付 菲， 胡佳辰， 隋秉東， 軒 昆， 金 巖

（1. 口頜系統(tǒng)重建與再生全國重點實驗室，國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心，陜西省口腔疾病國際聯(lián)合研究中心，空軍軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院口腔組織病理學教研室，西安 710032；2. 口頜系統(tǒng)重建與再生全國重點實驗室，國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心，陜西省口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心，空軍軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院預防科，西安 710032）

牙頜組織的缺損是指由于炎癥、腫瘤、創(chuàng)傷等原因引起的口腔頜面部軟、硬組織缺失與功能缺陷，包括但不限于牙缺損、缺失、頜面部骨缺損等[1]。較大面積的牙頜組織缺損通常無法自我修復，不僅嚴重影響口腔頜面部的形態(tài)與功能，還對患者的顏面部美觀及心理健康造成嚴重影響。目前針對這類組織缺損的臨床治療手段存在一定的局限性，金屬類、陶瓷類、高分子等應用于缺損組織仿真代替的人工合成類材料在形態(tài)、結構與功能方面與天然組織相比差異性大，同時再生誘導活性差、與宿區(qū)整合困難；而自體組織或同種異體組織移植的供體來源也難以滿足臨床需求[2]。因此，探索新的牙頜組織缺損的修復方法具有重要的醫(yī)學意義。

間充質干細胞（MSCs）是一群具有自我更新和多向分化潛能的細胞。它來源廣泛、易于獲取和應用的特性使其成為應用于組織再生構建中的一種重要干細胞[3]。近十幾年來對于干細胞的研究推動了再生醫(yī)學的發(fā)展，給組織缺損的修復和再生帶來了全新的治療理念、方法和希望[4]。隨著組織工程技術的發(fā)展，由干細胞衍生出的再生醫(yī)學在過去幾十年間取得了巨大的戰(zhàn)略性進展。近年來，內源性再生策略的牙髓血運重建術式和外源性再生策略的干細胞組織工程模式正逐步轉為發(fā)育性再生策略的類器官與微組織生物工程范式。應用牙頜組織MSCs建立的干細胞聚合體技術能夠通過誘導干細胞自分泌形成細胞外基質，進而自組裝形成高度凝聚的細胞團塊，其植入組織缺損部位后，可在原位發(fā)育為工程化牙頜組織[5-7]。干細胞聚合體技術旨在模擬胚胎發(fā)育的間充質凝聚過程，實現(xiàn)組織再生，其再生的組織具有與天然組織之間相似度高、生理功能重建能力強、再生微環(huán)境重塑和維持以促進宿主整合的優(yōu)勢。在體外培養(yǎng)階段維持MSCs干性的同時，干細胞聚合技術能夠避免支架或細胞因子等外源性因素的影響[8]，其已成功應用于牙髓、牙周、骨等多種牙頜組織缺損的再生修復。本文將從干細胞聚合體的理論基礎、構建方式和牙頜組織再生方面的研究現(xiàn)狀等進行探討，以期為更好實現(xiàn)牙頜組織缺損的再生修復提供新的研究方向和臨床治療思路。

1 干細胞聚合體的理論基礎與再生構建

1.1 干細胞凝聚與發(fā)育指導再生

人體組織與器官的發(fā)育是一個復雜而有序的生理過程。通常來講，器官是由一群密集的祖細胞發(fā)育形成的，這種祖細胞群又被稱為“器官芽”，“器官芽”的形成包含多種干細胞的凝聚過程，而其中MSCs的凝聚（mesenchymal condensation）是啟動“器官芽”的必要過程，是具有代表性、自組織器官發(fā)生的中心環(huán)節(jié)[9-10]。MSCs在凝聚的過程中不僅決定間充質組織的形成和模式，也對信號傳遞具有重要的作用，并調控周圍其他譜系細胞的協(xié)同發(fā)育。比如，在牙發(fā)育過程中，上皮與間充質之間相互誘導，雖然牙發(fā)育的“第一信號”來自上皮，但隨后MSCs的凝聚在形成牙齒模式和形態(tài)發(fā)生方面發(fā)揮重要作用[11-12]。

