張潔 王新 馬崇歡 李丁山 劉國坤 丁新倫 吳祖建

摘要

為了明確福建省三明地區(qū)柑橘病毒類病原（病毒和類病毒）種類，利用RTPCR技術(shù)對其進行了鑒定和檢測，并對其檢出率進行了分析。結(jié)果表明，從207份柑橘葉片樣品中檢出柑橘衰退病毒（citrus?tristeza?virus，?CTV）、柑橘黃化脈明病毒（citrus?yellow?vein?clearing?virus，?CYVCV）、柑橘葉斑駁病毒（citrus?leaf?blotch?virus，?CLBV）和蚜蟲致死麻痹病毒（aphid?lethal?paralysis?virus，?ALPV）等4種病毒以及柑橘曲葉類病毒（citrus?bent?leaf?viroid，?CBLVd）、啤酒花矮化類病毒（hop?stunt?viroid，?HSVd）、柑橘矮化類病毒（citrus?dwarfing?viroid，?CDVd）、柑橘類病毒Ⅴ?（citrus?viroid?Ⅴ，?CVd?Ⅴ）和柑橘類病毒Ⅵ?（citrus?viroid?Ⅵ，?CVd?Ⅵ）等5種類病毒。其中，CTV、CYVCV、CLBV和ALPV的檢出率分別是71.01%、66.67%、0.97%和6.28%，CBLVd、HSVd、CDVd、CVd?Ⅴ和CVd?Ⅵ的檢出率分別是7.25%、28.50%、13.04%、9.18%和6.76%。同時發(fā)現(xiàn)，CTV和CYVCV復合侵染的檢出率為54.59%，而品種‘大分1號的病毒檢出率相對較低。本研究首次在柑橘葉片中檢測到ALPV。

關鍵詞

柑橘;?病毒;?類病毒;?檢出率

中圖分類號：

S?436.661.1

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022129

Identification?and?detection?of?citrus?viruses?and?viroids?in?Sanming?area，?Fujian?province，?China

ZHANG?Jie#，?WANG?Xin#，?MA?Chonghuan，?LI?Dingshan，?LIU?Guokun，?DING?Xinlun*，?WU?Zujian

（Institute?of?Plant?Virology，?Fujian?Agriculture?and?Forestry?University，?State?Key?Laboratory?of?Ecological?Pest

Control?for?Fujian?and?Taiwan?Crops，?Fuzhou?350002，?China）

Abstract

Virus?and?viroid?species?were?identified?and?detected?by?RTPCR?on?citrus?in?Sanming，?Fujian，?and?the?detection?rates?were?analyzed.?The?results?showed?that?citrus?tristeza?virus?（CTV），?citrus?yellow?vein?clearing?virus?（CYVCV），?citrus?leaf?blotch?virus?（CLBV）?and?aphid?lethal?paralysis?virus?（ALPV），?as?well?as?citrus?bent?leaf?viroid?（CBLVd），?hop?stunt?viroid?（HSVd），?citrus?dwarfing?viroid?（CDVd），?citrus?viroid?Ⅴ?（CVd?Ⅴ）?and?citrus?viroid?Ⅵ?（CVd?Ⅵ）?were?identified?from?207?samples.?Among?them，?the?detection?rates?of?CTV，?CYVCV，?CLBV?and?ALPV?were?71.01%，?66.67%，?0.97%?and?6.28%，?respectively，?and?those?of?CBLVd，?HSVd，?CDVd，?CVd?Ⅴ?and?CVd?Ⅵ?were?7.25%，?28.50%，?13.04%，?9.18%?and?6.76%，?respectively.?Moreover，?the?detection?rate?of?CTV?and?CYVCV?mixed?infection?was?54.59%，?and?the?virus?detection?rate?on?‘Dafen?No.1?was?relatively?low.?In?this?study，?ALPV?was?detected?on?citrus?for?the?first?time.

