羅嘉俊 黃曉桃 吳云霞

1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院第二臨床學(xué)院,武漢 430030

2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬湖北省婦幼保健院中西醫(yī)結(jié)合科,武漢 430070

3華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院生物藥學(xué)系,武漢 430030

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)系育齡期婦女常見(jiàn)疾病,世界范圍內(nèi)約有15%的女性受其困擾[1]?；加蠵COS的女性因雄激素分泌過(guò)多、排卵不規(guī)則導(dǎo)致生育能力低下且容易合并多種并發(fā)癥,包括2型糖尿病、肥胖、精神疾病等。成年女性被診斷為PCOS需要滿足以下3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)中的2個(gè):①高雄激素血癥;②排卵減少;③符合鹿特丹標(biāo)準(zhǔn)的PCOS形態(tài)[2]。高雄激素血癥在PCOS的發(fā)病過(guò)程中起關(guān)鍵作用。雄激素可抑制卵泡成熟并導(dǎo)致大量小竇卵泡的出現(xiàn)及無(wú)排卵[3],并表現(xiàn)出家族遺傳性,預(yù)估遺傳率為70%,但在PCOS中只有一部分遺傳性可通過(guò)已確定的易感位點(diǎn)來(lái)解釋[4]。PCOS臨床表現(xiàn)存在高度異質(zhì)性,且其病因復(fù)雜,涉及遺傳、生殖、內(nèi)分泌代謝及環(huán)境等多種因素,而PCOS動(dòng)物模型有利于促進(jìn)我們對(duì)PCOS病因?qū)W和病理生理學(xué)的理解。嚙齒動(dòng)物因體型小、繁殖周期短,用于實(shí)驗(yàn)研究較為方便,成為目前建立PCOS模型最常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。本文主要總結(jié)PCOS嚙齒動(dòng)物模型特點(diǎn)并對(duì)PCOS中醫(yī)證候模型進(jìn)行探索,以便為將來(lái)更好地評(píng)價(jià)藥物特別是中藥防治PCOS提供借鑒與參考。

1 PCOS嚙齒動(dòng)物模型

1.1 雄激素造模

1.1.1 DHEA造模法 脫氫表雄酮(dehydroepiandrosterone,DHEA)是青春期女性體內(nèi)首個(gè)出現(xiàn)的雄激素,也是第一種用于誘發(fā)PCOS動(dòng)物模型的藥物。當(dāng)經(jīng)外源性途徑增加體內(nèi)DHEA水平致使雄烯二酮水平升高時(shí),雌酮和睪酮也隨之升高,從而引起高雄激素血癥,并出現(xiàn)卵泡發(fā)育不佳、排卵障礙以及卵巢多囊樣改變等癥狀[5]。Lee等[6]在1991年通過(guò)對(duì)大鼠皮下注射DHEA成功誘導(dǎo)出了PCOS模型。

1.1.2 TP造模法 在高雄激素環(huán)境中垂體對(duì)下丘腦的刺激不敏感,致使黃體生成素(luteinizing hormone,LH)持續(xù)性分泌,卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)的促排卵作用由于雌激素持續(xù)分泌產(chǎn)生負(fù)反饋效應(yīng)而受到抑制,因此出現(xiàn)排卵障礙等PCOS相關(guān)癥狀[5]。Azeemuddin等[7]對(duì)大鼠給予溶于橄欖油的丙酸睪丸酮(testosterone propionate,TP)溶液1.25 mg/d發(fā)現(xiàn),模型組出現(xiàn)睪酮升高、體質(zhì)量增加、動(dòng)情周期不規(guī)則及胰島素抵抗等PCOS樣癥狀。

1.1.3 DHT造模法 雙氫睪酮(dihydrotestosterone,DHT)是睪酮在體內(nèi)非芳香化的代謝產(chǎn)物,有較高的雄激素活性,能減少顆粒細(xì)胞的數(shù)量和降低芳香化酶的活性,導(dǎo)致雌激素合成減少和卵泡閉鎖[5]。Gao等[8]選用21日齡雌性SD大鼠并連續(xù)給藥DHT,發(fā)現(xiàn)大鼠出現(xiàn)體質(zhì)量增加、卵泡閉鎖、激素水平改變及代謝紊亂等PCOS癥狀。

