莊林林 陳欣雅 徐佳豪 宋春雷 申秋平

（江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212400）

豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus,PCV）是一種單股環(huán)狀DNA 病毒，是目前已知最小的動物病毒[1]。目前，PCV 已被發(fā)現(xiàn)包含4 種基因型：PCV1、PCV2、PCV3和PCV4。其中，PCV1 不表現(xiàn)嚴(yán)重的臨床癥狀；PCV2可引起豬繁殖與呼吸道綜合征、斷奶仔豬綜合征、皮炎及腎炎等疾?。籔CV3 則可引起豬皮炎腎病綜合征、繁殖障礙及多系統(tǒng)炎癥；PCV4 是由我國湖南大學(xué)生物學(xué)院獸禽病毒學(xué)研究組于2019 年發(fā)現(xiàn)的一種新PCV 基因型（暫定為PCV4）。

2016 年，美國Phan TG 等[2]和Palinski R 等[3]團(tuán)隊近乎同時報道了PCV3，患豬圓環(huán)病毒3 型病的母豬表現(xiàn)為心臟與多系統(tǒng)并發(fā)癥、豬皮炎和腎病綜合征，但檢測PCV2 為陰性。通過全基因組分析發(fā)現(xiàn)，該病毒與圓環(huán)病毒科成員具有相似的基因結(jié)構(gòu)和特征，但其Cap 蛋白序列和同源性相似度較低。根據(jù)基因組序列不同，可將PCV3 分為：PCV 3a、PCV 3b 和PCV 3c[3]。目前國內(nèi)已有PCV3 感染犬的病例[4]，證實了PCV3 具有跨物種感染的潛在危害。當(dāng)前仍無有效防控PCV3 的疫苗，本文通過對PCV3 快速檢測技術(shù)進(jìn)行綜述，以期為快速檢測及科學(xué)防控PCV3 提供參考。

1 免疫學(xué)檢測方法

1.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗

酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）是將已知的抗原或抗體固定在載體表面，加入酶標(biāo)抗原或抗體進(jìn)行免疫學(xué)反應(yīng)并催化底物顯色的一種檢測技術(shù)。該技術(shù)主要可分為4 種：直接法、間接法、夾心法和競爭法。目前，應(yīng)用于PCV3 檢測的方法主要有間接ELISA 和夾心ELISA。

1.1.1 間接ELISA

間接ELISA 是將待檢測的抗體加入已標(biāo)記有特定抗原的酶標(biāo)板孔中，經(jīng)過孵育、洗滌等步驟之后，加入酶標(biāo)記的抗體，通過酶催化底物顯色，根據(jù)產(chǎn)生的色素即可進(jìn)行半定量或定量分析。為了建立間接ELISA 并快速檢測PCV3 的方法，Deng 等[5]利用Ni2+-NTA 瓊脂糖將重組PCV3 Cap 蛋白進(jìn)行純化，并將其作為抗原以檢測血清中的抗PCV3 抗體。試驗結(jié)果表明，該方法檢測血清中的抗體靈敏度可達(dá)1∶3 200，且與PCV1、PCV2、豬細(xì)小病毒（Porcine parvovirus,PPV）、豬偽狂犬病毒（Porcine pseudorabies virus,PRV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）等無交叉反應(yīng)。該研究通過流行病學(xué)調(diào)查表明，自2015 年以來，PCV3 已在我國廣泛傳播，2015—2017 年，我國豬場中PCV3 的陽性率從22.35%上升至51.88%。葛玉鳳等[6]通過誘導(dǎo)表達(dá)及純化PCV3-Cap 建立了一種間接ELISA 方法，通過對反應(yīng)條件等進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)該方法對PCV3 抗體的檢測靈敏度可達(dá)到1∶25 600，具有優(yōu)異的敏感性。何博等[7]以O(shè)RF2 重組蛋白為包被抗原，建立了檢測PCV3 抗體的間接ELISA 方法，其對PCV3 陽性血清的最低檢出效價可達(dá)1∶20 480。劉相聰[8]利用原核表達(dá)PCV3 Cap 蛋白，并將其作為包被抗原建立了一種間接ELISA 方法。結(jié)果表明，該方法具有較高的敏感性、特異性和可重復(fù)性，適于臨床檢測應(yīng)用。

