起計(jì)算，隨訪時間為5年，截止時間為2022年1月，終點(diǎn)事件定義為患者死亡。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料經(jīng)正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)后表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s），組間比較行t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料表示為n，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)比較利用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較進(jìn)行SNK-Q分析；利用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評價LncRNA MALAT1水平對EBVaGC 的預(yù)測價值；Kaplan-Meier 法分析不同LncRNA MALAT1 表達(dá)水平與患者生存時間的關(guān)系，并繪制生存曲線；多因素COX 回歸風(fēng)險模型分析EBVaGC 患者的預(yù)后影響因素。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EBVaGC 患者血清中LncRNA MALAT1 的表達(dá) 研究結(jié)果顯示EBV DNA 陽性組EBVaGC 患者血清中LncRNA MALAT1 表達(dá)水平（1.27±0.03）高于EBV DNA 陰性組患者（1.12±0.05）和健康對照組（0.96±0.04），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1 620.239，P＜0.05）。

2.2 血清中LncRNA MALAT1 表達(dá)與EBVaGC 患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性研究 見表1。LncRNA MALAT1 在EBVaGC 患者血清中的表達(dá)與患者年齡、主癌位置、脈管癌栓、腫瘤直徑、腫瘤組織學(xué)類型、神經(jīng)侵犯、浸潤深度無關(guān)（均P＞0.05），與性別、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期、Lauren 分型有關(guān)（均P＜0.05）。

表1 EBVaGC 患者血清中LncRNA MALAT1 表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性（n=123,±s）

表1 EBVaGC 患者血清中LncRNA MALAT1 表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性（n=123,±s）

類 別 nLncRNA MALAT1 相對表達(dá)量t/FP性別男961.28±0.046.2650.000女271.23±0.02年齡（歲）＞50581.28±0.051.4850.140≤50651.27±0.02主癌位置胃食管結(jié)合部141.26±0.02 1.3200.271胃底、胃體391.27±0.03胃竇641.27±0.03全胃、殘胃61.29±0.06分化程度低分化871.31±0.0417.1070.000中+高分化361.19±0.02淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是711.30±0.0312.7840.000否521.23±0.03 TNM 分期Ⅰ+Ⅱ期331.12±0.0129.7480.000Ⅲ+Ⅳ期901.33±0.04脈管癌栓有741.27±0.021.5460.125無491.28±0.05腫瘤直徑（cm）＜5.5481.27±0.031.8030.074≥5.5751.28±0.03腫瘤組織學(xué)類型伴淋巴樣間質(zhì)癌51.29±0.021.4740.143非伴淋巴樣間質(zhì)癌1181.27±0.03 Lauren 分型腸型211.25±0.02彌漫型451.28±0.03混合型321.27±0.02未分型251.28±0.05神經(jīng)侵犯有641.28±0.041.7310.086無591.27±0.02浸潤深度＜T2111.29±0.051.9700.051≥T21121.27±0.03 4.8800.003

2.3 LncRNA MALAT1 對EBVaGC 患者的診斷價值分析 見圖1。以EBV DNA 陽性為因變量，以LncRNA MALAT1 表達(dá)水平為自變量進(jìn)行ROC 曲線分析，結(jié)果顯示，LncRNA MALAT1 預(yù)測EBVa-GC 患者的AUC 為0.863（95%CI：0.811～0.906），截斷值為：＞1.21，對應(yīng)的敏感度為92.68%，特異度為81.00%。

圖1 血清LncRNA MALAT1 水平對EBVaGC診斷價值的ROC 曲線

2.4 EBVaGC 患者血清LncRNA MALAT1 水平與預(yù)后的關(guān)系 隨訪過程中無失訪病例，隨訪期間生存56 例，LncRNA MALAT1 以中位數(shù)為臨界值，超出該范圍判定為高表達(dá)，低于該范圍定義為低表達(dá)。其中高表達(dá)者共78 例，低表達(dá)者45 例。