1.2 基因敲除模型

1.2.1 ErbB4基因敲除小鼠 在與PCOS相關(guān)的20個(gè)單核苷酸多態(tài)性中有表皮生長(zhǎng)因子受體4(ErbB4)基因[9]。根據(jù)人類蛋白質(zhì)圖譜,ErbB4在大腦、內(nèi)分泌器官和女性組織中強(qiáng)烈表達(dá)。有研究將顆粒細(xì)胞中的ErbB4條件性刪除,以確定它是否促進(jìn)PCOS樣生殖功能障礙的發(fā)展,并研究相關(guān)分子機(jī)制[10]。將帶有柔化ErbB4基因的小鼠與Amh-Cre小鼠雜交,并特異性地刪除卵巢中的該基因發(fā)現(xiàn),ErbB4-Amh cre雌鼠出現(xiàn)發(fā)情周期中斷、排卵延遲和次級(jí)階段卵泡阻滯及低生育力,表明ErbB4信號(hào)參與調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育[10]。

1.2.2 DENND1A基因敲入和敲除小鼠 DENND1A是另一個(gè)與PCOS相關(guān)的易感位點(diǎn)。為了建立過(guò)表達(dá)人DENND1A的轉(zhuǎn)基因小鼠模型,有研究使用了3個(gè)啟動(dòng)子:CMV、Lhcgr和Tet[11]。這些都沒(méi)有導(dǎo)致DENND1A.V2蛋白的過(guò)表達(dá),可能其他技術(shù)如CRISPR/Cas9,能成功將人類DENND1A.V2樣基因引入小鼠。值得注意的是,在DENND1A基因敲除小鼠中發(fā)現(xiàn)該基因?qū)ε咛グl(fā)育至關(guān)重要[12]。因此通過(guò)敲入和敲除基因來(lái)確定易感位點(diǎn)在PCOS生殖、代謝和行為表型中的作用,對(duì)于理解PCOS模型也有重要價(jià)值。

1.3 女性產(chǎn)前雄激素暴露模型

通過(guò)小鼠產(chǎn)前DHT暴露,可了解母體雄激素過(guò)量對(duì)后代生育健康的影響。產(chǎn)前DHT暴露會(huì)導(dǎo)致生殖功能障礙,睪酮和LH升高,女性月經(jīng)周期不規(guī)則和PCOS樣形態(tài)[13-15]。近期研究表明,產(chǎn)前雄激素暴露小鼠的神經(jīng)激肽B和下丘腦腹內(nèi)側(cè)核細(xì)胞中雄激素受體增加,孕激素受體和強(qiáng)啡肽蛋白表達(dá)減少,表明孕激素負(fù)反饋受損[16]。研究認(rèn)為,早期開(kāi)始抗雄激素治療可增加PCOS婦女自發(fā)受孕和分娩的可能性[17]。此外,雄激素受體缺陷保護(hù)雌性F1后代在成年時(shí)不會(huì)發(fā)展成PCOS樣表型[18-19],這提示通過(guò)雄激素受體介導(dǎo)PCOS樣發(fā)展的重要性。

1.4 女性產(chǎn)前AMH暴露模型

研究表明,產(chǎn)前抗繆勒管激素(anti-Mullerian hormone,AMH)暴露引發(fā)母親促性腺激素釋放激素(gonadotrophin releasing hormone,GnRH)驅(qū)動(dòng)的雄激素過(guò)量,導(dǎo)致PCOS樣生殖障礙表型,如陰道發(fā)育和青春期延遲、動(dòng)情周期不規(guī)則,成年雌性后代在5個(gè)月時(shí)出現(xiàn)LH、睪酮和AMH的升高[20]。另一方面,產(chǎn)前AMH暴露的雄性后代盡管青春期開(kāi)始延遲,但是循環(huán)中的LH、睪酮或AMH與雌性后代相比沒(méi)有差別,這表明產(chǎn)前AMH暴露的效應(yīng)在性別上有差異[20]。研究表明,產(chǎn)前AMH暴露的影響通過(guò)GnRH途徑介導(dǎo),但并不能排除雄激素受體途徑的作用[20-21]。為此,研究人員使用了吻素蛋白(kisspeptin,KISS)特異性雄激素受體缺陷小鼠[20],并發(fā)現(xiàn)產(chǎn)前暴露于AMH的KISS特異性雄激素受體缺陷小鼠在F1雌性和F1雄性后代中均不受PCOS樣生殖特征的影響,這表明AMH和雄激素在產(chǎn)前存在密切的相互作用。