1.1.2 夾心ELISA

夾心ELISA 是一種常用的ELISA 方法，其基本原理是在特定的涂層板上，將目標(biāo)抗原或抗體與高親和力的檢測抗體或檢測抗原進(jìn)行結(jié)合，再通過酶標(biāo)記的溶液與目標(biāo)分子和檢測分子之間的特異性反應(yīng)，形成特定的復(fù)合物，最后通過酶標(biāo)記物的作用產(chǎn)生信號，從而檢測目標(biāo)分子的存在。夾心ELISA 具有選擇性好、靈敏度高、適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。于俊楠等[9]通過優(yōu)化單抗包被、2 種抗體的濃度等，建立了一種可檢測PCV3 的夾心ELISA 方法。結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好（變異系數(shù)≤5%），且與PCV2、豬口蹄疫病毒、豬乙型腦炎病毒、PRV 等病毒陽性血清無交叉反應(yīng)。臨床樣本驗證結(jié)果顯示，檢測結(jié)果與PCR方法相同率達(dá)84.6%。

1.2 免疫層析技術(shù)

膠體金免疫層析技術(shù)是以膠體金顆粒為顯色媒介，基于抗原抗體特異性反應(yīng)原理形成免疫金復(fù)合物的一種免疫學(xué)檢測技術(shù)。該技術(shù)簡單快速且肉眼可觀察結(jié)果，適于現(xiàn)場即時檢測。高茵等[10]通過構(gòu)建重組PCV3 Cap蛋白并優(yōu)化標(biāo)記pH 值、SPA 標(biāo)記濃度及劃線濃度等，建立了一種可快速檢測PCV3 的膠體金免疫層析方法。結(jié)果表明，該試紙條具有良好的靈敏度和穩(wěn)定性，且臨床檢測結(jié)果與ELISA 一致，表現(xiàn)出較好的臨床適用性。

2 基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的檢測方法

2.1 常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction,PCR）是目前常用的一種DNA 擴(kuò)增及檢測技術(shù)。PCR過程主要包括3 步：首先在94～95℃下將模板DNA 變性成2 條單鏈DNA（變性）。其次將正、反向引物分別結(jié)合到單鏈DNA 上（退火），最后在DNA 聚合酶的作用下，2 條引物的3’端將沿著模板鏈分別延伸出一條互補(bǔ)的DNA 鏈（延伸）。經(jīng)過多個循環(huán)后，將形成大量的DNA 擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR 技術(shù)具有簡單、快速、靈敏、特異性高等優(yōu)點(diǎn)。朱小甫等[11]通過構(gòu)建pGEM-T-PCV3質(zhì)粒，建立了一種檢測PCV3 的PCR 方法。該方法檢測限為50 copies/μL，且與PCV2、PRV、PPV、PRRSV、豬瘟病毒、豬流行性腹瀉病毒等常見豬源病毒均無交叉反應(yīng)。楊威等[12]建立的PCR 方法檢測限可達(dá)1.13×10-3ng/μL，且具有良好的可重復(fù)性。楊曉偉等[13]為了解我國西南地區(qū)PCV3 的感染現(xiàn)狀及其遺傳特征，在基于PCV3-Cap 基因上，設(shè)計特異性引物建立了檢測PCV3的PCR 方法。Shizuka 等[14]使用常規(guī)PCR 方法在日本豬群中首次發(fā)現(xiàn)PCV3，且與毒株全基因組序列同源性為99.5%，ORF2 蛋白同源性為98.9%～99.2%。