繪制五年生存曲線，Kaplan-Meier 分析結(jié)果顯示，LncRNA MALAT1 高表達(dá)組患者五年累積生存率34.62%（27/78），平均生存時間36.84±19.40個月，顯著低于低表達(dá)組57.78%（26/45），平均生存時間46.35±18.18 個月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Log rankχ2=6.944，P=0.008）。見圖2。

圖2 EBVaGC 患者血清LncRNA MALAT1 水平與預(yù)后的關(guān)系

2.5 影響EBVaGC 患者預(yù)后的單因素和多因素COX 回歸分析 見表2。以EBVaGC 患者是否死亡為因變量（未死亡=0，死亡=1），以年齡、主癌位置、脈管癌栓、腫瘤直徑、腫瘤組織學(xué)類型、神經(jīng)侵犯、浸潤深度、性別、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期、Lauren 分型為自變量進(jìn)行單因素分析，結(jié)果顯示年齡、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期、Lauren 分型、LncRNA MALAT1 均與EBVaGC 患者預(yù)后相關(guān)（P＜0.05）。進(jìn)一步行多因素COX 回歸分析，年齡（＞50=1，≤50=0）、分化程度（G2/G3=0，G1=1）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（無=0，有=1）、TNM 分期（Ⅰ+Ⅱ=0，Ⅲ+Ⅳ=1）、Lauren 分型（其他=0，彌漫型=1）、LncRNA MALAT1（低表達(dá)=0，高表達(dá)=1）為自變量，結(jié)果顯示年齡、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期、LncRNA MALAT1 高表達(dá)均是影響EBVaGC 患者生存狀況的獨(dú)立危險因素（P＜0.05），見表3。

表2 影響EBVaGC 患者預(yù)后的單因素分析（±s）

表2 影響EBVaGC 患者預(yù)后的單因素分析（±s）

死亡（例）類別n t/FP是否n=56性別男96 50461.006 0.316女27 1710年齡（歲）＞5058 203817.682 0.000≤5065 4718主癌位置胃食管結(jié)合部1486 0.330 0.954 n=67胃底、胃體39 2019胃竇64 3628全胃、殘胃633分化程度低分化87 41466.466 0.011中+高分化36 2610淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是71 264521.581 0.000否52 4111 TNM 分期Ⅰ+Ⅱ期33 2588.240 0.004Ⅲ+Ⅳ期90 4248脈管癌栓有74 40340.013 0.909無49 2722腫瘤直徑（cm）＜5.548 30182.046 0.153≥5.575 3738腫瘤組織學(xué)類型 伴淋巴樣間質(zhì)癌5230.440 0.507非伴淋巴樣間質(zhì)癌 118 6553 Lauren 分型腸型21 156 8.084 0.044彌漫型45 1827混合型32 1815未分型25 178神經(jīng)侵犯有64 39250.158 0.691無59 3821浸潤深度＜T211560.396 0.529≥T2112 6250 LncRNA MALAT1 高表達(dá)63 41225.860 0.015低表達(dá)60 2634

表3 影響EBVaGC 患者預(yù)后的COX 回歸分析

3 討論

EBV 是一種雙鏈DNA 病毒，是第一個被發(fā)現(xiàn)與多種人類癌癥相關(guān)的病毒，包括淋巴瘤、鼻咽癌和胃癌（EBVaGC）等[10-11]。其中EBVaGC 每年的發(fā)病率為75 000～90 000 例，是EBV 相關(guān)腫瘤中最大的亞群，其中位生存期僅為8.5年[12]。但目前EBVaGC 的發(fā)病機(jī)制尚不明確，部分EBVaGC 患者難以被準(zhǔn)確診斷，預(yù)后較差，因此急需選擇有效可靠的指標(biāo)評估EBVaGC 患者疾病及預(yù)后。