Key?words

citrus;?virus;?viroid;?detection?rate

柑橘屬于蕓香科Rutaceae植物，在世界農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)中占有重要地位。柑橘香氣怡人，味道甜美，營養(yǎng)豐富，深受消費者的喜愛，再加上柑橘易于栽培、產(chǎn)量可觀、種植效益優(yōu)異等諸多優(yōu)點，使之成為我國栽培面積廣、產(chǎn)量高的果樹之一。然而柑橘病毒類病害不斷出現(xiàn)［1］，我國已報道的柑橘病毒主要有柑橘衰退病毒（citrus?tristeza?virus，?CTV）［2］、溫州蜜柑萎縮病毒（satsuma?dwarf?virus，?SDV）［3］、柑橘碎葉病毒（citrus?tatter?leaf?virus，?CTLV）［4］、柑橘黃化脈明病毒（citrus?yellow?vein?clearing?virus，?CYVCV）［5］、柑橘葉斑駁病毒（citrus?leaf?blotch?virus，?CLBV）［6］、柑橘鱗皮病毒（citrus?psorosis?virus，?CPsV）［7］、柑橘脈突病毒（citrus?vein?enation?virus，?CVEV）［8］和柑橘褪綠矮縮病毒（citrus?chlorotic?dwarfassociated?virus，?CCDaV）［9］等8種;已報道的類病毒主要有柑橘裂皮類病毒（citrus?exocortis?viroid，?CEVd）、柑橘樹皮裂紋類病毒（citrus?bark?cracking?viroid，?CBCVd）、柑橘曲葉類病毒（citrus?bent?leaf?viroid，?CBLVd）、啤酒花矮化類病毒（hop?stunt?viroid，?HSVd）、柑橘矮化類病毒（citrus?dwarfing?viroid，?CDVd）、柑橘類病毒Ⅴ（citrus?viroid?Ⅴ，?CVd?Ⅴ）和柑橘類病毒Ⅵ?（citrus?viroid?Ⅵ，?CVd?Ⅵ）［10］等7種。其中CYVCV引起的柑橘黃脈病是我國一種新發(fā)病害，自從2009年在云南瑞麗發(fā)現(xiàn)以來［5］，幾乎遍布所有柑橘產(chǎn)區(qū)［11］。另外，柑橘黃化斑駁相關病毒（citrus?yellow?mottleassociated?virus，?CiYMaV）?2020年首次在巴基斯坦的柑橘上報道［12］，與CYVCV同屬于甲型線性病毒科Alphaflexiviridae印度柑橘病毒屬Mandarivirus，我國柑橘上尚未發(fā)現(xiàn)該病毒［12］。而蚜蟲致死麻痹病毒（aphid?lethal?paralysis?virus，?ALPV）首次從南非的禾谷縊管蚜Rhopalosiphum?padi中分離，屬于雙順反子病毒科Dicistroviridae蟋蟀麻痹病毒屬Cripavirus［1314］。近年來，隨著大規(guī)模測序技術(shù)的發(fā)展，ALPV在多種植物中被檢測到［1516］。

福建省三明市擁有悠久的柑橘種植歷史，目前該地區(qū)的柑橘種植面積和年產(chǎn)量均位列福建省前茅，是福建省重要的柑橘生產(chǎn)地區(qū)。近幾年，該地區(qū)多處柑橘果園出現(xiàn)了黃化、樹勢減弱等疑似病毒病癥狀，對當?shù)馗涕佼a(chǎn)業(yè)造成了嚴重威脅。本研究利用RTPCR技術(shù)對該地區(qū)柑橘的多種病毒和類病毒進行了檢測分析。

1?材料與方法

1.1?材料

柑橘葉片樣品采集于福建省三明市莘口鎮(zhèn)及其周邊地區(qū)。采用隨機取樣法，不同地塊及不同品種等共采集207份樣品，主要為溫州蜜柑的不同品種（含‘大分1號20份、‘大浦28份、‘宮川17份、‘肥之署9份、‘市文8份、‘宮本6份、‘由良4份、‘大分4號3份、‘山川3份以及未知品種92份）和少量其他柑橘類品種（17份）。樣品及時放入液氮速凍并置于超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2?方法