2.2 套式PCR

套式PCR 屬于2 步PCR 方法，該方法需使用2 對引物及進(jìn)行2 輪擴(kuò)增。第1 輪反應(yīng)中使用1 對通用引物（外引物）擴(kuò)增出目標(biāo)DNA 的初始片段，第2 輪反應(yīng)（使用內(nèi)引物）以第1 輪擴(kuò)增片段為模板進(jìn)行再次擴(kuò)增。因此，與常規(guī)PCR 相比，套式PCR 具有更高的敏感性和特異性。同時，第2 次反應(yīng)能否進(jìn)行也是對第1 次反應(yīng)正確性的檢驗，因而套式PCR 的準(zhǔn)確性也大幅提升。楊永寧等[15]通過設(shè)計內(nèi)、外特異性引物，建立了套式PCR 方法。結(jié)果顯示，基于內(nèi)、外引物的PCR 檢測限分別為0.17 ng 和17 ng，比常規(guī)PCR 高100 倍。張靜等[16]建立的套式PCR 最低檢測限可達(dá)1.74×10 copies/μL，比常規(guī)PCR 高105倍，與李卓昕等[17]建立的熒光定量PCR 靈敏度相近。經(jīng)臨床樣本驗證，該方法檢測結(jié)果與市售檢測試劑盒具有較高的一致性。

2.3 多重PCR

多重PCR（Multiple PCR,mPCR）是一種使用2 對以上引物，實現(xiàn)同時擴(kuò)增多個目標(biāo)核酸片段的PCR 技術(shù)，有效彌補(bǔ)了常規(guī)PCR 只能擴(kuò)增1 個目標(biāo)片段的不足。多重PCR 具有效率高且成本低等優(yōu)勢，已被廣泛應(yīng)用于病原微生物檢測、鑒定及遺傳性疾病篩查等。目前，在國內(nèi)外豬群中已發(fā)現(xiàn)PCV2 和PCV3 混合感染的現(xiàn)象，為了區(qū)分這2 種基因型，Wang 等[18]建立了可1 管式檢測PCV2 和PCV3 的雙重PCR。結(jié)果表明，該方法對PCV3 的檢測限為2.23×106copies/μL，臨床樣本檢測表明PCV2 和PCV3 合并感染率為14.8%。溫海京等[19]通過優(yōu)化退火溫度、引物濃度等，建立了一種檢測PCV2 和PCV3 的雙重PCR 的方法來針對PCV3 的檢測限為800 copies/μL?；谙嗨品椒ǎ旒移降萚20]建立的雙重PCR 檢測限低至10 copies/μL。此外，為快速準(zhǔn)確區(qū)分檢測PCV1、PCV2 和PCV3，Yang 等[21]通過設(shè)計3 對特異性引物從而建立了mPCR 方法，針對3 種病原的檢測限均低至10 copies/μL。經(jīng)臨床樣本驗證，該方法檢測結(jié)果與測序法和定量PCR 一致，具有良好的臨床適用性。

2.4 熒光定量PCR

熒光定量PCR（Quantitative PCR,qPCR）是通過檢測PCR 反應(yīng)體系中的熒光強(qiáng)度來定量擴(kuò)增產(chǎn)物的技術(shù)。該技術(shù)在反應(yīng)體系中需加入熒光染料或探針，染料或探針可與擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合產(chǎn)生熒光信號。熒光信號的強(qiáng)度與反應(yīng)體系中擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量成正相關(guān)，從而實現(xiàn)DNA定量分析。Xu 等[22]基于SYBR Green I 建立了可用于PCV3 檢測的qPCR 方法，并對來自不同農(nóng)場的部分毒株的Cap 基因進(jìn)行了測序及分析，結(jié)果表明，該方法檢測限為2.19×10 copies/μL，且臨床樣本PCV3 陽性率為31.18%。Zhao 等[23]使用TB Green Ⅱ開發(fā)了qPCR方法，檢測限為78 copies/μL，可用于快速檢測PCV3感染。Yuan 等[24]基于PCV3 Cap 蛋白保守區(qū)域設(shè)計了引物和探針，開發(fā)的qPCR 方法檢測限為10 copies/μL，同時，該方法具有較高的特異性，并在臨床樣品檢測方面表現(xiàn)出良好的應(yīng)用性能。暢通等[25]利用TaqMan 探針建立的qPCR 方法敏感性同樣達(dá)到10 copies/μL。Deng等[26]首次使用SPF 仔豬模型對PCV3 感染進(jìn)行體內(nèi)表征研究，并利用組織病理學(xué)和qPCR 進(jìn)行PCV3 檢測。結(jié)果表明，qPCR 方法檢測限達(dá)5.5 copies/μL。Feng 等[27]基于PCV3 復(fù)制酶基因開發(fā)了基于TaqMan 的qPCR 方法，該方法的檢測極限為1.5×101copies/μL。

