于曉瑾，張萌，劉采艷，王碩，舒尊鵬，楊連榮（. 黑龍江中醫(yī)藥大學，哈爾濱 50040；. 廣東藥科大學，廣州 50006）

急性心肌缺血（acute myocardial ischemia，AMI）是由冠脈閉塞或血管痙攣而導致心肌缺血、缺氧或壞死的一種疾病[1]。有報道指出，我國心血管疾病的患病率持續(xù)上升，而心肌缺血仍是導致心血管疾病患者死亡的關(guān)鍵因素[2]。目前，其主要治療手段為介入、藥物和外科手術(shù)。中藥因可以通過多靶點多途徑發(fā)揮預防和改善心肌缺血損傷的作用而受到廣泛關(guān)注[3]，在心血管系統(tǒng)保護和防治方面具有較好的療效和應用前景。

刺玫果為薔薇科薔薇屬植物山刺玫（Rosa davuricapall.）的果實，是一種藥食同源的傳統(tǒng)中藥，其含有黃酮類、多酚類、多糖、鞣質(zhì)、皂苷和維生素C等成分，具有抗氧化、抗炎、抗疲勞、抗衰老等作用[4]。研究還發(fā)現(xiàn)，其提取物能有效緩解心肌缺血癥狀[5]。生脈飲主要成分為黨參、麥冬、五味子，用于氣陰兩虧，心悸氣短，脈微自汗。臨床研究表明，生脈飲可有效治療心肌缺血等多種心血管疾病[6]。目前，對刺玫果的研究主要集中在黃酮、皂苷和多糖的提取、抗氧化等生物活性方面，但是未見刺玫果不同極性部位對急性心肌缺血保護作用的報道，刺玫果的抗急性心肌缺血活性成分也尚不清楚。

分子對接技術(shù)是一種中藥的計算機輔助藥物設計手段，可通過計算機編程建模功能模擬藥物分子和受體之間的相互作用方式，并借助PDB、PubChem等數(shù)據(jù)庫實現(xiàn)活性成分的虛擬篩選。目前，該技術(shù)操作簡單，周期短，已經(jīng)逐漸成為虛擬篩選中藥活性組分的重要手段[7]。

因此，本研究通過建立小鼠急性心肌缺血模型，進一步觀察刺玫果不同部位對心肌損傷小鼠的保護作用。同時，采用分子對接技術(shù)虛擬篩選刺玫果中抗心肌缺血的活性成分，以闡明中藥具備多成分、多靶點、多途徑的作用特點，為進一步探討刺玫果對心肌缺血疾病的治療提供參考。

1 材料

1.1 動物

60只SPF級健康昆明小鼠，體質(zhì)量（19±2）g，雌雄各半[黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心，許可證號SCXK（黑）：2018-0004]。將小鼠喂養(yǎng)在通風良好，溫度、濕度適宜的環(huán)境下，每日更換純凈水，喂標準的小鼠飼料，進行7 d適應性飼養(yǎng)。

1.2 試藥

刺玫果采摘于黑龍江省大興安嶺，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學中藥資源與開發(fā)教研室王振月教授鑒定為正品。生脈飲（批號：200919，仲景宛西制藥股份有限公司）。

鹽酸異丙腎上腺素（ISO，批號：2124297，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；還原性谷胱甘肽（GSH）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）、過氧化氫酶（CAT）、α-羥丁酸脫氫酶（α-HBDH）、丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司）；水合氯醛[批號：20210520，福晨（天津）化學試劑有限公司]。

1.3 儀器

BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）；Synergy MX酶標儀（美國BIOTEK公司）。

2 方法

2.1 提取物的制備

將刺玫果粉碎，過40目篩，以70%的乙醇為提取溶劑，料液比為1∶10，在80℃的水浴溫度下回流提取3次，每次2 h，減壓濃縮至稠膏后，加適量蒸餾水分散，依次用乙酸乙酯、正丁醇進行萃取分離，各萃取液與萃余液濃縮，60℃真空干燥箱，即得乙酸乙酯、正丁醇、水（萃余液濃縮）提取部分。灌胃時用蒸餾水制備混懸液。

