熊曉莉，陸美霞，施林峰，鐘凌云，葉喜德（江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南昌 330004）

遠志為遠志科植物遠志Polygala tenuifoliaWilld.或卵葉遠志Polygala sibiricaL.的干燥根[1]，具有安神益智之功，臨床上多用于心腎不交之心神不寧、失眠健忘等證[2]。遠志生品對機體刺激性大，服后易“戟人咽喉”。遠志經(jīng)炮制后可減少其刺激性，緩解藥性，達到減毒增效之目的[3]，2020年版《中國藥典》收載的遠志炮制品為甘草制品，是目前常用炮制品，而炆遠志為江西“建昌幫”特色炮制品，該法系指將遠志低溫長時間加熱，并加入輔料甘草汁，在微火慢蒸過程中，借助輔料與藥物成分之間的相互作用，使藥物化學(xué)成分發(fā)生變化，從而影響藥效。臨床經(jīng)驗證明，遠志經(jīng)炆制后可增強藥物療效，并使其保留“原汁原味、醇香濃郁、厚而不膩”等特征[4]?，F(xiàn)代研究表明，遠志主含皂苷類、寡糖酯類、酮類等成分，其中寡糖酯類成分是其主要有效活性成分之一[5-6]。課題組前期研究了遠志炆制前后成分的變化，發(fā)現(xiàn)炆制后遠志中寡糖酯類成分含量均有所下降[7]。在對比分析遠志生品與炆制品差異時發(fā)現(xiàn)，遠志中所含西伯利亞遠志糖A5、西伯利亞遠志糖A6、3，6'-二芥子?；崽?、黃花遠志素A、細(xì)葉遠志苷A等成分是其主要差異性成分[8]。但前期并未對這些主要差異性成分開展體內(nèi)過程研究，致使遠志經(jīng)炆制后藥效增強這一理論，仍缺乏科學(xué)數(shù)據(jù)支撐?；诖?，本研究以“建昌幫”炆遠志為對象，從藥代動力學(xué)和組織分布角度，運用UPLC-MS/MS分析技術(shù)，研究遠志炮制前后西伯利亞遠志糖A5、西伯利亞遠志糖A6、細(xì)葉遠志苷A、3，6'-二芥子?；崽堑?種寡糖酯類成分在大鼠血漿和組織中的濃度分布情況，擬通過對比分析炆制前后血漿和組織中各成分濃度差異，為遠志炆制后藥效增強理論提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料

1.1 儀器

島津 LC-30A 型超高效液相色譜儀（日本Shimadzu 公司）；QQQ4500型串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀（美國 AB Sciex 公司），F(xiàn)A1004N萬分之一電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；AE240十萬分之一電子天平（美國 Mettler-Toledo 公司）；YF-111B高速中藥粉碎機（瑞安市永歷制藥機械有限公司）；OSB-2200XU旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛郎儀器有限公司）；XW-80AXUA旋渦混合器（上海精科實業(yè)有限公司）；Neofuge 13R 型高速冷凍離心機（上海力申科學(xué)儀器公司）；ANPEL DC12氮吹儀（上海安譜科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試藥

遠志藥材購于山西漢廣中藥材加工有限公司，產(chǎn)地為山西運城；甘草購于安徽匯仁堂中藥飲片有限公司，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定室劉應(yīng)蛟副教授鑒定，分別為遠志科植物遠志Polygala tenuifoliaWilld.的干燥根和豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根及根莖。西伯利亞遠志糖A5對照品（批號：MUST-21052704，純度：93.91%）、西伯利亞遠志糖A6對照品（批號：MUST-20082523，純度：96.42%）（成都曼思特生物科技有限公司）；細(xì)葉遠志苷A對照品（批號：wkq20073005）、3，6'-二芥子?；崽菍φ掌罚ㄅ枺簑kq21031112）、蘆丁對照品（批號：wkq20030203）（四川省維克奇生物科技有限公司，純度均≥98%）。水為屈臣氏純凈水，乙腈、甲醇、甲酸為質(zhì)譜純，其他試劑均為分析純。