1.2.1?總RNA的提取

參照姜娟等［17］的方法并加以改進，使用TaKaRa?RNAiso?Plus［寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司］進行總RNA的提取。步驟簡述如下：取30?mg柑橘葉片用液氮研磨;加入1?mL?RNAiso?Reagent，振蕩混勻后室溫靜置，12?000?r/min離心5?min，取上清液加入200?μL氯仿，振蕩混勻后室溫靜置，12?000?r/min離心15?min;取上清液加入等體積異丙醇，-20℃靜置，12?000?r/min離心10?min，棄上清液并保留沉淀，加入75%乙醇洗滌沉淀，隨后加入20?μL?RNaseFree?ddH2O溶解，即得總RNA，置于超低溫冰箱中保存。

1.2.2?RTPCR

使用GenStar?StarScript?Ⅱ?Firststrand?cDNA?Synthesis?Mix（北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司）進行第一鏈cDNA的合成，反應體系為：總RNA?1?μg，2×RT?Reaction?Mix（with?Primer）10?μL，StarScript?Ⅱ?RT?Mix?1?μL，DEPCddH2O補足至20?μL。反應程序為：42℃?30?min，85℃?5?min，4℃保存，得到的第一鏈cDNA置于-20℃冰箱中保存。

使用Phanta?Max?SuperFidelity?DNA?聚合酶（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）進行PCR反應（引物序列見表1），反應體系為：2×Phanta?Max?Buffer?25?μL，dNTP?Mix?（10?mmol/L）?1?μL，上、下游引物（10?μmol/L）各2?μL，Phanta?Max?SuperFidelity?DNA?Polymerase?1?μL，第一鏈cDNA?4?μL，ddH2O?15?μL。反應程序為：95℃預變性3?min;95℃?15?s，退火溫度?15?s，72℃?30?s/kb，30個循環(huán);72℃?5?min;16℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，目的條帶使用HiPure?Gel?Pure?DNA?Mini試劑盒（廣州美基生物科技有限公司）進行產(chǎn)物回收。

1.2.3?克隆載體連接

使用Zero?Background?pTOPOTA?Simple克隆試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）進行TA克隆：純化的DNA片段40?ng，pTOPOTA?Simple?Vector?1?μL，10×Enhancer?1?μL，ddH2O補足至10?μL，室溫靜置5?min，得到的連接產(chǎn)物使用TRANS?Trans1T1?Phage?Resistant化學感受態(tài)細胞（北京全式金生物技術(shù)有限公司）進行大腸桿菌轉(zhuǎn)化。PCR篩選的陽性克隆菌株由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司進行測序。

2?結(jié)果與分析

2.1?柑橘病毒類病原的檢測

本研究利用特異性引物（表1）對柑橘上常見的病毒和類病毒分別進行RTPCR擴增，結(jié)果如圖1所示，有4種病毒和5種類病毒擴增得到特異性條帶，分別是CYVCV（614?bp）、CTV（553?bp）、CLBV（425?bp）、ALPV（1?388?bp）、HSVd（316?bp）、CDVd（297?bp）、CBLVd（233?bp）、CVd?Ⅵ（236?bp）和CVd?Ⅴ（190?bp），經(jīng)由測序分析后確認為目的病毒或類病毒片段。而對CiYMaV、CTLV、CPsV、SDV、CBCVd?和CEVd的RTPCR檢測均未得到特異性條帶（圖片未示出）。

2.2?柑橘病毒類病原的檢出率分析

為了明確三明地區(qū)柑橘病毒和類病毒的侵染情況，對采集的207份樣品進行RTPCR擴增，并對其檢出率進行計算。結(jié)果顯示，

CTV和CYVCV兩種病毒的檢出率較高，分別達71.01%和66.67%;HSVd和CDVd兩種類病毒的檢出率分別為28.50%和13.04%;其他病原的檢出率由高到低分別是CVd?Ⅴ?9.18%、CBLVd?7.25%、CVd?Ⅵ?6.76%、ALPV?6.28%和CLBV?0.97%（圖2）。

