程永芳，段慧明（廣西中醫(yī)藥大學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，廣西中醫(yī)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530200）

肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是臨床上較為常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率和病死率高。美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)發(fā)布的癌癥統(tǒng)計(jì)分析報(bào)告顯示，全球HCC發(fā)病率和病死率在惡性腫瘤中分別排第6位和第3位，主要分布在亞洲和非洲等[1-2]。由于肝癌早期不易被察覺(jué)，其轉(zhuǎn)移快且隱蔽，大多數(shù)肝癌患者確診時(shí)已到中晚期，并且我國(guó)肝癌患者大多在確診時(shí)還伴隨有嚴(yán)重的肝硬化，目前的多種治療手段包括手術(shù)放化療、靶向治療、免疫治療甚至聯(lián)合治療均未能改變其預(yù)后差、5年生存率低等特征。外泌體研究的興起，深入研究外泌體在肝癌中的作用機(jī)制，將為肝癌的早期診斷、治療和預(yù)后的評(píng)估開(kāi)辟新的途徑。

外泌體是一種幾乎所有類(lèi)型細(xì)胞（包括腫瘤細(xì)胞）都會(huì)分泌的，直徑為30～100 nm的小囊泡[3]。它們富含來(lái)自親代細(xì)胞的選擇性蛋白質(zhì)和核酸，具有標(biāo)志蛋白（CD81、CD9、CD63、TSG101、ALIX等）[4]，可傳遞關(guān)鍵成分，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞間通信的潛力，并且是通過(guò)“運(yùn)輸”分子來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞過(guò)程的關(guān)鍵信使。外泌體可以傳遞蛋白質(zhì)、可溶性因子，最重要的是可以傳遞調(diào)節(jié)受體細(xì)胞蛋白表達(dá)的RNA和microRNAs（miRNAs）[5]。這對(duì)于機(jī)體的正常穩(wěn)態(tài)和各種疾病包括腫瘤的發(fā)病機(jī)制都是非常重要的[6]。腫瘤來(lái)源的外泌體可能有助于腫瘤微環(huán)境的募集和重編程以形成促致瘤的土壤。腫瘤來(lái)源的外泌體可改變局部和全身微環(huán)境，通過(guò)將其內(nèi)容物（如EGFRVIII、KRAS、lncRNAs或miRNAs等）轉(zhuǎn)移到其他腫瘤細(xì)胞以誘導(dǎo)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)變，遷移和侵襲或受體細(xì)胞耐藥，從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移并可通過(guò)TGF-β1或其他配體的分泌抑制腫瘤細(xì)胞凋亡[7-10]，本研究通過(guò)對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞系外泌體的分離及分析，揭示外泌體在肝癌進(jìn)展中的作用。

1 材料

1.1 細(xì)胞

HepG2細(xì)胞株，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 試藥

DMEM高糖培養(yǎng)基（凱基生物）；胎牛血清（四季青）；兔CD9、TSG101、ALIX單克隆抗體及HRP-山羊抗兔二抗（Servicebio）；胰蛋白酶（Solarbio）；PBS緩沖液（凱基生物）；CCK-8試劑盒（Beyotime）；Caspase3/7細(xì)胞凋亡活性檢測(cè)試劑盒“綠色熒光”（上海生工）；BCA蛋白定量試劑盒（南京建成）。

1.3 儀器

MCO-18AIC二氧化碳培養(yǎng)箱（日本PHCbi公司）；CP100NX超速冷凍離心機(jī)、HT7800/HT7700透射電子顯微鏡（日本Hitachi公司）；Multiskan Sky全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher公司）；Infinite M200Pro Nanoquant光吸收微孔板熒光檢測(cè)儀（瑞士TECAN公司）；DYCZ-24DN雙垂直電泳儀、DYCZ-40D轉(zhuǎn)印電泳儀（北京六一儀器廠(chǎng)）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將HepG2肝癌細(xì)胞置于DMEM高糖培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）中。種板24 h后，換成含1%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基[11]，將細(xì)胞置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

2.2 外泌體提取

待細(xì)胞狀態(tài)良好且生長(zhǎng)至1×107～1×108，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液用以提取外泌體。4℃，300×g離心10 min，去除細(xì)胞污染。吸取上清液于2000×g離心10 min，去除死細(xì)胞。吸取上清液于10 000×g離心30 min，去除細(xì)胞碎片，吸取上清液于100 000×g超速離心90 min，去除上清液，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌后于100 000×g超速離心90 min，沉淀即為外泌體[12]。PBS重懸，BCA法測(cè)定蛋白濃度，－80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 電鏡觀(guān)察