2 PCOS的中醫(yī)病因病機(jī)

2.1 腎虛

《素問(wèn)·上古天真論》曰:“女子七歲,腎氣盛,齒更發(fā)長(zhǎng);二七而天癸至,任脈通,太沖脈盛,月事以時(shí)下,故有子”。腎藏先天之精,主生殖,為人體生命之本原。腎具有貯存、封藏精氣的作用。腎所藏之精稱為腎精,可分為先天之精和后天之精。先天之精稟受于父母,是人體生長(zhǎng)發(fā)育和生殖的物質(zhì)基礎(chǔ)。后天之精來(lái)源于脾胃化生的水谷之精,可化生五臟精氣,維持臟腑的生理功能,并下輸腎中,充養(yǎng)先天之精。二者相互作用,共同促進(jìn)人的生長(zhǎng)發(fā)育和生殖。腎精化生腎氣,又稱元?dú)?是化生臟腑之氣的根本。人出生以后隨著腎氣的充盈而產(chǎn)生天癸,天癸來(lái)至,女子月經(jīng)來(lái)潮,生殖器官發(fā)育成熟。腎氣分為腎陰和腎陽(yáng),腎陽(yáng)為一身陽(yáng)氣之本,能溫煦臟腑,促進(jìn)精血津液運(yùn)行。若腎陽(yáng)虛衰,其溫煦作用減弱,則脾土不溫,氣血生化無(wú)力,致血海空虛,胞宮失養(yǎng),可導(dǎo)致女子月經(jīng)不調(diào)、宮寒不孕。陰無(wú)陽(yáng)不生,若陽(yáng)氣虧虛,則陰精生化無(wú)源,卵子生長(zhǎng)發(fā)育缺乏物質(zhì)基礎(chǔ),難以成熟;又因陽(yáng)氣虛衰,推動(dòng)和激發(fā)作用減弱,則排卵受阻。

又腎主水,具有主司和調(diào)節(jié)全身水液代謝的作用。若腎陽(yáng)不足,氣化無(wú)力,升降失司,則水濕停聚,日久則成痰濕。故《證治匯補(bǔ)》曰:“痰之源,出于腎,故勞損之人,腎中火衰,不能收攝,邪水、冷痰上泛”。痰濕為陰邪,其性黏滯,易襲陰位,故易壅塞、阻滯胞宮,卵巢無(wú)法正常排卵,導(dǎo)致孕育困難。研究表明,瘀血滯留可明顯增加PCOS的發(fā)病[22]。流行病學(xué)研究顯示,臨床有40%～50%PCOS患者被辨證為腎虛痰濕型[23];曾倩等[24]的研究顯示,在PCOS患者中,單一證型出現(xiàn)頻率最高是腎虛證,占94.7%。由此可知,PCOS主要病機(jī)為腎虛。

2.2 脾虛失運(yùn)

《素問(wèn)·太陰陽(yáng)明論》曰:“脾與胃以膜相連”。脾胃同居中焦,脾主運(yùn)化,胃主收納,共同完成消化飲食、化生水谷精微的作用,故稱脾胃為“倉(cāng)廩之本”。脾主運(yùn)化,一可運(yùn)化水谷,若脾失健運(yùn),則水谷不化,氣血不充,臟腑失于濡養(yǎng)、功能受損;二可運(yùn)化水液,若脾失健運(yùn),轉(zhuǎn)輸功能失常,則水液停聚,以致水濕痰飲,痰濕困于胞宮則致女子不孕。《萬(wàn)氏女科》載:“婦人女子,經(jīng)閉不行,乃脾胃損”。張瓊[25]報(bào)道PCOS從痰論治,每獲良效?！夺t(yī)鏡》載:“肥人多濕,其痰易結(jié),亦有因濕而血滯者”。李娜[26]運(yùn)用補(bǔ)腎化痰方藥治療PCOS實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,發(fā)現(xiàn)其對(duì)改善內(nèi)膜容受性有較好的效果。

