李亞萍，戴惠明，姜 武，陳家棟，段曉婧，陶正明

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 食品與健康學(xué)院 浙江省特色中藥資源保護(hù)與創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300；2.浙江省亞熱帶作物研究所，浙江 溫州 325005；3.永嘉縣自然資源和規(guī)劃局，浙江 永嘉 325199）

黃精Polygonatumspp.的干燥根莖是常用的一味中藥[1]，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾、益腎等功效，臨床常用于脾胃氣虛、胃陰不足、精血不足、腰膝酸軟等證[2-3]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)：黃精含有多糖、甾體皂苷、木質(zhì)素等多種化合物，其中黃精多糖被認(rèn)為是黃精主要的活性成分，可清除自由基，延緩衰老，降低血乳酸，緩解疲勞等。黃精多糖的降血糖和抗炎等多種作用相互協(xié)作，為研究治療糖尿病提供了較好的思路。黃精藥性平和，不僅具有多種藥理作用，還有一定滋補(bǔ)作用，故在復(fù)方湯劑以及中成藥的守正創(chuàng)新中具有較好的應(yīng)用前景[4-5]。另外，黃精因具有獨(dú)特風(fēng)味和較好的口感，已被開發(fā)出多種保健食品，如黃精藥膳、黃精酒、黃精飲料、黃精酸奶等[6]。隨著大健康產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，黃精保健食品的復(fù)合開發(fā)具有極大的市場(chǎng)潛力。

黃精品種多，適應(yīng)能力強(qiáng)，分布廣[7]。黃精遺傳多樣性保護(hù)與優(yōu)良品種選育可以提高黃精品質(zhì)與產(chǎn)量，促進(jìn)黃精產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展。葉錢等[8]對(duì)多花黃精P.cyrtonema有效成分與主要環(huán)境因子的相關(guān)性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)不同種源的多花黃精化學(xué)成分存在差異，這為進(jìn)一步探討黃精品質(zhì)與環(huán)境因素之間關(guān)系提供了理論依據(jù)。

相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(SRAP)分子標(biāo)記技術(shù)在植物遺傳多樣性方面研究應(yīng)用較多，但在藥用植物應(yīng)用較少，如何首烏[9]。另有研究表明：SRAP 分子技術(shù)能較好地用于鐵皮石斛Dendrobiumofficinale品種親緣關(guān)系的研究[10]，但此技術(shù)尚未見用于黃精遺傳多樣性分析。與之前研究使用的簡(jiǎn)單重復(fù)序列SSR 多態(tài)位點(diǎn)分析方法[11]、多態(tài)性分子標(biāo)記(SCoT)方法[12]和簡(jiǎn)單序列間重復(fù)(ISSR)分子標(biāo)記方法[13]、葉綠體基因聯(lián)合序列分析[14]等技術(shù)相比，SRAP 分子標(biāo)記技術(shù)以基因的開放閱讀框 (open reading frames，ORFs)的特定區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，具有簡(jiǎn)單、可靠、共顯性高等特點(diǎn)[15]。本研究采用SRAP 分析技術(shù)對(duì)華東、西北、華中、西南4 個(gè)居群47 份黃精種質(zhì)資源的遺傳多樣性進(jìn)行研究，為黃精的遺傳多樣性與優(yōu)良品種選育研究提供依據(jù)，以更好地保護(hù)和開發(fā)黃精種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 材料

收集華東居群(浙江省、福建省、安徽省、江西省)，西北居群(河北省、陜西省)，華中居群(湖南省)，西南居群(四川省、貴州省、云南省)的黃精干燥葉片，共47 份種質(zhì)資源，各種質(zhì)資源位置信息如表1所示。樣品采集后置于密封袋中干燥保存，經(jīng)浙江省亞熱帶作物研究所陶正明研究員鑒定后為多花黃精、長(zhǎng)梗黃精P.filipes、黃精P.sibiricum、滇黃精P.kingianum。

表1 黃精種質(zhì)采集信息Table 1 Collected information of Polygonatum spp.

1.2 DNA 提取

將150～450 mg 葉片于液氮下研成粉末，采用杭州萊楓生物科技有限公司的plant DNAzol 試劑，逐一提取DNA 后用核酸蛋白分析儀測(cè)定其質(zhì)量濃度及質(zhì)量分?jǐn)?shù)，均稀釋至20 mg·L-1，于-20 ℃保存待用。

1.3 SRAP-PCR 擴(kuò)增

PCR 反應(yīng)體系參照文獻(xiàn)[16]。具體為：12.5 μL 2×預(yù)混型Taq酶，1.0 μL 濃度為10 mmol·L-1的引物，模板DNA 40～60 ng，補(bǔ)水至25.0 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性94 ℃ 5 min；變性94 ℃ 30 s，退火52℃ 30 s，延伸72 ℃ 2 min，35 個(gè)循環(huán)后結(jié)束。72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。電泳方法：反應(yīng)產(chǎn)物5.0 μL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%聚丙烯酰胺凝膠電泳，5×TBE 緩沖液，150 V 跑膠 40 min，結(jié)束后凝膠成像系統(tǒng)拍照留存。