2.2 分組、給藥與造模

取60只心電圖正常的小鼠，雌雄各半，隨機分為6組，每組10只，分別為空白組、模型組、生脈飲組（4.5 mL·kg－1，陽性對照）、乙酸乙酯組（4.5 g·kg－1）、正丁醇組（4.5 g·kg－1）、水組（4.5 g·kg－1）。空白組與模型組給予等量的蒸餾水，其余各組均灌胃給藥（ig），每日一次，連續(xù)15日。除空白組外，其余各組在第14、15日，在給藥2 h后腹腔注射ISO（10 mg·kg－1），空白組腹腔注射等量氯化鈉溶液。

2.3 小鼠的心電圖檢測

末次給藥后，將各組小鼠以2.5%水合氯醛（10 mL·kg－1）腹腔注射麻醉[8-10]，仰位固定，將針狀電極連接BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)，觀察造模后1、5、10、15、20 min各組小鼠肢體Ⅲ導聯(lián)心電圖變化，記錄各時間點的心率、ST段波幅。

2.4 小鼠血清中生化指標檢測

在末次注射ISO 16 h后眼球取血，離心取血清，按試劑盒說明書檢測各組小鼠血清中α-HBDH、CK、AST、LDH的活力。

2.5 小鼠心肌組織中生化指標檢測

在小鼠眼球取血后，處死小鼠，取心臟，用生理鹽水沖洗除去血污，剔除脂肪組織，濾紙吸干后稱取適量，充分研磨，制得10%心肌組織勻漿，按試劑盒說明書檢測各組小鼠心肌組織中T-SOD、CAT的活力和MDA、GSH的含量。

2.6 軟件及數(shù)據(jù)庫

AutoDockTools軟件；PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）；PDB數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org）；uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org）；CTD數(shù)據(jù)庫（http：// ctdbase.org）。

2.7 配體的選擇

根據(jù)相關(guān)文獻可知[11-18]，刺玫果含有以下10種潛在活性成分，其中黃酮類7 個，三萜2 個，多酚類1 個，并在PubChem數(shù)據(jù)庫中下載這些化合物的3D結(jié)構(gòu)，詳細信息見表1。

表1 刺玫果中 10 個化合物Tab 1 Ten compounds from Rosa davurica pall.

2.8 心肌缺血蛋白受體的選擇

通過CTD數(shù)據(jù)庫和相關(guān)文獻搜集到與心肌缺血相關(guān)的6個靶點蛋白，分別為腫瘤壞死因子（TNF）、白細胞介素-1β（IL-1β）、抗凋亡蛋白（Bcl-2）、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3（CASP3/Caspase-3）、轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGFB1），蛋白激酶B（AKT1）（見表2），在PDB數(shù)據(jù)庫中優(yōu)先選擇具有原配體且分辨率好的人源受體晶體結(jié)構(gòu)，下載三維結(jié)構(gòu)。

表2 心肌缺血相關(guān)的靶點蛋白Tab 2 Target proteins associated with myocardial ischemia

2.9 分子對接

首先采用PyMOL軟件除去蛋白分子的原配體與水分子，其次采用AutoDockTools進行配體與靶點蛋白的兩兩對接，獲取結(jié)合能值，對接結(jié)果采用PyMOL軟件進行可視化。同時，為了對接方法的可靠性與對接參數(shù)的合理性，計算原配體與對接構(gòu)象的均方根偏差（root mean square deviation，RMSD），通常認為RMSD在2 ?范圍之內(nèi)。

2.10 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0軟件進行處理分析，結(jié)果以±s表示，所有數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，方差齊時組間比較采用單因素方差分析和LSD兩兩比較，方差不齊時采用Tamhane’s T2檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 刺玫果不同部位對小鼠心電圖的影響

除空白組外，其余組小鼠注射ISO，模型組小鼠ST段明顯下移（為急性心肌缺血造模成功標志[19]），見圖1。由圖2可知，與空白組相比，各組心率開始明顯上升，其中，模型組心率于造模1～10 min顯著上升。與模型組相比，給藥后各組心率都有明顯降低，其中，乙酸乙酯組、正丁醇組和水組于造模10 min 時心率顯著降低（P＜0.01）。由圖3可知，與空白組相比，各組ST段明顯下移，其中模型組ST段在1～20 min內(nèi)極顯著下移（P＜0.01），提示造模成功。與模型組相比，給藥組在1～20 min內(nèi)均能顯著抑制急性心肌缺血小鼠ST段的下移。

圖1 刺玫果不同部位的心電圖Fig 1 Electrocardiogram of different extracts of Rosa davurica pall.