2.3 肝郁

肝主疏泄,可疏通、暢達(dá)全身氣血津液。肝主疏泄,調(diào)暢各臟腑經(jīng)絡(luò)之氣的升降出入。若肝失疏泄,則肝氣不舒,氣機(jī)郁結(jié),可導(dǎo)致情緒抑郁不樂(lè)、焦慮,或肝郁化火,癥見(jiàn)性情急躁、易怒。當(dāng)情志受各種誘因波動(dòng)反饋至下丘腦的情緒調(diào)節(jié)中樞時(shí),下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸作用于內(nèi)分泌系統(tǒng)而引起卵巢的一系列變化。因肝克脾,肝郁可致脾失健運(yùn),運(yùn)化失司則水濕匯聚成痰;又因肝腎同源,肝郁氣滯日久病變可累及腎臟,造成肝腎同病。肖雯暉等[27]研究表明,七情中的情志不舒因素最容易導(dǎo)致PCOS,并引起激素分泌紊亂和激素水平低下。

2.4 沖任虛損

沖任二脈均起于胞中,任脈在腹面正中線走行,與各陰經(jīng)均有聯(lián)系,故被稱為“陰脈之海”。其可調(diào)節(jié)全身陰經(jīng)氣血,亦可調(diào)節(jié)女子生殖功能,又有“任主胞胎”之稱。沖脈則容納和調(diào)節(jié)十二經(jīng)脈的氣血,故被稱為“十二經(jīng)脈之?！?又被稱為“血?！?。天癸可調(diào)節(jié)任脈和沖脈的盛衰,天癸充足才能任脈通、沖脈盛,進(jìn)而接受來(lái)自各經(jīng)脈的氣血,注入胞宮以維持生殖功能。若任、沖二脈氣血虧虛或氣滯血瘀,則會(huì)影響女性生殖功能,出現(xiàn)月經(jīng)不調(diào)、不孕等癥狀。

3 PCOS相關(guān)中醫(yī)證候模型探討

上述提到并已建立的西醫(yī)PCOS動(dòng)物模型均較為成熟且符合人類PCOS的表現(xiàn)。而目前中醫(yī)根據(jù)腎虛、肝郁、脾虛等證候特點(diǎn)已廣泛建立相應(yīng)的動(dòng)物證候模型,但尚無(wú)中西醫(yī)結(jié)合PCOS模型的報(bào)道,而單用西醫(yī)的PCOS模型來(lái)評(píng)價(jià)中藥的療效明顯有其局限性,因此本文提出,嘗試運(yùn)用二者相結(jié)合的模型用于中藥的篩選和機(jī)制研究,以符合中醫(yī)的辨證思想和特點(diǎn),具體探索如下:

3.1 PCOS腎虛模型探討

有研究者[28]通過(guò)肌肉注射氫化可的松和灌胃甲狀腺片的方式分別制造腎陽(yáng)虛和腎陰虛大鼠模型,并觀測(cè)造模后大鼠與正常大鼠的行為活動(dòng)差異、體重和體溫的變化、cAMP/cGMP比值變化,以判斷造模是否符合腎陽(yáng)虛和腎陰虛的特點(diǎn)。另有學(xué)者通過(guò)灌胃腺嘌呤[29]、雷公藤多苷[30]等直接損傷腎組織,使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物表現(xiàn)出腎虛證候。另有通過(guò)手術(shù)摘除腎臟[31]、甲狀腺[32]、卵巢[33]等,影響機(jī)體相關(guān)激素的分泌,以達(dá)到建造腎虛模型的目的。而根據(jù)“恐傷腎”的中醫(yī)理論,可通過(guò)驚嚇或恐嚇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的方式使動(dòng)物出現(xiàn)腎虛相關(guān)證候。沈雁等[34]利用“貓嚇鼠”的方式制造腎虛模型,并發(fā)現(xiàn)造模后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)生殖功能受損的情況。另外,“勞則氣耗”,通過(guò)強(qiáng)迫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物游泳而過(guò)度勞累的方式也可使動(dòng)物出現(xiàn)腎虛證候[35]。在實(shí)驗(yàn)中,可以選擇雄激素給藥、產(chǎn)前雄激素或AMH暴露、基因敲除PCOS模型中的一種或者多種與上述腎虛造模方法中的一種或多種相結(jié)合來(lái)模擬PCOS腎虛模型。

