林 瑾， 周康熙

( 1. 閩江師范高等?？茖W校 化學與生物技術(shù)學院， 福建 福州 350109；2. 福州大學 食品科學技術(shù)研究所， 福建 福州 350108 )

0 引言

近年來由于人們對天然色素的需求量增加，紅曲色素日益受到重視。 紅曲色素是紅曲霉產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，是一種安全性較高的多組分混合色素[1]。 它被用于肉制品、腐乳、紅曲黃酒等食品及口紅等化妝品的著色，并兼具抑菌、抗氧化、降脂等功效[2]。 工業(yè)化應用時，紅曲色素的粗提物就能具有良好的著色、防腐、保健等效果，但在進行功效評估時，需先對其進行分離純化和表征[3]。 本文綜述了紅曲色素的分離純化、表征與功效評估方面的研究進展，同時提出組分與功效評估方面有待改進之處，旨在為紅曲色素進一步開發(fā)應用提供思路。

1 紅曲色素的提取與分離純化

紅曲色素來源于紅曲霉，是一類聚酮化合物的混合物，一般可經(jīng)過紅曲霉發(fā)酵培養(yǎng)后獲得，也可從紅曲米中提取。 根據(jù)最大吸收波長的不同，紅曲色素通?？煞譃榧t、橙、黃三類。 通過菌株篩選、優(yōu)化發(fā)酵條件、基因修飾等技術(shù)，可以有效提高紅曲色素的產(chǎn)量。 為了更深入地認識和研究紅曲色素的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，通常需要對其進行提取和分離純化。

1.1 提取

紅曲色素多以醇溶性色素存在于紅曲霉胞內(nèi)，而水溶性色素多分泌于胞外[4]。 提取時遵循相似相溶原理，水溶液可提取水溶性紅曲色素，醇溶性紅曲色素可利用乙醚、乙醇、乙酸乙酯等有機溶劑提取，有機溶劑還可改變細胞膜與細胞壁的通透性，有利于胞內(nèi)色素溶出。 乙醇溶液是比較常用的提取溶劑，成本低、易揮發(fā)，并能蒸餾回收，且粗提物中殘留的微量乙醇并不影響色素的實際應用，因此乙醇浸提法被廣泛應用。

浸提法的提取率有限，通常需要輔以其他方式來提高提取率，常見的方法包括改變體系的溫度和pH 值、微波輔助提取、超聲波輔助提取、添加表面活性劑、CO2超臨界萃取等，它們通過細胞破碎或增加紅曲色素溶解性來優(yōu)化提取率。 工業(yè)化應用時要考慮提取工藝的可行性和成本。 CO2超臨界萃取法對設(shè)備要求高，成本高，工業(yè)化應用難度較大。 表面活性劑能提高紅曲霉發(fā)酵的色素產(chǎn)量及提取量，但該方法目前尚處于科研試驗階段，在生產(chǎn)實際中面臨不少難題，如表面活性劑難以完全去除、色素組分與萃取劑緊密結(jié)合難以洗脫、所用的表面活性劑難于符合當下法律法規(guī)等。改變體系的溫度和pH 值法、微波輔助提取法和超聲波輔助提取法工藝簡單、成本低，更適合工業(yè)化應用。

1.2 分離純化

提取紅曲色素后，為明確其主要功效成分，往往需要對其進行分離純化。 紅曲色素按顏色可分為紅曲紅色素、紅曲橙色素、紅曲黃色素三大類。根據(jù)實際需求可采用不同的分離純化方法。 常用的分離純化方法有薄層色譜法、柱層析法、高效液相色譜法、高速逆流色譜法等。 這些方法根據(jù)不同紅曲色素在同一體系中的吸附解離程度不同而分離。

薄層色譜法可低成本地獲取樣品中紅曲色素的構(gòu)成。 黃艷等以甲苯/乙酸乙酯/甲酸＝7/3/1(V/V)的展開劑對紅曲色素進行薄層色譜分離，發(fā)現(xiàn)Monascussp.W1 色素有1 條橙色條帶和5條黃色條帶[5]。 屈炯等通過薄層層析法以甲苯/乙酸乙酯/甲酸＝7/3/1(V/V)為展開劑分離出7種紅色素； 以正己烷/乙酸乙酯/石油醚＝30/17/15(V/V)為展開劑分離出4 種黃色素； 以甲苯/乙酸乙酯/甲酸＝7/3/2(V/V)分離出2 種橙色素[6]。