此外，qPCR 方法同樣可應(yīng)用于多重檢測，有利于大幅提高檢測效率。Zheng 等[28]基于SYBR Green Ⅰ開發(fā)了雙重qPCR 方法用于同時檢測PCV3 和PRRSV。該方法對PCV3 的檢測限為49.3 copies/μL，低于常規(guī)PCR，可用于檢測臨床樣本中上述2 種病毒混合感染。Li 等[29]根據(jù)PCV2 Cap 和PCV3 Rep 基因設(shè)計特異性引物和探針，開發(fā)了可同時檢測PCV2 和PCV3 的雙重qPCR 方法。結(jié)果顯示，該方法對PCV3 的檢測限為22.5 copies/μL。同時，臨床樣本檢測結(jié)果表明，PCV2、PCV3 在樣品中的混合感染率為27.6%，適用于快速檢測PCV 混合感染。

2.5 數(shù)字PCR

數(shù)字PCR（Digital PCR,dPCR） 是20 世紀(jì)末由Vogelstein 等學(xué)者研發(fā)的核酸絕對定量技術(shù)。通過使用微流控技術(shù)將反應(yīng)混合物分成數(shù)千乃至上萬個微小的球形微滴并分散在獨(dú)立的反應(yīng)室內(nèi)，每個反應(yīng)室內(nèi)僅含有1 個或0 個目標(biāo)分子。PCR 反應(yīng)結(jié)束后，即可根據(jù)陽性反應(yīng)室比例準(zhǔn)確計算初始樣本中的目標(biāo)分子數(shù)[30]。與qPCR 相比，dPCR 無需制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，具有更高的靈敏度和精準(zhǔn)度。dPCR 已成為檢測PCV3 感染具有前景的分子診斷技術(shù)之一。劉雨琦[31]建立了檢測PCV3 的dPCR 方法，確定了最適退火溫度為56.3℃、引物和探針終濃度分別為400 nM 和200 nM。分析顯示，該方法靈敏度可達(dá)0.1 fg/μL，同時具有良好的可重復(fù)性。李原野等[32]基于PCV3 ORF2 基因序列設(shè)計擴(kuò)增引物，建立的dPCR 方法檢測限為16.35 copies/μL，同時具有良好的可重復(fù)性和特異性。此外，dPCR 同樣可用于多靶標(biāo)精準(zhǔn)檢測。Liu 等[33]利用微滴數(shù)字PCR 建立了可同時檢測PCV2 和PCV3 的方法。該方法針對PCV3 的檢測限為3 copies/μL，低于qPCR。吳朦晨等[34]通過對反應(yīng)溫度、引物及探針工作濃度等進(jìn)行優(yōu)化，建立了三重dPCR 方法。結(jié)果表明，該方法對PCV3 的檢測限為11.54 copies/μL，同樣優(yōu)于qPCR 方法。