圖2 刺玫果不同部位對急性心肌缺血小鼠心率的影響Fig 2 Effect of different extracts of Rosa davurica pall. on the heart rate of mice with acute myocardial ischemia

圖3 刺玫果不同部位對急性心肌缺血小鼠ST段的影響Fig 3 Effect of different extracts of Rosa davurica pall. on ST segment in mice with acute myocardial ischemia

3.2 刺玫果不同部位對小鼠血清中生化指標的影響

由圖4可知，與空白組相比，模型組小鼠血清中α-HBDH、CK、AST和LDH水平均顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，各給藥組都能顯著改善α-HBDH、CK、AST水平的異常情況，此外，乙酸乙酯組和正丁醇組還能明顯降低LDH的水平。

圖4 刺玫果不同提取部位對急性心肌缺血小鼠血清心肌酶的影響Fig 4 Effect of different extracts of Rosa davurica pall. on serum myocardial enzymes in mice with acute myocardial ischemia

3.3 刺玫果不同部位對小鼠心肌組織中生化指標的影響

由圖5可知，與空白組相比，模型組小鼠心肌組織中T-SOD活力、GSH含量和CAT活力顯著降低（P＜0.01），MDA含量明顯提高（P＜0.01）。與模型組相比，乙酸乙酯組、正丁醇組和水組小鼠心肌組織中總SOD和CAT活力明顯增強，MDA含量也明顯減少，此外，乙酸乙酯組與正丁醇組心肌組織中GSH含量明顯增多。

圖5 刺玫果不同提取部位對急性心肌缺血小鼠心肌組織中抗氧化因子的影響Fig 5 Effect of different extracts of Rosa davurica pall. on antioxidant factors in myocardial tissue of mice with acute myocardial ischemia

3.4 分子對接實驗結(jié)果

將6 個靶點蛋白的原有配體剔除，然后在對接到原活性位點上，計算原配體與對接后配體的RMSD，見表3，結(jié)果均小于2，說明所對接的分子構(gòu)象能夠較好地重現(xiàn)配體與蛋白的結(jié)合模式，對接參數(shù)設置合理。

表3 各靶點重新對接后與原靶點構(gòu)象的 RMSDTab 3 RMSD of each target conformation after re-docking with the original target

應用AutoDockTools軟件進行蛋白與藥物分子的兩兩對接，對接結(jié)合能量見圖6。其中，橫坐標為相關(guān)靶點，縱坐標為刺玫果主要活性成分。顏色越深表示結(jié)合能越低，受體與配體結(jié)合得越好。結(jié)果顯示，所有分子與靶點蛋白的最低結(jié)合能在－8.69～0.5 kcal·mol－1，當結(jié)合能小于0，表明受體與配體可以自發(fā)結(jié)合，與靶點蛋白之間均具有良好的結(jié)合活性。此外，基于個案排秩加法得到10 個成分對接綜合得分，從大到小依次為齊墩果酸、熊果酸、木犀草素、槲皮素、原花青素B2、沒食子酸、金絲桃苷、橙皮苷、銀椴苷、蘆丁。