當需要粗分體積較大的紅曲色素時， 可選用柱層析法。 徐偉等以正己烷/乙酸乙酯＝5/1(V/V)的混合液分離了紅曲黃色素， 以乙酸乙酯分離了紅曲橙色素， 以乙酸乙酯/甲醇＝5/1(V/V)的混合液分離了紅曲紅色素[7]。 楊強等以正己烷/乙酸乙酯＝1/8(V/V)的混合液通過硅膠柱分離出紅曲黃色素[8]。

薄層色譜法和柱層析法適合進行粗分離， 而高效液相色譜法能更好地分離出單一組分。Mukherjee 等利用半制備型的高效液相色譜分離出了一種新的紅曲紅色素[9]； Huang 等建立了新的液相檢測方法并從紅曲米中分離檢測出了紅斑素和紅曲紅素[10]。

“高速逆流色譜技術(shù)” 是近幾年興起的一項物質(zhì)分離新技術(shù)， 它的固定相和流動相都是液體， 避免了傳統(tǒng)分離純化方法可能導致部分紅曲色素被固體的固定相不可逆吸附的問題。 鄭允權(quán)等構(gòu)建了高速逆流色譜分離方法并分離了6 種紅曲色素， 純度均大于98.5%[11]。 薛春茂將正己烷/甲醇/水靜止分層后， 上層為固定相、 下層為流動相， 該方法對紅曲素和紅斑紅曲素分離效果良好[12]。

上述紅曲色素的分離純化方法中， 薄層層析法、 柱層析法和高速逆流色譜法都需要再借助其他的檢測手段來確定物質(zhì)的純度， 如薄層層析法和柱層析法常與紫外-可見分光光度計聯(lián)用、 高速逆流色譜需要與高效液相色譜聯(lián)用。 液相色譜法可以最直觀地得知分離效果， 但色素組分復雜， 要分離出目標組分的色素往往需要檢測條件上的摸索。

2 紅曲色素的表征

2.1 結(jié)構(gòu)表征

為探知未知色素的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)， 需要對其進行表征。 紅曲色素常用的結(jié)構(gòu)表征方法有紅外光譜法、 核磁共振法和質(zhì)譜法等。

紅外光譜可以快速進行紅曲色素的結(jié)構(gòu)變化表征。 張金彪等以堿解法制備水溶性紅曲紅色素[13]。 紅外光譜表明， 堿解后， 紅曲色素在1 715和1 200 cm-1處的特征峰消失了， 表明內(nèi)酯鍵已被水解； 在1 600 和1 400 cm-1處出現(xiàn)了新的吸收峰， 生成了羧酸鹽。 紫外-可見光譜顯示，紅曲紅色素在堿解之后， 其最大吸收波長488 nm，比反應前藍移了12nm， 因而顏色偏向于橙色。

當要進行結(jié)構(gòu)推斷時， 往往需要多種手段聯(lián)合使用。 Mukherjee 等利用紫外可見分光光譜法、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用、 紅外光譜法和核磁共振聯(lián)用技術(shù)， 對分離出的紅色素進行結(jié)構(gòu)表征， 該化合物為9-(1-羥基己基)-3-(2-羥丙基)-6a-甲基-9，9a-二氫呋喃[2，3-h]異喹啉-6， 8(2H，6aH)-二酮， 分子式為C21H29NO5[9]。 Liu 等綜合利用紅外光譜、 核磁共振和質(zhì)譜三種方法， 對紅曲黃色素進行結(jié)構(gòu)表征， 確定其化合物為苯甲醛衍生物， 具體結(jié)構(gòu)為6-(4-羥基-2-氧戊基)-3-甲基-2，4-二氧環(huán)己烷甲醛， 分子量為439.2[14]。

目前已探明分子結(jié)構(gòu)的紅曲色素， 除了6 種最常見的色素外， 還存在其他種類的色素。 2012年， Feng 等通過前人的研究報道總結(jié)了已探明結(jié)構(gòu)的52 種紅曲色素[15]； 2019 年， Chen 等又綜合了近年來對紅曲色素結(jié)構(gòu)的研究， 補充已探明的紅曲色素至100 多種[16]。

2.2 性質(zhì)表征

紅曲色素的性質(zhì)表征能夠加深人們對其性質(zhì)的認識。 紅曲色素的色調(diào)、 穩(wěn)定性及溶解性是它在應用過程中最受關(guān)注的三個性質(zhì)。