干細胞微環(huán)境是指干細胞周圍的局部微觀環(huán)境，由多種細胞分泌因子和細胞外基質構成，為干細胞的穩(wěn)態(tài)維持、自我更新及分化提供了重要的支持[13]。干細胞與微環(huán)境之間有密切的交互調控作用：一方面，干細胞自身通過旁分泌方式調節(jié)微環(huán)境性質[14-16]；另一方面，干細胞也受到微環(huán)境的調控，包括物理、化學、生物因子等多方面的因素[17]。微環(huán)境概念的提出，很大程度上拓寬了干細胞研究領域的視野，使得人們對干細胞植入體內后的轉化、轉歸有了更深的認識。從干細胞與微環(huán)境之間的關系來看，維持干細胞功能的關鍵因素之一在于塑造有利的微環(huán)境。干細胞聚合體可以通過細胞自身分泌的細胞外基質構成天然支架，其中包括多種膠原、蛋白聚糖、黏附蛋白、細胞因子、細胞外囊泡等成分，從而形成與天然組織十分相似的生理微環(huán)境，促進干細胞的功能分化和聚合體的再生能力表達[8]，為臨床中組織缺損的修復提供一種新的策略[18]。

1.2 間充質干細胞聚合體的工程化構建

MSCs的發(fā)育期凝聚具有一定的自主性，能夠分泌細胞外基質（extracellular matrix，ECM）包裹自身，并序列性啟動分化基因的表達[19]。為了研究天然ECM，使用分級乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）將牙片去細胞化，得到天然牙齒ECM[20-21]，將這種ECM作為支架與脫落乳牙牙髓干細胞（stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHED）聚合體共同植入體內可能啟動了PAX9等早期發(fā)育的基因，從而啟動了牙齒發(fā)育，結果證明這種ECM可能保留了一些發(fā)育相關的重要因素，同時表明干細胞與ECM之間的相互作用也是啟動發(fā)育和再生不可或缺的部分[20，22]。干細胞自組裝技術正是基于這種發(fā)育理論進行的MSCs體外工程化誘導，即在沒有外界支架或者細胞因子調控的條件下，利用干細胞自組裝特性和自身分泌的ECM模擬發(fā)育期凝聚維持干性，并塑造有利微環(huán)境，達到植入組織后啟動干細胞自發(fā)育的目的[23]。在MSCs培養(yǎng)過程中加入維生素C、白藜蘆醇等因子，利用MSCs培養(yǎng)中易于增殖、密集分布后形成細胞膜片的性質，進一步使MSCs細胞膜片卷曲形成三維球狀體并延續(xù)培養(yǎng)[24]，可防止細胞復制性衰老，促進ECM分泌，最終形成無支架、高密度、富含基質微環(huán)境的細胞聚合體結構[25-26]。相比于單個干細胞，這種3D生長的干細胞聚合體具有更好的生存和再生能力[27]?？谇活M面部多種組織來源的MSCs均可以進行聚合體的構建，包括多種牙源性干細胞或非牙源性細胞，例如成體牙髓干細胞（dental pulp stem cells，DPSCs）、SHED、骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）、脂肪干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）等[3，9，20，28-31]。這些功能干細胞在不同的組織修復再生過程中存在異質性，在不同組織再生過程中應有不同的策略[32]。

1.3 間充質干細胞聚合體研究的發(fā)展

隨著干細胞被人們發(fā)現(xiàn)，它在再生領域為臨床疾病的治療提供了一個全新的思路。干細胞已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)了幾十余年，迄今為止已經(jīng)在科研與臨床中展現(xiàn)出它優(yōu)異的再生、調控免疫、修復等能力，由干細胞及組織工程所衍生出的再生醫(yī)學也得到了充分的發(fā)展，為很多臨床的不治之癥帶來了新的希望[33]。大部分的干細胞主要利用生物支架與干細胞懸液相混合植入體內進行研究，由于單細胞懸液存在無法大量植入、植入后體內分布不均等問題，干細胞聚合體技術逐漸被廣泛應用[8，34]，該技術無須支架材料和酶消化，通過刺激細胞外基質分泌形成致密膜片組織，能有效地修復組織缺損和改善器官功能，為克服上述缺點帶來希望。自研究以來，這一技術已經(jīng)在多個組織工程中被研究報道[35]。但是干細胞聚合體距離應用于臨床仍有很多難題需要解決，比如制備困難、與天然組織存在差異、在宿主體內維持時間無法得到保證等問題。針對這些問題，對于干細胞聚合體的各項技術也在不斷地被挖掘，例如加入細胞因子或復合支架材料與組織學鄰近的細胞進行共培養(yǎng)，以期達到與體內結構相似的組織形態(tài)等。隨著單細胞測序等[17]新型技術的發(fā)展，如相關研究[35]報道了在基因與蛋白水平方面，干細胞聚合體與其他干細胞在再生方面的潛力。