LncRNA 在免疫反應(yīng)、血管生成、細(xì)胞增殖、凋亡、自噬、細(xì)胞遷移和侵襲等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要的作用[13]。多項(xiàng)研究表明，LncRNA 也可以調(diào)節(jié)和被腫瘤免疫微環(huán)境調(diào)控，使LncRNA 成為潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，從而可以改善GC 的管理和治療。例如，血漿LncRNA H19 已在GC 中得到鑒定，可作為GC 診斷的潛在生物標(biāo)志物[13]。已證明位于染色體11q13 上的MALAT1 與各種類型的腫瘤有關(guān)[15]。據(jù)報道LncRNA MALAT1在多種癌癥中過表達(dá)，并調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡[16]。最近的研究表明，LncRNA MALAT1 通過激活自噬，在膠質(zhì)瘤和卵巢癌中促進(jìn)增殖和侵襲[17-18]。此外，LncRNA MALAT1 通過調(diào)節(jié)肝細(xì)胞癌、彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤和GC 中的自噬來調(diào)節(jié)化療耐藥性[18，20]。在本研究中，EBVaGC 患者血清中LncRNA MALAT1 表達(dá)較EBV DNA 陰性胃癌患者及健康人群中均明顯升高，表明LncRNA MALAT1 可能在EBVaGC 疾病中發(fā)揮促癌基因的重要作用，分析其原因可能是LncRNA MALAT1 通過多種調(diào)控因子及途徑影響下游基因表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，但其具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。研究進(jìn)一步通過相關(guān)性分析可知，LncRNA MALAT1 表達(dá)與性別、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期、Lauren 分型有關(guān)，且隨著腫瘤分期升高，LncRNA MALAT1 表達(dá)水平越高，表明LncRNA MALAT1 的高表達(dá)可促進(jìn)EBVaGC 相關(guān)胃癌進(jìn)展，與腫瘤轉(zhuǎn)移、增殖等關(guān)系密切，可能作為臨床判斷EBVaGC 疾病進(jìn)展的血清學(xué)指標(biāo)，從而為臨床EBVaGC 的篩查、診斷、治療提供可靠的病理學(xué)依據(jù)；根據(jù)ROC 結(jié)果發(fā)現(xiàn)LncRNA MALAT1 對診斷EBVaGC 疾病有較好的敏感度和特異度，表明LncRNA MALAT1 可能作為診斷該疾病的潛在標(biāo)志物。經(jīng)過繪制生存曲線結(jié)果顯示LncRNA MALAT1高表達(dá)患者五年累積生存率顯著低于低表達(dá)患者，推測LncRNA MALAT1 是評估EBVaGC 胃癌患者不良預(yù)后的生物標(biāo)志物，提示LncRNA MALAT1可在一定程度反映EBVaGC 胃癌患者生存期，可為臨床評估預(yù)后提供有效信息，此外其表達(dá)升高不利于患者生存預(yù)后也提示臨床可通過降低LncRNA MALAT1 表達(dá)水平，降低EBVaGC 患者不良預(yù)后發(fā)生率，提高生存率；研究發(fā)現(xiàn)年齡、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期、LncRNA MALAT1 高表達(dá)均是影響EBVaGC 患者生存狀況的危險因素，有望成為EBVaGC 患者預(yù)后預(yù)測的無創(chuàng)生物標(biāo)志物，提示臨床LncRNA MALAT1 高表達(dá)的患者，可以在手術(shù)后進(jìn)行嚴(yán)密的隨訪及觀察，在必要的時候給予患者恰當(dāng)?shù)妮o助治療，以期改善患者的預(yù)后。上述結(jié)果可能為LncRNA MALAT1 參與EBVaGC 的發(fā)生提供依據(jù)，但本研究只分析了血清中LncRNA MALAT1 表達(dá)單獨(dú)診斷EBVaGC 的價值，后續(xù)研究可進(jìn)一步分析其與腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測對EBVa-GC 的診斷價值，更多作用機(jī)制尚需深入研究。

綜上所述，EBVaGC 患者血清中LncRNA MALAT1呈高表達(dá)與EBVaGC 患者臨床特征密切相關(guān)，可作為EBVaGC 胃癌患者預(yù)后不良的生物標(biāo)志物，為EBVaGC 的致病機(jī)制研究提供新思路，對臨床診斷EBVaGC 和評估生存預(yù)后具有重要價值。