1.4 數(shù)據(jù)分析

由SRAP-PCR 電泳結(jié)果獲得0/1 矩陣。使用PopGene version 1.32 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)百分率(PPB)、等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s 基因多樣性指數(shù)(H)、Shannon’s 多態(tài)性信息指數(shù)(I)、Nei’s 基因分化系數(shù)(Gst)、居群總基因多樣性(Ht)、居群內(nèi)基因多樣性(Hs)、基因流(Nm)；使用Ntsys-PC 2.1 進(jìn)行非加權(quán)組平均法(UPGMA)聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SRAP-PCR 結(jié)果

88 對(duì)SRAP 引物中篩選出7 對(duì)擴(kuò)增條帶清晰且多態(tài)性明顯的SRAP 引物。引物序列見表2。47 份樣品共檢測(cè)到159 條擴(kuò)增條帶，其中140 條為多態(tài)性條帶，PPB 為88.05%。引物ME4/em3 擴(kuò)增條帶數(shù)最多，但其多態(tài)率最低，為68.29%。而引物ME5/em9、ME6/em4 兩者多態(tài)性條帶數(shù)與擴(kuò)增條帶數(shù)量一致，多態(tài)率為100.00%(表3，圖1)。

圖1 引物ME5/em9 和ME6/em4 對(duì)47 份黃精種質(zhì)資源總DNA 的擴(kuò)增結(jié)果Figure 1 Amplification results of total DNA based on primer ME5/em9 and ME6/em4 from 47 samples of Polygonatum spp.

表2 SRAP 引物序列Table 2 Primer sequences for SRAP

表3 SRAP 引物組合的擴(kuò)增結(jié)果Table 3 Amplification results of combinated SRAP primers

2.2 遺傳多樣性分析

物種水平上黃精PPB 為88.05%，H為0.259 8±0.166 9，I為0.401 0±0.227 2 (表4)，表明黃精有較高的遺傳多樣性和遺傳變異度。居群水平上，Na為1.421 4～1.861 6，平均值為1.600 6；Ne為1.276 1～1.421 2，平均值為1.343 6；H為0.188 1～0.259 1，平均值為0.204 1；I為0.238 2～0.399 4，平均值為0.308 0；PPB 為42.14%～86.16%(表4)，從高到低依次是華東居群、西南居群、華中居群、西北居群，表明華東居群遺傳多樣性豐富，遺傳變異度較高。4 個(gè)黃精居群之間的Ht為0.253 3±0.029 4，Hs為0.204 1±0.020 1，基因分化系數(shù)Gst為0.194 1，即居群間遺傳變異占居群遺傳變異的19.41%，80.59%的遺傳變異在居群內(nèi)進(jìn)行；種群間的遺傳分化系數(shù)基因流Nm為2.075 4，表明居群間存在一定的基因流動(dòng)。

表4 黃精居群遺傳多樣性Table 4 Genetic diversity of Polygonatum spp.

2.3 聚類分析

對(duì)樣品個(gè)體進(jìn)行聚類分析(圖2)，47 份黃精種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)為0.63～0.84。當(dāng)相似系數(shù)為0.63，浙江泰順種質(zhì)資源單獨(dú)聚為一類，表明此種質(zhì)資源與其他黃精種質(zhì)資源的遺傳距離較遠(yuǎn)。當(dāng)相似系數(shù)為0.66，聚為4 類，Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ 類為浙江部分種質(zhì)資源單獨(dú)聚類，表明這些地區(qū)的黃精種質(zhì)資源在親緣關(guān)系上比較接近，可能與引種有關(guān)。當(dāng)相似系數(shù)為0.68 時(shí)，Ⅱ類分聚為2 支，華東地區(qū)的安徽、江西與浙江龍泉、慶元、松陽(yáng)部分種質(zhì)資源以及少數(shù)華中居群聚為一支，另一支為華東地區(qū)的浙江景寧、慶元和松陽(yáng)部分種質(zhì)資源與多數(shù)華中、西南、西北居群聚類，西北居群與西南居群雖然地理差異大，但黃精種質(zhì)資源之間的遺傳距離相差并不大，種質(zhì)資源之間親緣關(guān)系較近，可能與黃精引種栽培有關(guān)。慶元地區(qū)是黃精種植開始較早的地方，因此種質(zhì)引進(jìn)種植比較多樣，所以采集數(shù)量最多。由圖2可以看出，慶元7 份種質(zhì)資源分別聚為4 類：ZJQY8 和ZJQY13與ZJSY15、ZJLQ18～20、AHQM41～42、JXWY43～44 以及HNAH32 聚為一類；ZJQY11與ZJYQ7 聚為一類；ZJQY14 與ZJCA2～3、ZJOH6聚為一類；ZJQY9～10 和ZJQY 12 與部分華東、華中以及西北、西南種質(zhì)資源聚為一大類，遺傳多樣性豐富。

