趙 雨，林 琳，王 群，張國(guó)哲，王 杰，尚林雪，洪思丹，馬清清，顧翠花

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 風(fēng)景園林與建筑學(xué)院，浙江 杭州 311300；2.浙江農(nóng)林大學(xué) 浙江省園林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300；3.浙江農(nóng)林大學(xué) 南方園林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用國(guó)家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300）

黃薇Heimiamyrtifolia是千屈菜科Lythraceae 黃薇屬Heimia落葉叢生灌木，原產(chǎn)于巴西，南亞、東亞地區(qū)有零星分布，在中國(guó)的上海、浙江、廣西等地也有引種栽培[1]。黃薇喜溫暖濕潤(rùn)且陽(yáng)光充沛的環(huán)境，不耐干旱，夏季開(kāi)花，花色金黃，花量豐富，可作為園林綠籬、花壇花境背景應(yīng)用，點(diǎn)綴和美化植物景觀，還可以凈化城市水質(zhì)，具有較高的園林價(jià)值和應(yīng)用前景[2]。目前，國(guó)內(nèi)外主要在黃薇的分類和應(yīng)用[3]、葉內(nèi)酚類化合物[4]、類黃酮組分[5]、非生物脅迫的抵御機(jī)制[6-8]、葉綠體基因組分析[9]等方面進(jìn)行了研究，但關(guān)于黃薇的分子生物學(xué)方面的研究則十分匱乏。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR (RT-qPCR)具有靈敏度高、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)及高通量等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)已成為研究基因表達(dá)分析的常用方法[10]，在分子生物學(xué)領(lǐng)域，RT-qPCR 對(duì)深入研究植物基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制、發(fā)現(xiàn)新基因、細(xì)胞因子表達(dá)分析、預(yù)測(cè)基因功能、醫(yī)學(xué)診斷以及食品藥品檢測(cè)等至關(guān)重要[11]。在實(shí)際的應(yīng)用過(guò)程中，為了確保RT-qPCR 結(jié)果的準(zhǔn)確性，需要引用一個(gè)表達(dá)量穩(wěn)定的內(nèi)參基因作為參照，而內(nèi)參基因的穩(wěn)定性也會(huì)影響RT-qPCR 結(jié)果的準(zhǔn)確性[12-13]。因此，篩選到適宜的內(nèi)參基因是進(jìn)行RT-qPCR 表達(dá)分析時(shí)的重要前提[14]。目前暫未見(jiàn)黃薇內(nèi)參基因篩選的相關(guān)研究，這嚴(yán)重制約了對(duì)黃薇目標(biāo)基因的定量分析。因此，本研究基于黃薇轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)不同組織及不同干旱脅迫下黃薇的內(nèi)參基因進(jìn)行研究，為提高不同組織及不同干旱脅迫下基因RT-qPCR 分析的準(zhǔn)確性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

材料取自浙江農(nóng)林大學(xué)風(fēng)景園林與建筑學(xué)院人工氣候室內(nèi)生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)勢(shì)一致的黃薇1年生扦插苗。采樣時(shí)選取黃薇盛花期的根、莖、葉、花，以及模擬自然條件下的對(duì)照組 (土壤相對(duì)含水量為65%～75%，ck) 和4 個(gè)干旱脅迫處理組 (T1、T2、T3、T4土壤相對(duì)含水量分別為45%～60%、30%～45%、15%～30%、10%～15%) 的成熟葉片。采樣后立即將樣品置于液氮中速凍，并保存在-80 ℃冰箱備用。

1.2 總RNA 提取及cDNA 合成

樣品總RNA 的提取按諾唯贊公司的RNA isolater Total RNA Extraction Reagent (RC401-01) 試劑盒使用方法進(jìn)行。利用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 的完整性，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度?？俁NA 純度D(260)/D(280) 為1.8～2.4，D(260)/D(230) 為1.5～2.4。使用Reverse Transcriptase MMLV 試劑(Takara)合成cDNA 的第1 鏈，反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)椋?7 ℃，15 min (反轉(zhuǎn)錄過(guò)程)；85 ℃，5 s (反轉(zhuǎn)錄酶的失活過(guò)程)，4 ℃冰箱保存。最后將cDNA 產(chǎn)物于-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 候選基因的引物設(shè)計(jì)