用移液槍吸取外泌體20 μL滴在碳膜銅網(wǎng)放置5 min，用濾紙吸去多余液體。將2% 磷鎢酸滴在碳膜銅網(wǎng)上放置2 min，用濾紙吸去多余液體，室溫干燥。透射電子顯微鏡下觀(guān)察，采集圖像分析。

2.4 外泌體定性檢測(cè)

取出凍存的外泌體，室溫下冰上放置融化3 min，取出10 μL分離出的外泌體，加入5 μL含有蛋白酶抑制劑的RIPA細(xì)胞裂解液，振蕩混勻，室溫放置10 min，4℃下20 000×g離心20 min。上清液為蛋白裂解液，取10 μL裂解液加入5×loading buffer，95℃加熱5 min，冷卻，經(jīng)12%SDS-PAGE 150 V恒壓跑膠1.5 h，15 V恒壓轉(zhuǎn)膜，于室溫下脫色搖床上用5%的脫脂牛奶（0.5%TBST配）封閉1 h，加入1∶1000稀釋兔抗人CD9、TSG101、ALIX單克隆抗體，4℃搖床孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，每次5 min，將二抗用TBST稀釋3000倍，室溫下孵育30 min后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗3次，每次5 min，化學(xué)發(fā)光顯色，凝膠圖像分析。

2.5 肝癌細(xì)胞增殖檢測(cè)（CCK-8法）

收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種至96孔板中（2500細(xì)胞/孔），種板24 h后，換成含1%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，加入外泌體（300 μg·mL－1）10 μL共孵育作為外泌體組，用等體積的PBS處理的細(xì)胞作為對(duì)照組，沒(méi)有細(xì)胞的小孔加入等體積PBS作空白組。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞培養(yǎng)24～72 h后，每孔加10 μL CCK-8溶液，再孵育1 h，450 nm處測(cè)定吸光度值。

2.6 熒光法檢測(cè)外泌體對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種至96孔板中（2250細(xì)胞/孔），種板24 h后，換成含1%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，加入外泌體（206 μg·mL－1）20 μL共孵育48 h作為外泌體組。對(duì)照組未作共培養(yǎng)處理，用Caspase3/7細(xì)胞凋亡活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況（酶標(biāo)儀檢測(cè)Ex/Em＝490/525 nm處的熒光強(qiáng)度）。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用Excel對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析作圖，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 外泌體的形態(tài)觀(guān)察

用透射電子顯微鏡觀(guān)察外泌體的形態(tài)，一般為圓形或橢圓形膜性囊泡，直徑30～100 nm，見(jiàn)圖1。

圖1 透射電子顯微鏡下觀(guān)察到的外泌體形態(tài)（×40 000）Fig 1 Morphology of exosomes under transmission electron microscope（×40 000）

3.2 外泌體標(biāo)志物的檢測(cè)

對(duì)HepG2細(xì)胞分泌的外泌體作Western blot定性分析，可見(jiàn)外泌體穩(wěn)定表達(dá)CD9、TSG101、ALIX等蛋白標(biāo)志物，見(jiàn)圖2。

圖2 外泌體標(biāo)志物的表達(dá)Fig 2 Expression of exosomal markers

3.3 外泌體對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響

以CCK-8法檢測(cè)加入外泌體處理后的腫瘤細(xì)胞的增殖趨勢(shì)，可發(fā)現(xiàn)外泌體具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的能力，但72 h相比48 h細(xì)胞吸光度值有所減少，見(jiàn)表1。

表1 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)吸光度值( ±s，n＝3)Tab 1 Absorbance of cells at different time measured by CCK-8 method ( ±s，n＝3)

表1 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)吸光度值( ±s，n＝3)Tab 1 Absorbance of cells at different time measured by CCK-8 method ( ±s，n＝3)

注：與對(duì)照組比較，#P＜0.01。Note：Compared with the control group，#P＜0.01.

組別吸光度值24 h48 h72 h對(duì)照組0.280±0.0290.437±0.0060.384±0.026外泌體組0.284±0.0190.514±0.0640.474±0.020#

3.4 外泌體對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響

采用綠色熒光法（Caspase3/7細(xì)胞凋亡活性檢測(cè)試劑盒）檢測(cè)細(xì)胞凋亡的水平，可發(fā)現(xiàn)相比于對(duì)照組，外泌體具有抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，但不顯著，見(jiàn)圖3。

圖3 外泌體對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響（n＝3）Fig 3 Effects of exosomes on apoptosis of HepG2 cells（n＝3）