1.3 動物

SPF 級雄性 SD大鼠，體質(zhì)量為 220～250 g[濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，許可證號為SCXK（魯）20190003]。大鼠在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下[溫度（23±1）℃，濕度（55±5）%]適應(yīng)性喂養(yǎng) 7 d，給藥前禁食12 h，自由飲水。本研究涉及的動物實驗經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)研究倫理委員會審查批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：JZLLSC20220493）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相：0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）；梯度洗脫（0～3 min，10%～95%B；3～4 min，95%B；4～4.1 min，95%～10%B；4.1～6 min，10%B）；流速 0.2 mL·min－1；進樣體積 1 μL；柱溫 40℃。

2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），采用負(fù)離子模式檢測，掃描模式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），噴霧電壓（IS）4500 V，離子源溫度（TEM）450℃，離子源氣壓1（GS1）45 kPa，離子源氣壓2（GS2）50 kPa，氣簾氣（CUR）10 psi，碰撞氣（CAD）9 psi。其他特征參數(shù)見表1。

表1 各指標(biāo)成分及內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)Tab 1 Mass spectrum parameters of each index component and internal standard

2.3 受試藥物的制備

2.3.1 炮制品的制備 生遠志按《中國藥典》2020年版一部炮制方法制備。炆遠志按《江西省中藥飲片炮制規(guī)范》（2008年版）[9]炮制方法制備：取凈甘草，切段，與凈遠志攪勻，置炆藥壇內(nèi)，加適量40℃溫水（以平藥面為度）；壇四周堆適量谷糠，點火，液面保持沸騰炆制5 h，起壇，撿去甘草，干燥。每100 kg 遠志，用甘草6 kg。

2.3.2 遠志乙醇提取物的制備 取生遠志、炆遠志各50 g，粉碎后過三號篩，先后加10倍量、8倍量60% 的乙醇回流提取2次，每次提取1 h，濾過，合并濾液，濾液水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得無醇味浸膏，于－4℃保存。使用前加水至100 mL，至生藥含量為0.5 g·mL－1。

2.4 給藥和樣品的采集

2.4.1 血漿樣品 將健康雄性 SD 大鼠 12 只，隨機分成兩組（生品組 S1～S6，炆制組W1～W6），每組 6只。給藥前 12 h 禁食不禁水，按劑量 10 mL·kg－1灌胃給予生遠志、炆遠志提取物，于給藥前及給藥后 5、10、20、30、45 min和1、1.5、2、3、5、8、12 h 自眼底靜脈叢取血，每次 0.3 mL，置于1.5 mL 肝素鈉 EP 管中，3500 r·min－1離心15 min，分離上層血漿，于－80℃冷凍保存。

2.4.2 組織樣品 將健康雄性 SD 大鼠 48只，隨機分成兩組（生品組 S1～S24，炆制組W1～W24），每組 24只，給藥前 12 h 禁食不禁水。按劑量 10 mL·kg－1灌胃給予生遠志、炆遠志提取物，于給藥前及給藥后 0.5、2、5 h（每個時間點各 6只）4個時間點斷頸處死大鼠，立即解剖采集心、肝、肺、腎、小腸、腦等組織。用冰生理鹽水洗凈，濾紙沾干，置于EP管中，于－80℃冷凍保存。

2.5 樣品的處理

2.5.1 血漿樣品 取100 μL大鼠血漿樣品，置于1.5 mL 離心管中，加蘆丁內(nèi)標(biāo)溶液 10 μL，旋渦混合3 min，再加入600 μL甲醇，渦旋震搖3 min，13 200 r·min－1離心 10 min，取上清液置于EP管中，35℃氮氣吹干，殘渣加100 μL甲醇復(fù)溶，漩渦震蕩3 min，3500 r·min－1離心5 min，取上清液1 μL進樣。

2.5.2 組織樣品 取出大鼠組織樣品，解凍后將各組織剪碎，混合均勻。精密稱取各組織置于EP管中，按組織-生理鹽水1∶3的比例加冰生理鹽水，用勻漿機制成勻漿。取上層組織勻漿100 μL，按“2.5.1”項下血漿樣品同法處理。