2.6 基于PCR 的其他方法

2022 年，孫延舉[35]聯(lián)合PCR 和ELISA 建立了可用于PCV3 快速檢測的PCR-ELISA 方法。在該方法中，以鏈霉親和素作為包被抗原，標(biāo)記生物素和地高辛的PCR 產(chǎn)物作為一抗、HRP 標(biāo)記的抗地高辛抗體作為二抗進(jìn)行ELISA 反應(yīng)。該P(yáng)CR-ELISA 方法的檢測限為5.58×102copies/μL，比常規(guī)PCR 低2 個數(shù)量級，且無需凝膠電泳，可有效減少污染風(fēng)險。為了分析我國PCV3 和PCV2 的流行趨勢，Zhang 等[36]建立了雙重納米PCR（nano-PCR） 方法，擴(kuò)增產(chǎn)物分別為528 bp（PCV2）和251 bp（PCV3）2 個特異性片段。同時，該方法檢測限低至9.16×101copies/μL，比常規(guī)雙重PCR低2 個數(shù)量級，且與其他常見豬病毒無交叉反應(yīng)性。

3 等溫擴(kuò)增方法

3.1 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)

2000 年，Notomi 等[37]基于具有鏈置換活性的DNA聚合酶研發(fā)了可在等溫條件下進(jìn)行DNA 高效擴(kuò)增的方法——環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP） 技術(shù)。LAMP 技術(shù)利用Bst DNA聚合酶及內(nèi)、外2 對擴(kuò)增引物可在1 h 內(nèi)擴(kuò)增出109～1010個目標(biāo)序列，具有簡單快速、靈敏度高、儀器簡單等優(yōu)勢，目前已廣泛應(yīng)用于病原微生物鑒定、疫病監(jiān)測、食品安全等領(lǐng)域。Wang 等[38]建立了用于快速檢測PCV3的LAMP 方法，檢測限可達(dá)1×101copies/μL，與Zheng 等[39]的研究結(jié)果一致。Zhang 等[40]開發(fā)了可目視判斷結(jié)果的LAMP 方法，以實現(xiàn)PCV3 的快速檢測。該方法靈敏度為10 copies/μL，且與其他豬病毒無交叉反應(yīng)。Park 等[41]基于PCV3 Cap 基因設(shè)計引物、以羥基萘酚藍(lán)為反應(yīng)指示劑開發(fā)了可目視檢測PCV3 的LAMP 方法，檢測限為50 copies/μL，且具有較好的臨床適用性。為了實現(xiàn)PCV3 實時檢測，Kim 等[42]通過加入探針建立了實時LAMP 方法以特異性檢測PCV3。該方法靈敏度為50 copies/μL，優(yōu)于常規(guī)LAMP 方法。此外，王妍等[43]聯(lián)合LAMP 與側(cè)向免疫層析（Lateral flow dipstick.LFD）建立了LAMP-LFD 方法并應(yīng)用于PCV3 的快速檢測，該方法檢測限為0.2 fg/μL，比常規(guī)PCR 低3 個數(shù)量級，同時，該方法操作簡單、快速，且檢測結(jié)果優(yōu)于PCR和常規(guī)LAMP 方法，具有良好的臨床應(yīng)用價值。

3.2 重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)

重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)（Recombinase aided amplification,RAA）是一種等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)利用重組酶、DNA 聚合酶和單鏈結(jié)合蛋白，可在恒溫條件下從目標(biāo)核酸片段擴(kuò)增到大量的DNA 產(chǎn)物。與PCR 相比，RAA 具有操作簡單、反應(yīng)快速、無需熱循環(huán)儀等優(yōu)點(diǎn)。Li 等[44]基于PCV3 Cap 基因設(shè)計特異性引物和探針，開發(fā)了一種可用于PCV3 快速檢測的RAA 方法。利用該方法，在39℃下，30 min 內(nèi)即可完成檢測。該方法靈敏度為38 copies/μL，在現(xiàn)場即時檢測方面具有應(yīng)用潛力。為了縮短檢測時間并實現(xiàn)實時監(jiān)測，吳江等[45]建立了實時熒光RAA 方法。該方法可在39℃下20 min 內(nèi)完成檢測，且檢測限達(dá)102copies/μL，適于分子檢測條件有限的機(jī)構(gòu)使用。