4 討論

外泌體是近些年國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，尤其在腫瘤方面應(yīng)用廣泛，越來(lái)越多的證據(jù)表明，來(lái)源于腫瘤細(xì)胞的外泌體在癌癥中起著關(guān)鍵作用[13]，本研究主要探索肝癌細(xì)胞外泌體對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

本研究采用多步超速離心法從肝癌HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)液上清液中分離出外泌體（因考慮最大限度利用外泌體，同時(shí)為了防止其降解，外泌體是分批次提取，每次實(shí)驗(yàn)提取一次）并通過(guò)透射電子顯微鏡觀(guān)察外泌體形態(tài)，利用Western blot檢測(cè)其標(biāo)志物的表達(dá)。采用CCK-8法、綠色熒光法分別檢測(cè)外泌體對(duì)HepG2細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

多步超速離心分離外泌體是最常見(jiàn)的外泌體提取方法，100 000×g超速離心，時(shí)間在70 min以上是多步離心的關(guān)鍵步驟。最后PBS溶解后的外泌體可以直接使用不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)，而不需要在使用前過(guò)濾除菌，過(guò)濾很容易使外泌體濃度降低，因?yàn)橥饷隗w直徑與濾膜孔徑接近，不易濾過(guò)。

電鏡觀(guān)察到的外泌體一般為圓形或橢圓形膜性囊泡狀結(jié)構(gòu)，直徑在200 nm以下，也有直徑在200 nm以上的其他微泡和凋亡小體等，外泌體具有標(biāo)志性蛋白CD9、TSG101、ALIX等。外泌體的電鏡觀(guān)察證明提取到的囊泡從形態(tài)和大小上符合外泌體的描述，但還不能完全證實(shí)就是外泌體，只是初步驗(yàn)證，而Western blot檢測(cè)到外泌體的標(biāo)志性蛋白則更進(jìn)一步從結(jié)構(gòu)成分上驗(yàn)證了外泌體的存在。

CCK-8法顯示外泌體對(duì)HepG2細(xì)胞具有促增殖作用，24 h和48 h效果較弱且48 h細(xì)胞量要高于72 h，可能細(xì)胞在生長(zhǎng)到72 h時(shí)營(yíng)養(yǎng)下降，導(dǎo)致細(xì)胞量下降的作用可能逐漸超過(guò)增殖作用，原因可能是種板時(shí)采用的是含10%血清的高糖DMEM，而在外泌體處理前（即種板24 h后）將含10%血清的高糖DMEM換成了含1%血清的高糖DMEM（血清濃度高會(huì)影響增殖），但濃度低了又會(huì)導(dǎo)致后續(xù)營(yíng)養(yǎng)不足，也可能是種板時(shí)三塊板上的細(xì)胞未處在同一個(gè)生長(zhǎng)期導(dǎo)致，需要更好的優(yōu)化生長(zhǎng)條件并對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)一步摸索條件使其在進(jìn)入第3日時(shí)還能保持很好的營(yíng)養(yǎng)，為了有更好的效果同時(shí)還應(yīng)進(jìn)一步加大外泌體的提取濃度。

綠色熒光法檢測(cè)用外泌體共培育的HepG2細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果顯示外泌體有一定的抑制HepG2細(xì)胞凋亡的作用，但幅度不大，作用不顯著，這可能和本批次提取的外泌體濃度（質(zhì)量濃度為206 μg·mL－1）不高有關(guān)。

增殖和凋亡是外泌體功能的一體兩面，能促進(jìn)增殖就能抑制凋亡。促進(jìn)增殖的作用強(qiáng)，必定抑制凋亡的作用也強(qiáng)，反之亦然，促增殖能力弱必定抑制凋亡能力也弱。而本研究促增殖能力要稍強(qiáng)于抑制凋亡能力，沒(méi)有較好表現(xiàn)出兩種作用強(qiáng)度的一致性，很可能是由于外泌體是分批次提取，導(dǎo)致濃度的差異，因此體外實(shí)驗(yàn)也應(yīng)盡量接近體內(nèi)這種作用的統(tǒng)一性，最好所有實(shí)驗(yàn)都采用一次提取的外泌體，這樣能保證增殖和凋亡實(shí)驗(yàn)都是采用同一濃度的外泌體，但是這樣也會(huì)導(dǎo)致一次收集的細(xì)胞工作量過(guò)大的問(wèn)題，而且，外泌體長(zhǎng)時(shí)間低溫保存也會(huì)導(dǎo)致外泌體的降解，因此需要找到一個(gè)合理的濃度。

綜上，本研究從肝癌細(xì)胞的培養(yǎng)液中提取到的外泌體（其濃度還應(yīng)進(jìn)一步提高），具有促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和抑制其凋亡的能力。