2.6 對照品溶液的制備

2.6.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取西伯利亞遠志糖A5、西伯利亞遠志糖A6、細(xì)葉遠志苷A、3，6'-二芥子酰基蔗糖對照品適量，加甲醇制成西伯利亞遠志糖A5、西伯利亞遠志糖A6、細(xì)葉遠志苷A均為9.0 μg·mL－1，3，6'-二芥子?；崽菫?.88 μg·mL－1的混合對照品溶液，并逐級稀釋，制得系列溶液。以低（49.9、50.0、49.9、16.0 μg·L－1）、中（999.2、999.6、999.2、320.0 μg·L－1）、高（8992.8、8996.4、8992.8、2880 μg·L－1）質(zhì)量濃度的對照品溶液，用于藥代動力學(xué)研究。加甲醇制成西伯利亞遠志糖A5、西伯利亞遠志糖A6均為1.0 μg·mL－1，細(xì)葉遠志苷A為2 μg·mL－1，3，6'-二芥子?；崽菫?.6 μg·mL－1的混合對照品溶液，并逐級稀釋，制得系列溶液，以低（10.1、10.0、20.0、5.9 μg·L－1）、中（50.4、49.9、100.0、29.6 μg·L－1）、高（504.0、498.8、1000.1、296.2 μg·L－1）質(zhì)量濃度的對照品溶液，用于組織分布研究。

2.6.2 內(nèi)標(biāo)溶液的制備 精密稱取蘆丁適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為6.4 μg·mL－1的蘆丁內(nèi)標(biāo)溶液。

2.7 方法學(xué)考察

2.7.1 專屬性考察 取大鼠空白血漿和肝組織勻漿（作為組織樣品分析的代表）、加對照品和內(nèi)標(biāo)溶液的空白大鼠血漿和肝組織勻漿、給藥30 min后的大鼠血漿和肝組織勻漿，按“2.5”項下方法處理，分析得空白血漿和肝組織勻漿、血漿和肝組織樣品圖譜，見圖1。

圖1 各指標(biāo)成分及提取離子流 UPLC-MS/MS 圖Fig 1 Components and extraction ion current UPLC-MS/MS

2.7.2 線性范圍及定量限 取100 μL空白大鼠血漿和心、肝、肺、腎、腦、腸組織勻漿，分別加入“2.6.1”項下混合對照品系列溶液，按“2.5”項下方法處理，配制成系列濃度的血漿和組織樣品，以指標(biāo)成分的血藥濃度為橫坐標(biāo)（X，μg·L－1），以指標(biāo)成分與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比為縱坐標(biāo)（Y），用加權(quán)（1/χ2）最小二乘法進行線性回歸，得到相應(yīng)的線性回歸方程。結(jié)果表明，各待測成分在相應(yīng)范圍內(nèi)線性關(guān)系較好，符合生物樣品分析要求，結(jié)果見表2。

表2 各指標(biāo)成分在大鼠血漿和組織中的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍Tab 2 Standard curves and linear ranges for each indicator component in the rat plasma and tissues

2.7.3 精密度和準(zhǔn)確度 取100 μL空白大鼠血漿和肝組織勻漿，分別加入“2.6.1”項下低、中、高3個質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，每個濃度取6份，按“2.5”項下方法處理，配制藥代動力學(xué)和組織分布質(zhì)控（QC）樣品，連續(xù)測定3 d。以各分析批內(nèi)隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計算日內(nèi)和日間精密度（RSD）及準(zhǔn)確度（RE）。各指標(biāo)成分在血漿中日內(nèi)RSD≤8%，日間RSD≤9%，RE為－9.57%～9.64%；在肝組織中日內(nèi)RSD≤11%，日間RSD≤13%，RE為－10.34%～11.28%。結(jié)果均＜15%，表明該法精密度和準(zhǔn)確度良好，符合生物樣品分析要求。

2.7.4 殘留效應(yīng)考察 取100 μL空白大鼠血漿和肝組織勻漿，分別加入“2.6.1”項下高質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，每個濃度取6份，按“2.5”項下方法處理，配制藥代動力學(xué)和組織分布QC樣品，進樣分析；取空白大鼠血漿和肝組織樣品，不加內(nèi)標(biāo)溶液，同法操作。各指標(biāo)成分和內(nèi)標(biāo)溶液的殘留峰面積分別小于定量下限質(zhì)量濃度QC血漿和肝組織對應(yīng)成分峰面積的15%、5%，表明該法各指標(biāo)殘留效應(yīng)符合生物樣品分析要求。