色調(diào)。 由于紅曲色素成分復雜， 掃描其全波長光譜所得的曲線是所有色素組分吸光值疊加的結(jié)果。 部分學者將410、 465、 505 nm 及其附近波長分別定性為紅曲黃色素、 紅曲橙色素、 紅曲紅色素的特征吸收波長[17]。 但此定性方法在黃色素和橙色素的判別上有待考量。 由紅曲紅色素經(jīng)過化學方法轉(zhuǎn)化的紅曲黃色素， 其最大吸收波在470～490 nm 之間， 比紅曲橙色素的最大吸收波長更長； 在日本標準中， 紅曲黃色素的吸光值范圍在458～468 nm 之間， 韓國的標準在460 nm左右[18]。 許贛榮等在綜合多份紅曲黃色素樣品全波長檢測的基礎(chǔ)上， 提出了以色調(diào)輔助判斷紅曲色素顏色的觀點， 利用不同顏色對應的吸光值的比值作為色調(diào)判斷的依據(jù)[19]。 目前已有其他學者使用色調(diào)這一指標對含紅曲色素的樣品進行顏色判斷: 李瑞杰等以 OD400nm/OD510nm和OD400nm/OD470nm來跟蹤發(fā)酵液顏色隨發(fā)酵時間變化的情況[20]； 楊成龍等以O(shè)D505nm/OD388nm為色調(diào)判斷發(fā)酵液及菌絲體是否偏紅[21]。

穩(wěn)定性。 溫度、 pH 值及光照等條件會影響紅曲色素的穩(wěn)定性。 Shi 等研究表明， 紅曲色素在pH ＝2.5 ～8.0 的條件下吸光值會發(fā)生變化，同時在pH 值較高時， 橙色素與氨基化合物的胺反應顯著增強， 使橙色素含量降低[22]。 Jeon 等通過實驗表明， pH＞11 時紅曲色素降解速率加快； 降解速率隨著溫度的升高而增加， 其光穩(wěn)定性高低順序為: 暗室＞紫外光＞熒光＞日光[23]。Vendruscolo 等探討了紅曲發(fā)酵液中橙、 紅色素的穩(wěn)定性， 兩種色素的熱解遵循一級動力學反應， 降解常數(shù)的溫度依賴性遵循阿倫紐斯模型[24]。 Jung 等探究表明， 紅曲色素的18 種氨基酸衍生物的穩(wěn)定性與濃度呈正相關(guān)， pH 值的增加使色素穩(wěn)定性降低[25]。

溶解性。 紅曲色素的溶解性與結(jié)構(gòu)、 溶劑性質(zhì)有關(guān)。 多數(shù)紅曲色素組分的醇溶性比水溶性要好， 在工業(yè)化應用中， 往往要增強其水溶性。 半天然水溶性紅曲黃色素可從天然醇溶性紅曲紅色素轉(zhuǎn)化而來。 紅斑素和紅曲紅素分子中的環(huán)羰基在含硫化合物的作用下還原成羥基， 在堿性條件下分子中的內(nèi)酯鍵打開形成羧酸鹽， 該過程會改變色素的溶解性[26]。 在不破壞紅曲色素結(jié)構(gòu)情況下， 可采用包埋的方法增加其水溶性。 徐洋等利用淀粉類化合物對紅曲色素包埋后噴霧干燥，能增加色素的水溶性[27]。

3 紅曲色素的功效評估

據(jù)《本草綱目》 記載， 紅曲主治消食活血、健脾燥胃； 治赤白痢、 下水谷； 治女人血氣痛及產(chǎn)后惡露不盡。 這說明了紅曲的傳統(tǒng)藥用價值。紅曲色素作為紅曲的主要活性物質(zhì)之一， 自古以來被人們用以肉制品著色、 制作腐乳、 釀造黃酒以及中醫(yī)入藥。

現(xiàn)代科學研究表明， 紅曲色素具有特殊的官能團和共扼結(jié)構(gòu)， 有抗氧化、 降血脂、 降血糖等生物活性， 可以調(diào)節(jié)機體脂代謝和糖代謝， 抑制氧化應激反應和炎癥反應等[28]。 目前， 紅曲色素的功效評估方法主要有體外實驗和動物實驗。