圖2 基于SRAP 的黃精種質(zhì)資源UPGMA 分析聚類圖Figure 2 UPGMA dendrogram of Polygonatum spp.based on SRAP

對(duì)4 個(gè)居群的種質(zhì)資源進(jìn)行聚類，遺傳相似系數(shù)為0.90～0.97 (圖3)。相似系數(shù)為0.90 時(shí)，可分為2 類，華東居群、西南居群與華中居群聚為一類，西北居群?jiǎn)为?dú)為一類。

圖3 基于SRAP 的黃精居群UPGMA 分析聚類圖Figure 3 UPGMA dendrogram of Polygonatum spp.populations based on SRAP

3 討論

遺傳多樣性是生物多樣性的核心，是物種保持進(jìn)化潛能的基本條件，也是優(yōu)良品種選育的主要依據(jù)[17]。本研究采用SRAP 分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)47 份黃精種質(zhì)資源進(jìn)行分析，多態(tài)性比率為88.05%，表明黃精遺傳多樣性豐富，其中華東居群遺傳多樣性相對(duì)其他地區(qū)更豐富一些。推測(cè)有2 種原因：一是與地區(qū)采樣量有關(guān)，二是華東地區(qū)黃精種質(zhì)資源以多花黃精為主。多花黃精遺傳多樣性高于黃精[18]。相對(duì)于SRAP 分子標(biāo)記方法，使用ISSR 方法，對(duì)福建多花黃精與長(zhǎng)梗黃精多態(tài)性比率可達(dá)100%，使用SCoT 分子標(biāo)記技術(shù)，多態(tài)性比率可達(dá)為99.6%[12-13]。從多態(tài)位點(diǎn)來看，另外2 種標(biāo)記方法優(yōu)于SRAP 技術(shù)。物種或者居群的遺傳多樣性越高，對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)能力就越強(qiáng)。在本研究中，華東居群整體上遺傳多樣性高，與朱巧等[19]的研究結(jié)果相反。他們對(duì)60 份黃精種質(zhì)資源進(jìn)行SSR 分子標(biāo)記分析，其結(jié)果為西部地區(qū)黃精種質(zhì)資源遺傳多樣性最高，與黃精屬起源中心為西南地區(qū)染色體基數(shù)較高有關(guān)，但結(jié)合居群聚類結(jié)果，華東與西南遺傳相似系數(shù)最近，且聚為一類。這可能是因?yàn)辄S精自西南引種之后，在華東地區(qū)對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)力較強(qiáng)，保留了一定的遺傳多樣性，所以華東地區(qū)在黃精遺傳多樣性保護(hù)以及優(yōu)良品種選育方面有一定的地理優(yōu)勢(shì)，可充分利用以促進(jìn)黃精產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展。

遺傳分化是指遺傳多樣性在居群內(nèi)和居群間的分布[20]。本研究47 份黃精資源的Gst為0.194 1，表明80.59%的遺傳分化發(fā)生在居群內(nèi)，19.41%的遺傳分化存在于居群間，居群內(nèi)有較高的遺傳分化。這一結(jié)果與籍蓉蓉[21]對(duì)安徽省多花黃精遺傳變異研究結(jié)果一致，居群內(nèi)變異要大于居群間變異?；蛄鞔笥? 時(shí)，表明居群間有一定程度的基因交流。本研究中黃精基因流Nm為 2.075 4，表明不同居群間存在一定的基因交流。黃精可自花授粉，也可借助昆蟲等媒介進(jìn)行異花授粉。對(duì)各種質(zhì)資源的聚類分析發(fā)現(xiàn)：華東居群有較高的遺傳多樣性，這可能與引種其他地區(qū)黃精種質(zhì)資源有關(guān)，引種在同一地區(qū)增加了不同居群間的基因交流，從而提高了黃精遺傳多樣性。

遺傳距離能判斷種質(zhì)資源間遺傳關(guān)系遠(yuǎn)近。云南普洱和貴州銅仁采集的黃精種質(zhì)資源都有最小的遺傳距離，遺傳相似度高，親緣關(guān)系較近，與劉新等[22]研究結(jié)果一致，相同或相近地區(qū)種質(zhì)資源基本聚在一起，可能與黃精無性繁殖有關(guān)。浙江慶元黃精種質(zhì)資源則不同，遺傳距離遠(yuǎn)近不一，具有復(fù)雜的親緣關(guān)系，這與慶元地區(qū)為早期種植黃精的地區(qū)，種質(zhì)資源引進(jìn)種植多樣有關(guān)。浙江一帶黃精種質(zhì)資源有較為復(fù)雜的親緣關(guān)系，這種復(fù)雜性增加了黃精的遺傳多樣性。浙江一帶引種栽培較多，為各種質(zhì)資源之間遺傳交流提供基礎(chǔ)，有助于優(yōu)質(zhì)黃精品種選育。