2.7.5 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) 取100 μL空白大鼠血漿和肝組織勻漿，分別加入“2.6.1”項下低、中、高3個質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，每個濃度取6份，按“2.5”項下方法處理，得不同濃度的藥代動力學(xué)和組織分布QC樣品，進樣測得各色譜峰面積A；取空白血漿和肝組織勻漿，按“2.5”項下方法沉淀蛋白后，取上清液分別加入低、中、高質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，氮氣吹干溶劑，復(fù)溶后同法測定，得各色譜峰面積B；取“2.6.1”項下低、中、高3個質(zhì)量濃度的混合對照品溶液加入內(nèi)標(biāo)溶液，同法操作，得各色譜峰面積C；提取回收率＝A/B×100%，基質(zhì)效應(yīng)＝B/C×100%。各指標(biāo)成分在血漿中提取回收率為84.64%～97.69%，RSD＜6%，基質(zhì)效應(yīng)為84.77%～104.51%，RSD＜5%；各指標(biāo)成分在肝組織中提取回收率為86.21%～103.36%，RSD＜7%，基質(zhì)效應(yīng)為83.52%～107.48%，RSD＜6%，符合生物樣品分析要求。

2.7.6 穩(wěn)定性實驗 取100 μL空白大鼠血漿和肝組織勻漿，分別加入“2.6.1”項下低、中、高3個質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，每個濃度取6份，并置于以下4種條件下考察遠志中4種指標(biāo)成分在大鼠血漿和肝組織中的穩(wěn)定性：血漿和肝組織勻漿樣品室溫放置4 h后，按“2.5”項下方法處理再測定；血漿和肝組織勻漿樣品按“2.5”項下方法處理后，在室溫放置24 h后再測定；血漿和肝組織勻漿樣品－80℃放置3周及－80℃ 凍融循環(huán)3次后，按“2.5”項下方法處理再測定。結(jié)果表明，各指標(biāo)成分在4種考察條件下的RSD均在±15% 以內(nèi)，符合生物樣品分析要求。

2.8 藥代動力學(xué)研究

大鼠灌胃生遠志提取物、炆遠志提取物后，采用“2.4”項下方法隔點取血，再按“2.5.1”項下方法處理。以血藥濃度為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)采用 GraphPad Prism 7軟件繪制濃度-時間曲線，見圖2。采用DAS 3.2.1軟件計算藥代動力學(xué)參數(shù)。運用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析，見表3。結(jié)果表明，與生遠志組相比，炆遠志組中西伯利亞遠志糖A5、西伯利亞遠志糖A6、3，6'-二芥子?；崽堑乃幋鷮W(xué)動力參數(shù)Cmax、AUC0～12均顯著增加（P＜0.05），細(xì)葉遠志苷A的Cmax、AUC0～12有增加趨勢。炆遠志中4種寡糖酯類成分的Vz/F和CLz/F較生遠志明顯降低（P＜0.05）。

圖2 生遠志、炆遠志中4種成分的濃度-時間曲線（n＝6，x ±s）Fig 2 Time curves of 4 constituents in Polygala tenuifolia and Licoricesimmered Polygala tenuifolia（n＝6，x±s）

表3 4種成分的藥代動力學(xué)參數(shù)(n＝6，x±s)Tab 3 Pharmacokinetic parameters of 4 components (n＝6，x±s)

2.9 組織分布研究

大鼠灌胃生遠志提取物、炆遠志提取物后，采用“2.4”項下方法在4個時間點取組織，再按“2.5.2”項下方法處理，樣品進樣分析。給藥前，4種寡糖酯類成分在大鼠各組織中均未檢測到，同一個化合物在不同器官的4個時間點濃度分布見表4。結(jié)果表明，與生遠志組相比，炆遠志組中西伯利亞遠志糖A5、西伯利亞遠志糖A6、細(xì)葉遠志苷A、3，6'-二芥子酰基蔗糖的組織分布濃度整體均增大。