2.3?柑橘病毒類病原的復合侵染分析

為了明確病毒和類病毒復合侵染情況，對所有樣品單獨和復合侵染的檢出率進行統(tǒng)計。結(jié)果顯示，全部207份樣品中，檢出病毒（含所有病毒）的樣品有172份，檢出類病毒（含所有類病毒）的樣品有103份，檢出率分別為83.09%、49.76%。而復合侵染最多的組合是CTV+CYVCV，具有這種復合侵染組合的樣品數(shù)為46份，檢出率為22.22%;另外CTV+CYVCV+HSVd復合侵染組合的樣品數(shù)為22份，檢出率為10.63%;另有2份樣品同時被6種病毒或類病毒復合侵染，分別是CTV+CYVCV+ALPV+CLBV+HSVd+CDVd和CTV+CYVCV+HSVd+CDVd+CBLVd+CVd?Ⅵ;所有含有CTV和CYVCV的樣品數(shù)為113份，檢出率為54.59%（圖3）。

2.4?不同溫州蜜柑品種中病毒類病原的檢出特征分析

為了分析該地區(qū)主要種植的溫州蜜柑品種與已檢出病毒類病原檢出率之間的相關性，選擇樣品大于6份的品種進行分析。結(jié)果顯示，‘大分1號的病毒檢出率最低，為25.00%;‘宮川‘宮本和‘市文的病毒檢出率高達100%;類病毒的檢出率與病毒檢出率之間無明顯關系，但‘宮本和‘肥之署的2種病原檢出率均較高（表2）。

3?結(jié)論與討論

本研究對福建三明地區(qū)柑橘病毒類病原進行了鑒定，結(jié)果表明該地區(qū)柑橘病毒病發(fā)病率較高，尤其是CTV和CYVCV;病原物種類多，有4種病毒和5種類病毒，并且復合侵染嚴重，其中CTV和CYVCV的復合侵染較高。CYVCV幾乎遍布我國所有柑橘產(chǎn)區(qū)［11］。CTV引起的柑橘衰退病對全世界的柑橘產(chǎn)業(yè)都造成嚴重損失［23］，在我國柑橘產(chǎn)區(qū)也均有不同程度的發(fā)生［22，2426］。CTV和CYVCV復合侵染的情況已被多次報道［2729］，但二者復合侵染對柑橘產(chǎn)業(yè)的影響有待進一步研究。而與CYVCV同屬于印度柑橘病毒屬的CiYMaV在本地區(qū)未檢測到，與前人的研究結(jié)果一致［12］。

本實驗室前期通過高通量測序發(fā)現(xiàn)柑橘樣品中可能存在ALPV，本研究通過RTPCR技術(shù)驗證了ALPV的存在。研究表明，雙順反子病毒科的病毒，比如ALPV和禾谷縊管蚜病毒（rhopalosiphum?padi?virus，?RhPV），可利用非寄主植物（不能復制）作為“載體”從而侵染新昆蟲寄主（可復制），而植物與該類病毒互惠共生的關系，或可被植物用來作為天然的生物農(nóng)藥［30］。ALPV已在玉米［16］、黃瓜［15］、菜豆［31］等植物中發(fā)現(xiàn)，本研究首次在柑橘上檢測到該病毒，而ALPV與柑橘的關系有待進一步研究。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)‘大分1號的病毒檢出率較低，‘宮本‘宮川和‘肥之署的檢出率較高，這與胡啟鑌的結(jié)果［32］一致，與之略有差異的是本研究中‘市文的病毒檢出率為100%，或許與該樣品數(shù)量較少并且檢測病毒不只包括CYVCV有關。綜上，實際生產(chǎn)過程中，柑橘種植戶或可因地制宜合理引種‘大分1號。

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（責任編輯：田?喆）