基于黃薇轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(序列號(hào)：PRJNA804698)，選取9 個(gè)基因作為候選內(nèi)參基因：延伸因子1α 蛋白基因(elongationfactors-1α,EF-1α)、α-微管蛋白基因(α-tubulin,TUA)、親環(huán)蛋白基因(cyclophilin,CYP)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphat dehydrogenase,GAPDH)、18S 核糖體RNA(18S ribosomal RNA,18SRNA)、泛素化酶基因(ubiquitin-conjugating enzyme,UBC)、β-維管蛋白基因(tubulin,TUB)、肌動(dòng)蛋白基因(actin,ACT)和伴侶蛋白基因(chaperone protein,DNAJ)?；谵D(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，選擇與纖維素合成和干旱脅迫相關(guān)的差異表達(dá)基因CSLD、SOD基因，驗(yàn)證內(nèi)參基因?qū)虮磉_(dá)量的影響。利用Primer 5 軟件，設(shè)計(jì)候選內(nèi)參基因的熒光定量PCR 引物，并由杭州有康生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

以所有試樣的cDNA 為模板依次稀釋5 個(gè)濃度梯度(5-1、5-2、5-3、5-4、5-5)，設(shè)3 次重復(fù)，制作9 個(gè)內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 稀釋10 倍，RT-qPCR 反應(yīng)使用諾唯贊公司出品的SYBR?Primix ExTaqTM 試劑盒(Q712)。熒光定量反應(yīng)在Roche LightCycler 480Ⅱ熒光定量?jī)x上進(jìn)行，反應(yīng)體系為20 μL：2×TaqPro Universal SYBR qPCR Master Mix 熒光染料10 μL、cDNA 模板2 μL、上下游引物各0.8 μL、ddH2O 6.4 μL。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性95 ℃，10 s；PCR 反應(yīng)95 ℃，10 s，60 ℃，30 s，共40 個(gè)循環(huán)。采集溶解曲線熒光信號(hào)進(jìn)行分析，反應(yīng)體系為：從60 ℃到95 ℃，15 s；60 ℃，60 s；95 ℃，15 s。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2016 統(tǒng)計(jì)基因的Ct值，用Origin 9.1 制圖。采用geNorm[15]、NormFinder[16]、BestKeeper[17]軟件以及在線分析軟件RefFinder (https://www.heartcure.com.au/reffinder/)，綜合分析不同情況下最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA 的質(zhì)量檢測(cè)和引物特異性驗(yàn)證

所得RNA 產(chǎn)物D(260)/D(280)為1.8～2.2，D(260)/D(230)為1.8～2.4，電泳條帶清晰(圖1A)，說(shuō)明提取的總RNA 質(zhì)量良好，無(wú)明顯降解，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。9 個(gè)候選內(nèi)參基因瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后出現(xiàn)與預(yù)期大小一致的單一條帶(圖1B)，說(shuō)明引物不存在二聚體，可進(jìn)行特異性擴(kuò)增。根據(jù)結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算斜率，如表1顯示：候選基因的線性相關(guān)系數(shù)R2＞0.990，引物擴(kuò)增效率為95.6%～109.7%。綜上，候選內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率、產(chǎn)物特異性都符合RT-qPCR 的條件，可用于后續(xù)的分析。

表1 黃薇候選內(nèi)參基因引物信息Table 1 Primer information of candidate reference gene in H. myrtifolia

圖1 黃薇總RNA 瓊脂糖凝膠電泳分析(A)和RT-qPCR 擴(kuò)增產(chǎn)物特異性(B)Figure 1 Agarose gel electrophoresis analysis of total RNA (A) and specificity of products amplified by RT-qPCR (B) in H. myrtifolia

2.2 候選內(nèi)參基因的表達(dá)量分析

根據(jù)Ct表示不同條件下基因的相對(duì)表達(dá)量，Ct越小，表達(dá)豐度越高[18]。所有樣品中，9 個(gè)候選內(nèi)參基因的Ct為21.12～33.74 (圖2)，其中平均表達(dá)量最高的基因?yàn)镚APDH，Ct平均值為25.01；18SRNA的Ct平均為29.90，其表達(dá)量最低。EF-1α基因的表達(dá)水平變化最小，Ct為23.97～29.06；18SRNA 的Ct為26.64～33.47，表達(dá)變化最大。從Ct的大小和變化情況來(lái)看，GAPDH基因的表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定且豐度最高，可初步評(píng)價(jià)候選內(nèi)參基因的表達(dá)水平和穩(wěn)定性。