3.1 體外實驗

體外實驗是功效評估的快速手段之一， 目前通過體外實驗已探明的紅曲色素的功效有: 抗氧化性、 抑菌活性、 抗腫瘤性等。

不同底物發(fā)酵而得的紅曲色素種類及含量不同， 其抗氧化活性也不同。 Srianta 等證明了用大米為原料固態(tài)發(fā)酵紅曲霉所產(chǎn)生的紅曲色素對DPPH 的清除能力優(yōu)于玉米、 全高粱和高粱麩皮這三種原料發(fā)酵產(chǎn)生的紅曲色素， 且色素含量越高抗氧化活性越高[29]。 Li 等采用相轉(zhuǎn)化法制備了一種包裹紅曲黃色素的新型玉米油基納米乳液， 該物質(zhì)不僅有良好的DPPH 自由基清除能力， 還可以提高脂肪酶的水解能力[30]。 陳忠旭構(gòu)建了腎小球內(nèi)皮細胞氧化損傷模型和高糖損傷模型， 通過實驗觀察紅曲色素對這些損傷模型的保護作用， 結(jié)果表明， 紅曲色素可以下調(diào)糖尿病腎病相關(guān)因子的表達， 提高抗氧化蛋白表達， 提高氧化損傷的腎小球內(nèi)皮細胞的活力和抗氧化能力， 保護線粒體， 抑制了細胞凋亡和細胞炎癥的發(fā)生[31]。 此外， Wu 等研究發(fā)現(xiàn)， 不同結(jié)構(gòu)紅曲黃色素的抗氧化和抗炎活性不同， 這也表明紅曲色素的功效與其組分息息相關(guān)[32]。

紅曲色素的抑菌活性同樣與其組分相關(guān)。Kim 等研究表明， 紅曲色素的抑菌活性與其附著力有關(guān)， 較高抑菌活性的疏水性色素對大腸桿菌的吸附率優(yōu)于低抑菌活性的親水性色素[33]。Wong 等通過中子和X 射線誘變出了一株紫色紅曲霉， 它對芽孢桿菌的抑菌活性比野生菌株更強， 且抑菌活性與組分Monascidin 有關(guān)[34]。Vendruscolo 等對紅曲霉CCT 3802 進行液態(tài)深層發(fā)酵， 其產(chǎn)生的紅曲橙色素對金黃色葡萄球菌有抑制作用， 而紅曲紅色素除了能夠抑制金黃色葡萄球菌以外， 還能抑制大腸桿菌[35]。

紅曲色素具有抗腫瘤性。 Chang 等利用高粱廢液發(fā)酵紅曲霉CWT715， 其發(fā)酵液對肝癌細胞SK-Hep-1 的抗侵襲能力與色素含量呈正相關(guān)[36]。 Chiu 等利用電離輻射和紅曲色素聯(lián)合抵御PC-3 人前列腺癌細胞， 其聯(lián)合療法可增強DNA 損傷和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激， 誘導PC-3 細胞自噬，聯(lián)合治療比單獨治療療效更佳[37]。

3.2 動物實驗

紅曲色素作為一種藥食兩用的添加劑， 其藥理學功效需要動物實驗驗證。

動物實驗表明， 紅曲色素具有抗腫瘤、 減肥降脂等作用。 例如， Akihisa 等構(gòu)建了小鼠皮膚癌變的動物模型， 實驗表明紅曲色素對小鼠癌變具有顯著的抑制作用[38]。 Rezaei 等利用紫色紅曲霉所產(chǎn)的色素飼喂大鼠， 結(jié)果表明添加了紅曲色素的實驗組的大鼠血清膽固醇和甘油三酯水平顯著降低[39]。 Ning 等利用卵磷脂和殼聚糖之間的靜電組裝構(gòu)建了紅斑素的卵磷脂/殼聚糖納米藥物載體， 并通過CCK-8 實驗證明了該納米藥物對小鼠乳腺癌4T1 細胞具有顯著毒性， 這也證明了紅斑素的抗腫瘤效果[40]。 分子生物學技術(shù)在動物實驗中的應用有利于從基因表達的角度揭示紅曲色素功效的機理。 Lee 等通過大鼠飼養(yǎng)實驗證明了紅曲色素具有顯著的抗肥胖作用， 能夠抑制CCAT/增強子結(jié)合蛋白β(c/ebpβ)表達，增加脂肪酶活性， 從而抑制脂肪生成[41]。 Lee 等用兩種紅曲色素組分(Monascin 和Ankaflavin)連續(xù)28 天投喂患有阿茲海默癥的大鼠， 結(jié)果顯示這兩種紅曲色素降低了海馬和皮層的p-tau、 載脂蛋白E(apo E)和β 位點淀粉樣前體蛋白裂解酶(bace)的表達水平， 提高了可溶性淀粉樣前體蛋白α(SAPα)的表達水平， 從而提高患病大鼠的記憶和學習能力[42]。 汪攀對一株高產(chǎn)紅曲色素的紫色紅曲霉M-32 進行了基因組測序， 并將該菌株制成菌粉后添加到飼料中飼喂凡納濱對蝦， 結(jié)果表明該菌粉能顯著提高凡納濱對蝦腸道益生菌的豐度， 并增強其對副溶血性弧菌感染的抵抗力[43]。