3.2 PCOS肝郁模型探討

呂愛(ài)平等[36]用鉗夾大鼠尾部激怒大鼠使其處于斗爭(zhēng)狀態(tài),模型復(fù)制后大鼠出現(xiàn)易怒撕咬的表現(xiàn)。李楊等[37]分離大鼠頸部迷走神經(jīng)后連接生物信號(hào)分析系統(tǒng)進(jìn)行刺激,發(fā)現(xiàn)造模后大鼠出現(xiàn)食欲減低、倦怠乏力、毛發(fā)變暗等表現(xiàn)。張小麗等[38]用0.2 mL 0.1%腎上腺素灌胃刺激大鼠后,大鼠出現(xiàn)煩躁不安、激怒、相互撕咬,幾日后毛色變黃、精神萎靡、飲食變少等表現(xiàn)。在實(shí)驗(yàn)中,可以選擇雄激素給藥、產(chǎn)前雄激素或AMH暴露、基因敲除PCOS模型中的一種或者多種與上述肝郁造模方法中的一種或多種相結(jié)合來(lái)模擬PCOS肝郁模型。

3.3 PCOS脾虛模型探討

董一昕等[39]采用利血平構(gòu)建脾虛模型,發(fā)現(xiàn)大鼠出現(xiàn)倦怠乏力、反應(yīng)淡漠、喜歡蜷縮等癥狀,提示脾虛模型成功。李婷婷等[40]發(fā)現(xiàn)大黃水煎液灌胃7 d的動(dòng)物模型存在結(jié)腸黏膜水腫等病理?yè)p傷。孫瑜嬬等[41]采用飲食不節(jié)加勞倦過(guò)度法制備脾虛大鼠模型,發(fā)現(xiàn)大鼠唾液腺組織形態(tài)和唾液生化指標(biāo)發(fā)生改變。孫勝振等[42]采用苦寒瀉下法——冰水復(fù)合大黃水煎液灌胃復(fù)制小鼠脾虛泄瀉模型,發(fā)現(xiàn)模型組小鼠的小腸推進(jìn)率和血漿血管活性腸肽含量明顯升高,胃殘留率和血漿中的胃動(dòng)素含量明顯降低。在實(shí)驗(yàn)中,可以選擇雄激素給藥、產(chǎn)前雄激素或AMH暴露、基因敲除PCOS模型中的一種或者多種與上述脾虛造模方法中的一種或多種相結(jié)合來(lái)模擬PCOS脾虛模型。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

目前PCOS動(dòng)物模型的建立已經(jīng)有一定的成果,包括注射雄激素法、產(chǎn)前雄激素暴露法和基因編輯等均取得較為滿意的效果,但各種造模方法的具體表現(xiàn)不盡相同,比如:來(lái)曲唑誘導(dǎo)的大鼠模型有血清中孕酮濃度降低的特點(diǎn),而雄激素造模的動(dòng)物模型血清中睪酮明顯增高;但均能符合人類PCOS的表現(xiàn)。中醫(yī)根據(jù)腎虛、肝郁、脾虛等證候的特點(diǎn)已經(jīng)廣泛建立相應(yīng)的證候模型,但目前尚沒(méi)有與PCOS的直接關(guān)聯(lián)報(bào)道。目前,中醫(yī)藥在PCOS的預(yù)防和治療上發(fā)揮越來(lái)越重要的作用,因此有必要制造適合評(píng)價(jià)中醫(yī)藥療效的動(dòng)物模型,而有關(guān)中西醫(yī)結(jié)合的PCOS動(dòng)物模型尚未見(jiàn)報(bào)道。若能將中醫(yī)PCOS模型與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)模型結(jié)合,比如利用組織特異性雄激素受體敲除結(jié)合中醫(yī)腎虛、脾虛和肝郁等特點(diǎn)分別造?；蚵?lián)合造模,創(chuàng)建出既符合中醫(yī)證候又滿足現(xiàn)代醫(yī)學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的PCOS動(dòng)物模型,對(duì)于評(píng)價(jià)中醫(yī)藥治療PCOS的療效和推進(jìn)相關(guān)研究將有重要的作用。