2 干細胞聚合體在牙再生中的實踐

牙齒在解剖結構和生物功能方面具有高度的特殊性。從胚胎發(fā)育角度看，牙齒的發(fā)育起源于內陷的外胚層上皮組織，隨后即被來源于神經(jīng)嵴的間充質細胞凝聚后包裹，向上皮發(fā)出信號啟動組織的分化[36-37]。上皮與間充質之間有序的相互作用和復雜的交互網(wǎng)絡是牙齒發(fā)育的基礎。大量的研究[6，9]表明，間充質凝聚可能是決定牙齒發(fā)育的關鍵。牙齒的再生一直是國內外學者研究的熱點，經(jīng)過近10年的實踐，干細胞聚合體已經(jīng)在動物實驗和臨床研究中實現(xiàn)了牙髓及牙周組織的再生，取得了顯著的成果。

2.1 干細胞聚合體在牙再生中的動物實驗

SHED聚合體包含豐富的細胞外基質和簇集的未分化干細胞群，再生牙髓組織是由植體 SHED 聚合體與宿主細胞協(xié)同分化而形成的。牙髓牙本質復合體是由牙乳頭發(fā)育而來的，通常被認為是一個整體，利用牙乳頭干細胞（dental papilla mesenchymal cells，DPMCs）、SHED等干細胞聚合體可在空根管內形成類成牙本質細胞、類牙本質-牙髓復合體等組織[22，29，38-39]。干細胞聚合體再生出牙髓組織不僅能在嚙齒類動物中實現(xiàn)，而且在小型豬的體內也被證明是可以實現(xiàn)的。干細胞聚合體的牙髓再生能力已經(jīng)在大量動物實驗中被證實。細胞因子可能是干細胞聚合體與宿主之間相互作用的重要信號[40]，此外還可通過釋放細胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）重塑再生微環(huán)境和動員宿主細胞活化參與組織再生，其中宿主的免疫調節(jié)也是重要的環(huán)節(jié)。WU等[5]研究發(fā)現(xiàn)，SHED聚合體囊泡通過轉運miR-26分子至血管內皮細胞，從而促進牙髓的血管生成。同時，SHED聚合體的凋亡囊泡通過轉運自身攜帶的線粒體TU轉運延伸因子，調節(jié)內皮細胞的轉錄因子EB-自噬途徑，從而促進血管生成和牙髓再生[41]。但是這一研究的相關機制需要進一步明晰。

牙周組織的再生起源早于牙髓再生，也一直是牙齒再生的重點領域。早在2009年，Yang等[42]利用PDLCs聚合體復合牙本質、牙骨質植入免疫抑制的小鼠皮下，在牙本質-牙骨質表面隨即觀察到了鼠類牙周膜復合牙骨質的結構。隨著研究[24，43]的不斷深入，在嚙齒類動物的牙周缺損處原位植入干細胞聚合體，仍然能觀察到牙周組織的再生，意味著聚合體可能實現(xiàn)完全牙周再生。同時，有研究[44]發(fā)現(xiàn)，在利用脂多糖誘導的牙周炎癥模型中植入聚合體，也發(fā)生了牙槽骨的再生。這進一步證實了干細胞聚合體與宿主免疫調節(jié)之間的關系。

我們前期的研究[20]驗證了 SHED 聚合體技術轉化應用的安全性及有效性，創(chuàng)新了牙髓牙本質復合體及牙周再生治療的理念和策略。這些結果表明，干細胞聚合體的再生方式有望為牙髓病的治療帶來新的希望，同時也為開展臨床試驗研究奠定了基礎。值得一提的是，目前的聚合體再生出的牙髓牙周組織雖然已經(jīng)接近生理結構，但仍然有一定的區(qū)別，而且聚合體在體內的遠期轉歸及與體內微環(huán)境之間的作用機制仍需要進一步研究。