近年來， 國內(nèi)外一些研究團隊陸續(xù)提供了紅曲霉基因組的有關(guān)數(shù)據(jù)， 這有助于從遺傳特性的角度為紅曲色素的生物合成提供有用的信息[44]。此外， 轉(zhuǎn)錄組學和代謝組學技術(shù)也逐漸被應用于紅曲色素的相關(guān)研究中， 有利于進一步揭示紅曲霉生物合成紅曲色素的代謝機理[45-46]。

4 紅曲色素研究的發(fā)展方向

4.1 挖掘紅曲色素主要功效成分

目前對紅曲色素組分的研究主要集中于Monascorubramine、 Rubropunctamine、 Monascorubrin、 Rubropunctatin、 Monascin 和Ankaflavin 這6 種。 然而紅曲霉種類多， 所產(chǎn)色素的種類及含量也各不相同， 這就需要更加深入挖掘紅曲色素這一復雜而又寶貴的資源。 在探討紅曲色素的性質(zhì)及功效時， 應明確色素中具體的成分。 此外，對紅曲色素粗提物進行降脂和抑菌功效評估時，要排除其他代謝物對試驗結(jié)果的干擾， 例如紅曲霉的次級代謝產(chǎn)物中， 他汀類物質(zhì)具有降脂作用， 桔霉素具有抑菌作用。 色素粗提物的功效往往不僅取決于某一種色素， 而可能是多種色素的協(xié)同效果， 因而這些色素需要被明確。

4.2 建立色素組成與功效評估之間的關(guān)系

實際應用時， 單組分的紅曲色素產(chǎn)量有限，且分離純化成本較高。 另外， 多種功能性色素組分的協(xié)同作用往往優(yōu)于單組分色素的功效。 當前紅曲色素的應用仍集中于食品的著色與防腐， 若能建立成分與功效間的關(guān)系， 不僅可以開拓保健品市場， 還可以降低醫(yī)藥工業(yè)中相關(guān)藥物的成本。

當色素組分的化學結(jié)構(gòu)已知時， 可根據(jù)其性質(zhì)推測可能發(fā)生的生化反應， 也有利于對其功效進行機理分析。 此外， 在分析其功效時， 應對其藥理作用做機理分析， 才能更好地為紅曲色素的應用提供借鑒。

4.3 尋找非紅曲霉來源的“紅曲色素”

部分紅曲霉因產(chǎn)生桔霉素而受到安全性質(zhì)疑，盡管從菌株篩選、 培養(yǎng)條件優(yōu)化、 代謝調(diào)控、 基因敲除等手段能降低桔霉素含量， 但紅曲色素制品依然可能含有桔霉素。 除了紅曲霉以外， 其他微生物也會產(chǎn)生紅色的色素。 據(jù)報道， Qiu 等從銀杏枝條中分離出一株產(chǎn)紫青霉Penicillium purpurogenumSX01， 能產(chǎn)大量紅色素[47]； Jin 等從產(chǎn)紫青霉Penicillium purpurogenumLi-3 菌株中分離出了一種紅色素， 該色素具有較好的抗氧化和抑菌活性[48]； Venkatachalam 等從印度洋留尼汪島珊瑚礁的外坡分離出一株真菌Talaromyces albobiverticillius30548， 并從中分離出4 種結(jié)構(gòu)類似于紅曲色素的物質(zhì)[49]。 從大自然中尋找高產(chǎn)功能性紅色素的高安全性菌株可能是未來紅曲色素的一個發(fā)展方向， 對這些新發(fā)現(xiàn)的菌株進行代謝產(chǎn)物解析及功能性評價， 有望推動色素行業(yè)的發(fā)展。

5 結(jié)語

紅曲色素的應用歷史悠久， 隨著現(xiàn)代醫(yī)學、生物學的發(fā)展， 紅曲色素的保健功能逐漸受到重視， 應深入挖掘紅曲色素這一寶貴資源。 菌株選育、 培養(yǎng)條件優(yōu)化、 代謝調(diào)控、 基因編輯等方法都能定向提高色素產(chǎn)量， 但這些方法都建立在各種色素成分及功效都明確的基礎(chǔ)之上。 因此， 從成分與功效的關(guān)系出發(fā)去研究色素的增產(chǎn)， 會使得相關(guān)研究更有應用價值。 欲探明色素組分與功效之間的關(guān)系， 又回到最初的色素提取、 純化、表征和功效評估的基礎(chǔ)研究上。 相信隨著相關(guān)技術(shù)的發(fā)展， 紅曲色素產(chǎn)業(yè)能夠不斷降低成本、 提高功效， 實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)飛躍發(fā)展。