3.3 重組酶聚合酶擴(kuò)增

重組酶聚合酶擴(kuò)增（Recombinase polymerase amplification,RPA）是一種新型核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)，可以在常溫（37～42℃）條件下進(jìn)行快速、高效地擴(kuò)增出特定核酸序列[46]。該技術(shù)可利用聚合酶、重組酶和單鏈DNA 結(jié)合蛋白等共同作用引導(dǎo)目標(biāo)核酸不斷解鏈、擴(kuò)增和釋放。Wang 等[47]針對PCV3 Cap 基因設(shè)計RPA 引物和探針，開發(fā)了用于快速檢測PCV3 的實時熒光RPA 方法。結(jié)果表明，該方法具有高特異性，靈敏度為23 copies/μL，可在20 min 內(nèi)完成檢測。吳佳駿等[48]建立了靶向PCV3 Cap 蛋白的實時RPA 方法，靈敏度可達(dá)4.56×102copies/μL，與常規(guī)PCR 方法靈敏度相當(dāng)。同時，該方法與PCV1、PCV2、PRRSV、PRV、豬塞內(nèi)卡病毒等無交叉反應(yīng)。臨床驗證表明，該方法檢測結(jié)果與使用PCR 檢測結(jié)果一致。

3.4 酶促重組等溫擴(kuò)增技術(shù)

酶促重組等溫擴(kuò)增技術(shù)（Enzymatic recombinase amplification,ERA）是近年來發(fā)展起來的新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，其原理是采用介導(dǎo)DNA 重組的酶來高效擴(kuò)增目標(biāo)DNA 序列。ERA 技術(shù)具有低溫適應(yīng)性、簡單快速以及高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)。Zhang 等[49]將ERA 與CRISPR/Cas12a 技術(shù)相結(jié)合，應(yīng)用于PCV3 快速檢測。ERA-CRISPR/Cas12a 反應(yīng)可以在單分子水平上檢測PCV3 DNA。同時，該方法具有高特異性，與PCV1、PCV2、PCV4 及其他豬病毒均沒有交叉反應(yīng)，并可在1 h 內(nèi)完成檢測。該技術(shù)具有良好的診斷應(yīng)用前景，有望成為檢測病毒感染的重要工具手段。

3.5 聚合酶螺旋反應(yīng)

聚合酶螺旋反應(yīng)（Polymerase spiral reaction,PSR）是一種近年來發(fā)展的核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)。通過在2 條引物的5’端加上1 段互為反向的序列，可以使引物以自身為模板，按照自螺旋擴(kuò)增的方式進(jìn)行目標(biāo)片段擴(kuò)增。該技術(shù)基于PCR 引物的設(shè)計思路和Bst DNA 聚合酶的鏈置換活性，實現(xiàn)1 對引物和1 種酶在等溫條件下對核酸進(jìn)行高效擴(kuò)增[50]。PSR 反應(yīng)體系簡單，具有良好的特異性和敏感性。Ji 等[51]建立了可高效檢測PCV3 的PSR方法。使用62℃水浴，50 min 可完成PCV3 目標(biāo)基因擴(kuò)增，其檢測限為1.13×102copies/μL。試驗表明，PSR方法具有較高的特異性，且檢出率高于LAMP 方法，適于資源條件有限的實驗室使用。

4 原位雜交技術(shù)

原位雜交技術(shù)（In situ hybridization,ISH）是將核酸探針與檢測樣品中靶核酸特異性雜交的方法[53]。該技術(shù)的原理是使用DNA 或RNA 分子探針與已知目標(biāo)DNA或RNA 序列進(jìn)行雜交，從而確定這些分子在細(xì)胞或組織樣本中的位置和數(shù)量。在ISH 技術(shù)中，探針一般被標(biāo)記熒光或放射性等，可以被視覺或檢測設(shè)備測量和檢測。ISH 技術(shù)可以對特定序列進(jìn)行檢測及定位，具有直接、快速、特異等優(yōu)點(diǎn)。Phan 等[2]使用ISH 方法，將載玻片與目標(biāo)探針在40℃的雜交緩沖液中反應(yīng)2 h。研究表明，PCV3 在心肌細(xì)胞和心肌中的炎癥細(xì)胞等多處存在，而在肺組織切片中未能檢測到PCV3。Mora-Díaz等[52]通過ISH 方法在豬生殖期病例組織中分離出PCV3。同時，研究表明，PCV3 感染會引起豬的心肌炎和系統(tǒng)性血管炎等多系統(tǒng)炎癥。Taehwan 等[54]通過使用PCV3特異性DNA 探針進(jìn)行原位雜交來確認(rèn)PCV3 感染，首次在流產(chǎn)胎兒中檢測到PCV3。