表4 4種成分在不同組織中的濃度(x±s，n＝6，μg·L－1)Tab 4 Tissue distribution concentration of 4 components (x ±s，n＝6，μg·L－1)

3 討論

前期預(yù)實驗采用正負(fù)離子兩種模式進行成分檢測，發(fā)現(xiàn)西伯利亞遠志糖A5、西伯利亞遠志糖A6、細(xì)葉遠志苷A、3，6'-二芥子酰基蔗糖在負(fù)離子模式下靈敏度更高，響應(yīng)強度更大，這與文獻報道相吻合[10]，且負(fù)離子模式檢測時間短、經(jīng)濟，因此，選擇負(fù)離子模式進行定量分析。《中國藥典》2020年版一部規(guī)定遠志對人最大給藥量換算成大鼠為0.9 g·kg－1，結(jié)合文獻[11]，按遠志生藥量5 g·kg－1大鼠體質(zhì)量灌胃給藥。

本文首次采用UPLC-MS/MS 測定炆遠志與生遠志中西伯利亞遠志糖A5、西伯利亞遠志糖A6、細(xì)葉遠志苷A、3，6'-二芥子?；崽?種寡糖酯類成分在大鼠血液中的藥代動力學(xué)參數(shù)。前期研究表明，與生遠志相比，炆遠志中大多數(shù)成分含量下降[7]。

根據(jù)血漿藥代動力學(xué)的結(jié)果，選取了給藥前及給藥后0.5、2、5 h進行組織分布研究，分別代表吸收相、分布相，4種成分在各組織中的濃度由高到低為2 h＞0.5 h＞5 h，再根據(jù)4種成分的tmax均為2 h左右，推測這些成分在組織分布中的tmax為2.5～3 h。與生遠志組相比，炆遠志組中4種成分在6個組織中的濃度整體呈增加趨勢。西伯利亞遠志糖A5和細(xì)葉遠志苷A在心、肝、肺、腎、腦和小腸6個組織中都有分布，表明這兩個成分在組織中分布廣泛；西伯利亞遠志糖A6在肝、肺、腎、小腸4個組織中有分布，3，6'-二芥子?；崽窃诟巍⒛I、小腸中有分布，這兩個成分在心、腦中都沒有檢測到，且在組織中濃度都不高，可能跟這兩個成分入血濃度不高，再經(jīng)過肝腸循環(huán)，大部分被代謝了有關(guān)。4種成分整體在小腸中濃度最高，這可能與灌胃給藥后，藥物經(jīng)過小腸吸收進入體內(nèi)有關(guān)[12]，其次在腎、肝、肺中濃度也較高，這與遠志入腎、肺經(jīng)吻合，在腦和心中濃度低，表明這4種成分的原形不易透過血腦屏障。有文獻報道，遠志中寡糖酯類成分不穩(wěn)定，酯鍵易水解轉(zhuǎn)化為次級苷和苷元[13-14]，因此，可能是這4種寡糖酯的代謝產(chǎn)物在腦部發(fā)揮藥效，但在心中濃度低與遠志入心經(jīng)不符，后期需進一步研究。

綜上所述，與生品相比，遠志炆制后可促進西伯利亞遠志糖A5、西伯利亞遠志糖A6、細(xì)葉遠志苷A和3，6'-二芥子?；崽?種寡糖酯類成分在大鼠體內(nèi)的吸收和分布，使其血藥濃度增加，組織分布濃度增加，提高其生物利用度。此外，文獻研究表明遠志炆制后可提高學(xué)習(xí)記憶能力，增強安神益智作用[15]，其中寡糖酯類成分是遠志發(fā)揮安神益智藥效的主要成分之一[16-18]。因此，推測遠志炆制后藥效增強可能與西伯利亞遠志糖A5、西伯利亞遠志糖A6、3，6'-二芥子?；崽?、細(xì)葉遠志苷A 4種有效成分的吸收和分布增強有關(guān)。本研究可為深入研究“建昌幫”特色飲片炆遠志炮制機制提供數(shù)據(jù)支撐，但遠志炆制后有效成分在體內(nèi)吸收與分布作用增強的原因還需深入研究。