圖2 9 個(gè)候選內(nèi)參基因的Ct 值Figure 2 Ct values of the 9 candidate reference genes

2.3 geNorm 分析

geNorm 軟件根據(jù)平均穩(wěn)定值M來(lái)判定結(jié)果，M越小，基因表達(dá)越穩(wěn)定，反之越不穩(wěn)定[19]。使用2-ΔΔCt法計(jì)算內(nèi)參基因的表達(dá)量：在黃薇不同組織中，候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性從高到低依次為CYP=GAPDH、18SRNA、UBC、DNAJ、ACT、EF-1α、TUB、TUA(圖3A)。在全部樣品和干旱脅迫中，黃薇GAPDH和UBC基因最穩(wěn)定，TUB基因最不穩(wěn)定(圖3B 和圖3C)。geNorm 軟件還可以根據(jù)成對(duì)變異值，分析最適的內(nèi)參基因數(shù)目，軟件默認(rèn)的配對(duì)差異值(Vn/Vn+1，V為配對(duì)變異指數(shù)，n為可使RT-qPCR 結(jié)果準(zhǔn)確的最少基因數(shù)目)為0.15[20]。當(dāng)Vn/Vn+1＞0.15，需要加入第n+1 基因；當(dāng)Vn/Vn+1＜0.15，不需要引入新的基因。黃薇在不同組織和干旱脅迫下(圖3D)，除不同組織中V2/V3＜0.15 外，其余情況均大于0.15。該現(xiàn)象可能是因?yàn)樵诓煌M織和脅迫處理下，黃薇基因的表達(dá)量變化差異大，但軟件說(shuō)明書(shū)上也提出Vn/Vn+1最大值設(shè)定為0.15 并非總是必須的[21]。

圖3 geNorm 分析9 個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定值和配對(duì)變異值Figure 3 Stable expression values and paired variation values of nine candidate reference genes were analyzed by geNorm

2.4 NormFinder 分析

NormFinder 軟件按照2-ΔΔCt法計(jì)算穩(wěn)定性，其中表達(dá)穩(wěn)定值越小，候選內(nèi)參基因越穩(wěn)定[22]。結(jié)果表明(表2)：在不同組織中，GAPDH和CYP基因表達(dá)最穩(wěn)定，TUA基因最不穩(wěn)定。在不同干旱脅迫處理下，GAPDH基因是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，TUB基因最不穩(wěn)定。在黃薇的全部樣品中，最穩(wěn)定的內(nèi)參基因是GAPDH基因，這與geNorm 軟件得出的結(jié)果相同。

表2 NormFinder 分析內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定值Table 2 Expression stability values of nine candidate reference genes calculated by the NormFinder

2.5 BestKeeper 分析

BestKeeper 軟件以內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)差(SD)和變異系數(shù)(CV)為基準(zhǔn)，其數(shù)值越小越穩(wěn)定[23]。從表3可見(jiàn)：在不同組織中，GAPDH基因的CV±SD 為2.65 ± 0.69，排名第一，最穩(wěn)定；在干旱脅迫和全部樣品中，EF-1α基因的CV±SD 分別為1.97±0.53 和2.58±0.71，表達(dá)最穩(wěn)定。綜合不同條件下的分析結(jié)果，EF-1α基因被鑒定為最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

2.6 RefFinder 綜合分析

上述3 種軟件的結(jié)果存在一定的差異，使用在線分析軟件RefFinder，整合上述分析結(jié)果并進(jìn)行綜合分析。由表4顯示：不同組織中，最穩(wěn)定的內(nèi)參基因是GAPDH和CYP，最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因是TUA；在干旱脅迫下，最穩(wěn)定的內(nèi)參基因是GAPDH和TUA，最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因是TUB。在全部樣本中，最穩(wěn)定的內(nèi)參基因?yàn)镚APDH，最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因?yàn)?8SRNA。

表4 RefFinder 分析內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定值Table 4 Expression stability of candidate reference genes ranked by RefFinder