5 宏基因組測序分析

宏基因組測序分析技術(shù)是一種用于研究微生物群落的高通量測序技術(shù)，可以快速獲取微生物群落的全基因組序列信息，并進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)、功能和代謝通路等多個方面的分析[55]。目前，宏基因組測序已經(jīng)從分析單個基因發(fā)展到可提供整個生態(tài)系統(tǒng)相關(guān)的復(fù)雜遺傳信息。這對發(fā)現(xiàn)新物種、分析生態(tài)系統(tǒng)構(gòu)成、研究宏基因組的功能和代謝途徑等具有重要意義。PCV3 的發(fā)現(xiàn)也得益于該技術(shù)，Palinski 等[3]通過PCR 和宏基因組測序檢測到母豬流產(chǎn)的胎兒含有高水平的PCV3，并通過滾環(huán)擴(kuò)增證實引起豬皮炎腎病綜合征臨床癥狀的病原為PCV3。Franzo等[56]通過宏基因組測序分析，檢測出患有仔豬斷奶發(fā)育不全綜合征的病例中存在PCV3。宏基因組測序分析為病原體的發(fā)現(xiàn)、溯源及組成等提供了高效快捷的方法。

6 小結(jié)與展望

豬圓環(huán)病毒3 型（PCV3）在全球范圍內(nèi)傳播廣泛，已引起養(yǎng)豬業(yè)的廣泛重視。為了有效監(jiān)測和控制其傳播，研究人員已經(jīng)開發(fā)出多種快速檢測方法，包括免疫學(xué)方法、多種基于PCR 的方法、等溫擴(kuò)增、原位雜交、宏基因組測序技術(shù)等，為快速精準(zhǔn)檢測PCV3 提供了有力技術(shù)支持。免疫學(xué)方法盡管簡單、快速且可監(jiān)測抗體，但目前在靈敏度和特異性方面仍有待加強(qiáng)。基于PCR 的方法雖然在PCV3 檢測中具有高靈敏度和特異性，但其操作過程需要具有專業(yè)能力的技術(shù)人員，且檢測結(jié)果觀察需依賴操作繁瑣的凝膠電泳，或使用成本較高的熒光探測設(shè)備。等溫擴(kuò)增技術(shù)作為PCR 的可選替代方案，具有設(shè)備簡單、反應(yīng)快速、支持目視判斷結(jié)果等優(yōu)勢，但目前相關(guān)技術(shù)在引物設(shè)計、反應(yīng)體系成熟度及可重復(fù)性等方面仍有待提升。原位雜交、宏基因組測序為PCV3檢測提供了重要技術(shù)支持，但現(xiàn)有方法仍難以滿足PCV3 現(xiàn)場快速檢測需求。

未來，隨著PCV3 研究的不斷深入，研究人員將繼續(xù)優(yōu)化現(xiàn)有快速檢測方法，提高檢測敏感性、特異性和可重復(fù)性。同時，隨著檢測技術(shù)水平的不斷提高，更精準(zhǔn)、快速和便捷的PCV3 檢測技術(shù)將被研發(fā)。此外，在多學(xué)科交叉融合的發(fā)展趨勢下，高通量、便攜式、智能化的一體化檢測設(shè)備將不斷被研發(fā)，為實現(xiàn)PCV3 快速精準(zhǔn)檢測提供新的方法與技術(shù)支撐。