2.2 干細胞聚合體在牙再生中的臨床試驗

2018年，Xuan等[29]將自體SHED聚合體植入外傷患者的年輕恒切牙中，結果表明，年輕恒切牙的根管中再生出了牙髓-牙本質復合體組織，在國際上首次完成了SHED聚合體用于牙髓壞死年輕恒牙的全牙髓再生和完全脫位牙齒生物工程再植的臨床試驗，SHED聚合體不僅重建了牙髓-牙本質復合體、血管-神經(jīng)等組織結構，而且恢復了牙齒的營養(yǎng)、感覺、發(fā)育等生理功能；最重要的是，與傳統(tǒng)根管治療的方法相比，在治療12個月后，SHED聚合體移植組根長增加、根尖孔寬度減小，提示再生的牙髓有效促進了牙齒的繼續(xù)發(fā)育。2021年，Guo等[20]進一步將SHED聚合體植入外傷性撕脫年輕恒牙的根管和牙周中，并將構建的工程化牙原位再植，結果表明，SHED聚合體促進了牙髓和牙周組織的聯(lián)合再生，并同樣支持了牙根的持續(xù)發(fā)育。

這些臨床試驗不僅證明了干細胞聚合體在人體牙髓和牙周組織生理性、功能性和再生中的安全性、有效性，也為臨床牙壞死、外傷、脫位等疾病建立了新療法。盡管這些臨床試驗的試驗對象的選擇范圍依然較為局限，但取得的成果已經(jīng)邁出了干細胞聚合體技術從動物實驗向臨床實踐跨越的第一步。一方面，基于此項重大成果，進一步推進同種異體干細胞聚合體的臨床研究將很大程度促進干細胞聚合體在臨床中的廣泛應用；另一方面，針對宿主局部有炎癥的微環(huán)境，如何提高植入聚合體的有效性和成功率仍需進一步探究。

3 干細胞聚合體在顱頜面部骨再生中的實踐

骨組織是再生醫(yī)學領域中最先被關注到的組織之一。在顱頜面部，因為外傷、腫瘤等原因造成的骨缺損是常見的疾病[45-46]。因此，將干細胞聚合體應用于頜面部骨組織的再生修復也是近年來的研究熱點之一。Liu等[47]將MSCs聚合體置于卵巢切除術后（ovariectomy，OVX）大鼠臨界缺損的顱骨模型中，觀察到MSC聚合體組的新生骨組織顯著高于干細胞組。OVX大鼠模擬了在骨質疏松患者體內的骨環(huán)境，這項實驗的成功意味著MSCs聚合體可能成為骨質疏松患者大面積骨缺損可行的治療策略。此外，利用無機物等作為MSCs聚合體的支架也是突破聚合體壁壘的一種探索手段。Whitehead等[48]發(fā)現(xiàn)利用黏彈性藻酸鹽可以增強MSCs聚合體對骨形成和修復的治療潛力；Motoike等[49]以三維立體冷凍的方式構建了MSCs聚合體，在維持細胞活力和成骨能力基礎上可以保存6個月，這為干細胞聚合體在組織再生中的儲存問題提供了可能。

Chen等[50]進行了一項隨機臨床試驗，使用自體牙周膜干細胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）聚合體治療牙周缺損；為了與目前臨床應用的療法進行比較，對照組進行傳統(tǒng)的屏障膜和骨礦物質材料的聯(lián)合治療，實驗組患者接受了PDLSCs聚合體連同屏障膜和骨礦物質材料的植入；此項研究盡管沒有記錄到臨床安全性問題，并且在12個月后所有患者都檢測到牙周牙槽骨再生，但PDLSCs植入組未能顯示出優(yōu)于傳統(tǒng)方法的療效。可能的原因是局部炎癥微環(huán)境影響聚合體的生物性能，從而影響聚合體的再生潛力。因此，先進一步研究如何對微環(huán)境進行適當?shù)母深A，再聯(lián)合聚合體進行再生可能是提高組織再生效果的有效手段。