2.7 內(nèi)參基因穩(wěn)定性的驗(yàn)證

為驗(yàn)證候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，采用RT-qPCR 技術(shù)，根據(jù)篩選的穩(wěn)定內(nèi)參基因，對(duì)干旱脅迫下的靶基因CSLD和SOD的表達(dá)模式進(jìn)行驗(yàn)證。CSLD基因是一種纖維素合成酶的結(jié)構(gòu)蛋白，在莖中的表達(dá)量一般較高[24]。SOD基因?qū)儆诳寡趸腹δ芑颍谥参镌庥龈珊得{迫時(shí)上調(diào)表達(dá)以抵御外界傷害[25]。從圖4可見(jiàn)：在不同組織中，GAPDH和CYP基因在單獨(dú)和組合校正下，CSLD均在莖中表達(dá)量最高，在其他組織中表達(dá)變化不大。但使用TUA作內(nèi)參基因時(shí)，CSLD在莖中的表達(dá)量最低，在葉片中表達(dá)卻最高。干旱脅迫下，使用GAPDH和基因組合GAPDH+TUA時(shí)，SOD基因在T3處理表達(dá)量最高，表達(dá)趨勢(shì)大致相同；而利用TUB基因進(jìn)行驗(yàn)證時(shí)，SOD基因在T2處理表達(dá)量最高，與其他結(jié)果差異較大。以上結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了GAPDH基因作為內(nèi)參基因的穩(wěn)定性與可靠性。

圖4 不同組織和干旱脅迫下CSLD (A)和SOD 基因(B)利用不同內(nèi)參基因的表達(dá)分析Figure 4 Expression analysis for CSLD gene (A) and SOD gene (B) using different reference genes in different tissues and drought stress

3 討論與結(jié)論

RT-qPCR 技術(shù)是一種分析基因表達(dá)量的研究工具，而使用相對(duì)定量法檢測(cè)的可靠性，極大依賴內(nèi)參基因的穩(wěn)定性[26]。理想的內(nèi)參基因在不同條件下，基因的表達(dá)變化較小，常用的內(nèi)參基因一般都是維持植物生命活動(dòng)必須的看家基因[27]。本研究基于黃薇轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選了9 個(gè)常用內(nèi)參基因(EF-1α、TUA、CYP、GAPDH、18SRNA、UBC、TUB、ACT、DNAJ)，其中，GAPDH在不同組織和干旱脅迫下都較穩(wěn)定，最不穩(wěn)定的是18SRNA。geNorm 和NormFinder 結(jié)果中，得出的最適內(nèi)參基因組合為GAPDH+UBC，BestKeeper 得出最佳基因?yàn)镋F-1α，但GAPDH的穩(wěn)定值排名綜合也較靠前。3 個(gè)篩選軟件得出的結(jié)果基本一致，但也存在一定的差異，這可能是由于算法的不同所導(dǎo)致的[28]。與本研究結(jié)果不同的是，張海洋等[29]探究了菠菜Spinacia oleracea在不同脅迫處理下穩(wěn)定的內(nèi)參基因，3 個(gè)軟件的結(jié)果一致，在氯化鈉和高溫脅迫下，G6PD的表達(dá)穩(wěn)定性最好，聚乙二醇脅迫下ELF1B的表達(dá)穩(wěn)定性最好。王蕊等[30]研究了不同發(fā)育時(shí)期大豆Glycinemax在不同組織、不同非生物脅迫下穩(wěn)定表達(dá)的最適內(nèi)參基因，4 個(gè)軟件在全部組織及全部脅迫中綜合分析結(jié)果均一致，在全部組織中最適內(nèi)參基因?yàn)锳CT，全部脅迫中最適內(nèi)參基因?yàn)镋F-1α。

非生物脅迫會(huì)改變植物正常的代謝過(guò)程，篩選在脅迫處理下穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，有利于后續(xù)開(kāi)展目的基因的鑒定，以便進(jìn)一步了解目的基因的功能[31]。目前已有大量研究篩選不同非生物脅迫下的最佳內(nèi)參基因。如紫鴨跖草Tradescantiapallida在不同濃度的銅離子脅迫下，最佳內(nèi)參基因組合為18SRNA +TUB+UBI[32]。馬鈴薯Solanumtuberosum在干旱和滲透脅迫條件下，EF-1α和sec3 基因表達(dá)最穩(wěn)定[33]。上述結(jié)果與本研究的結(jié)果存在一定差異，說(shuō)明不同植物在不同非生物脅迫下最適內(nèi)參基因也在變化，特定條件下的最適內(nèi)參基因仍需通過(guò)試驗(yàn)篩選。