圖6 分子對接熱圖Fig 6 Molecular docking heat-map

為更清晰地了解化合物與蛋白的對接情況，選取6個結(jié)合自由能較低的結(jié)果進行可視化處理。由圖7A可知，熊果酸與TNF中的氨基酸殘基CYS69B、LYS112B形成氫鍵相互作用，與TRP114B、CYS69B形成疏水性相互作用；由圖7B可知，齊墩果酸與IL-1β中的氨基酸殘基LYS165C形成氫鍵相互作用，與LYS153C形成疏水性相互作用；由圖7C可知，橙皮苷與Bcl-2中的氨基酸殘基TYR16A、SER22A、TYR19A、GLN23A、ASP99A、ARG103A形成氫鍵相互作用，與LYS20A、SER102A形成疏水性相互作用；由圖7D可知，原花青素B2與CASP3中的氨基酸殘基LYS260B、GLU248B、ASP990D、GLU246B形成氫鍵相互作用，與GLU246B、PHE247B形成疏水性相互作用；由圖7E可知，齊墩果酸與TGFB1中的氨基酸殘基HIS289B形成氫鍵相互作用，與TYR288B、ARG56A、PRO334B、LEU335B、ILE354B形成疏水性相互作用；由圖7F可知，槲皮素與AKT1中的氨基酸殘基THR450A、PHE150A、TYR152A、ILE447A形成氫鍵相互作用，與TYR152A形成疏水性相互作用。

圖7 主要活性成分與靶點蛋白的分子對接模型Fig 7 Molecular docking model of the main active ingredients and target proteins

4 討論

心肌中通常存在多種心肌酶，其中包括α-HBDH、CK、AST、LDH等，通常將這4種酶統(tǒng)稱為心肌酶譜，可以間接反映心肌損傷程度。目前大量研究表明[20]，心肌缺血會導致抗氧化與氧化體系失衡，產(chǎn)生大量活性氧（ROS）物質(zhì)，導致心肌氧化應激損傷，SOD、GSH、CAT是體內(nèi)重要的抗氧化酶體系，可清除體內(nèi)過多的氧自由基，而MDA是自由基攻擊機體的產(chǎn)物，其含量反映機體過氧化的程度。因此，測量以上指標有助于評價抗心肌缺血藥物的作用效果。本研究結(jié)果顯示，各給藥組均可降低血清中α-HBDH、CK、AST的活性、降低心肌組織中MDA的含量，升高心肌組織中總SOD和CAT活力，而乙酸乙酯組和正丁醇組小鼠血清中LDH的水平明顯減少，心肌中GSH的活性升高，且乙酸乙酯組小鼠的大多生化指標與對照組無顯著差異。因此對急性心肌缺血小鼠的保護作用從強到弱依次為乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位。

心肌缺血的發(fā)生機制比較復雜，與自由基損傷、鈣離子超載、血管內(nèi)皮細胞損傷和細胞凋亡等諸多因素有關(guān)[21]。有研究表明，Bcl-2、Caspase-3、TNF、IL-1β、TGFB1與AKT1蛋白都與心肌缺血都有著密切聯(lián)系[22-25]。當藥物進行預保護后，其有效成分與蛋白進行結(jié)合從而調(diào)控相關(guān)蛋白的表達，進一步減輕急性心肌缺血損傷。從分子對接綜合結(jié)果來看，這10個成分均是抗急性心肌缺血活性成分，其中，齊墩果酸和熊果酸對接結(jié)果優(yōu)良，兩者為同分異構(gòu)體，可以通過其抗氧化、抗炎、抗凋亡活性改善心肌損傷，這與文獻報道符合[26-27]。

相關(guān)研究顯示，刺玫果乙酸乙酯相、正丁醇相與水相相比，槲皮素、齊墩果酸、熊果酸、原花青素B2成分含量高[14]，推測這是刺玫果乙酸乙酯部位和正丁醇部位抗急性心肌缺血作用更好的原因之一；而乙酸乙酯部位與正丁醇部位相比，其含有綜合對接結(jié)果較佳的金絲桃苷，這也可能是乙酸乙酯部位對急性心肌缺血小鼠療效強的原因之一。

綜上所述，對ISO所誘導的小鼠急性心肌缺血損傷的影響中，刺玫果乙酸乙酯部位和正丁醇部位的保護作用優(yōu)于水部位。同時，本實驗利用分子對接技術(shù)篩選出刺玫果中抗急性心肌缺血活性成分，闡明刺玫果通過多成分-多靶點-多途徑發(fā)揮保護作用。分子對接可以實現(xiàn)中藥成分的快速篩選，節(jié)省時間。但該技術(shù)具有局限性，不能完全實現(xiàn)體內(nèi)藥物分子與受體蛋白結(jié)合的模型，因此，未來的研究方向會探究刺玫果防治急性心肌缺血的作用機制，以進一步驗證分子對接結(jié)果。