值得一提的是，近期的研究[51-54]發(fā)現(xiàn)，頜骨中存在多種特定的內源性MSCs亞群，它們位于牙槽骨、頜面部骨縫處等，參與骨組織的重塑及骨組織再生過程中的血管生成等。由于目前單純的外源性輸入干細胞的技術無法維持再生部位高水平的干細胞含量及穩(wěn)定的微環(huán)境，導致其對于局部骨組織的再生能力有限。內源性MSCs的發(fā)現(xiàn)，對于我們建立外源性干細胞聚合體輸入后協(xié)同內源性干細胞共同完成組織的再生修復具有重要意義。

4 結語

基于干細胞聚合體的組織工程技術是一種模擬胚胎發(fā)育中的干細胞凝聚原理以啟動組織發(fā)育性，從而實現(xiàn)組織再生的技術[18]。近年來，干細胞聚合體技術有了很大的應用研究進展，動物實驗和臨床試驗已初步證明其臨床轉化的安全性和有效性。然而，將干細胞聚合體發(fā)展成為一種可行的臨床治療方法，仍有如下關鍵問題需要解決和闡明。

4.1 干細胞的優(yōu)化獲取及干細胞聚合體的標準化制備

許多組織來源的MSCs均具有形成干細胞聚合體的潛能，但是最適合于組織再生的干細胞種群獲取和聚合體的標準化制備仍存在諸多技術問題亟待解決。一方面，干細胞聚合體的活性很大程度上取決于種子細胞的狀態(tài)，狀態(tài)不佳的種子細胞將無法獲得良好的再生效果[6]；另一方面，干細胞聚合體在制備過程中存在一些影響因素可能導致所形成的聚合體功能減弱甚至喪失，例如受到中心營養(yǎng)物質和氧氣供應不充分的限制等[6]。因此，選擇合適的干細胞種群（如發(fā)育期的SHED）并建立質量控制的制備流程，是聚合體構建中應關注的重要問題。

4.2 干細胞與ECM的互作機制和干細胞聚合體植入體內后與宿主的互作機制

在聚合體的體外培養(yǎng)階段，干細胞與其所在ECM微環(huán)境有著密切的聯(lián)系，但其中具體的分子機制仍需進一步闡明，相關研究對于聚合體的精準構建和功能調控具有重要意義。此外，迄今為止，聚合體在植入體內后如何與宿主免疫等成分之間進行相互作用仍未闡明。雖然聚合體植入體內后可以實現(xiàn)組織再生，但是該效果多是在免疫缺陷或自體條件下實現(xiàn)的[55-56]，異體情況下干細胞在植入體內后的分布、存活和與宿主免疫之間的相互作用研究將對于異體環(huán)境下再生效果的穩(wěn)定維持具有重要參考價值。

4.3 干細胞聚合體植入宿主后的長期有效性和穩(wěn)定性

我們利用SHED 聚合體進行成熟恒牙牙髓再生的動物模型實驗和臨床前瞻性實驗，取得了良好的效果，但同時也發(fā)現(xiàn)個別牙齒遠期預后出現(xiàn)了再生組織分化不佳，甚至炎癥反應導致根管彌漫性鈣化和根尖周病變等癥狀[29]。分析原因可能是在低氧、缺氧的根尖狹窄根管環(huán)境中植入的 SHED 聚合體與宿主血運聯(lián)系不暢，導致牙髓再生分化效能顯著下降，甚至部分植體細胞快速壞死而誘發(fā)炎癥反應。以往的研究顯示，毛細血管供應的氧氣組織環(huán)境彌散距離僅能達到百微米，而宿主體內原位血管生成速率僅為每天近百微米[57]，血供不足是導致組織再生效果不穩(wěn)定的關鍵因素[58]。如何提高干細胞聚合體在宿主體內的適應能力或尋找改善宿主微環(huán)境的方法是目前亟待解決的問題。

4.4 臨床試驗的拓展和規(guī)范

當前，仍需要通過多中心聯(lián)合的臨床試驗提高干細胞聚合體實現(xiàn)組織再生證據(jù)的可信度。為了最終實現(xiàn)臨床應用，也需要逐步在臨床試驗中擴大樣本量，篩選其適應證，并監(jiān)測遠期不良反應。因此，還需要對干細胞聚合體的臨床操作制定臨床技術標準規(guī)范，從而規(guī)范未來聚合體應用，促進臨床再生的技術方案。