湯亞飛 李正剛 佘小漫 于琳 藍(lán)國兵 李戰(zhàn)彪 何自福

摘要

番茄斑駁花葉病毒?（tomato?mottle?mosaic?virus，?ToMMV）是2013年發(fā)現(xiàn)的煙草花葉病毒屬一個新種，目前在多國（地區(qū)）有發(fā)生。本文采用小RNA深度測序及RTPCR檢測方法在廣東省廣州市南沙區(qū)辣椒疑似病樣中檢測到ToMMV，命名為番茄斑駁花葉病毒廣東分離物（ToMMVGD2020）。采用RTPCR分段擴(kuò)增獲得了ToMMVGD2020的基因組全序列，該分離物基因組全長6?399?nt，包含4個開放閱讀框，分別編碼4個蛋白。序列相似性分析表明，ToMMVGD2020與已登錄GenBank的14個ToMMV分離物基因組序列相似性分別為99.0%～99.7%，其中與中國遼寧分離物ToMMVLN（GenBank登錄號：MN853592）的相似性最高（99.7%），與危害我國番茄、同屬煙草花葉病毒屬的番茄花葉病毒?（tomato?mosaic?virus，?ToMV）、番茄褐色皺果病毒?（tomato?brown?rugose?fruit?virus，?ToBRFV）代表分離物的相似性分別為84.6%和81.0%。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，ToMMVGD2020與該病毒各分離物親緣關(guān)系均較近，與中國遼寧分離物親緣關(guān)系最近。利用ToMMV的PCR特異引物對廣東其他6個市采集的67份辣椒疑似病毒病樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果均為陰性，這說明ToMMV目前還是局部危害廣東省辣椒。本文是首次報(bào)道在廣東發(fā)現(xiàn)ToMMV，對監(jiān)測ToMMV在我國的擴(kuò)散具有重要意義。

關(guān)鍵詞

番茄斑駁花葉病毒;?辣椒;?分子鑒定;?病毒基因組序列

中圖分類號：

S?436.412.11

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022085

First?report?of?tomato?mottle?mosaic?virus?in?Guangdong?province?of?China

TANG?Yafei1，?LI?Zhenggang1，?SHE?Xiaoman1，?YU?Lin1，?LAN?Guobing1，?LI?Zhanbiao2*，?HE?Zifu1*

（1.?Plant?Protection?Research?Institute，?Guangdong?Academy?of?Agricultural?Sciences，?Guangdong?Provincial?Key

Laboratory?of?High?Technology?for?Plant?Protection，?Guangzhou?510640，?China;?2.?Plant?Protection?Research

Institute，?Guangxi?Academy?of?Agricultural?Sciences，?Guangxi?Key?Laboratory?for?Biology?of?Crop?Diseases?and

Insect?Pests，?Nanning?530007，China）

Abstract

Tomato?mottle?mosaic?virus?（ToMMV）?was?a?novel?species?belonging?to?Tobamovirus?genus?discovered?in?2013.?At?present，?ToMMV?has?occurred?in?many?countries?（regions）.?In?this?paper，?ToMMV?was?detected?in?disease?pepper?samples?collected?from?Nansha?district，?Guangzhou?city，?Guangdong?province，?using?small?RNA?deep?sequencing?and?RTPCR?techniques.?The?isolate?was?named?as?tomato?mottle?mosaic?virus?Guangdong?isolate?（ToMMVGD2020）.?The?whole?genome?sequence?of?ToMMVGD2020?was?obtained?by?RTPCR.?The?whole?genome?of?this?isolate?was?6?399?nt?in?length?and?contained?four?open?reading?frames，?encoding?four?proteins，?respectively.?The?whole?genome?sequence?of?ToMMVGD2020?shared?99.0%-99.7%?nt?identities?with?other?isolates?of?ToMMV?deposited?in?GenBank，?with?the?highest?nt?identity?to?the?isolate?Liaoning?（GenBank?accession?number：?MN853592）?at?99.7%，?shared?84.6%?and?81.0%?nt?identities?with?tomato?mosaic?virus?（ToMV）?and?tomato?brown?rugose?fruit?virus?（ToBRFV），?which?belonged?to?the?genus?Tobamovirus，?respectively.?Phylogenetic?analysis?showed?that?ToMMVGD2020?shared?more?relationship?with?each?of?ToMMV?isolates，?and?the?closest?relationship?with?Liaoning?isolate?of?ToMMV.?ToMMV?was?not?detected?in?67?diseased?pepper?samples?collected?from?other?six?cities?in?Guangdong?province.?The?result?indicated?that?ToMMV?infected?peppers?locally?in?Guangdong?province.?This?is?the?first?report?of?ToMMV?in?Guangdong?province，?which?is?great?significance?for?monitoring?the?spread?of?ToMMV?in?China.

Key?words

tomato?mottle?mosaic?virus;?pepper;?molecular?identification;?virus?genome?sequence

辣椒Capsicum?annuum?L.是一種重要蔬菜作物和調(diào)味品。據(jù)國家大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系統(tǒng)計(jì)，近年來辣椒種植面積穩(wěn)定在210萬hm2以上，占全國蔬菜總播種面積的9.28%，已成為種植面積最大的蔬菜作物［1］。病毒病是辣椒生產(chǎn)上的主要病害，在全球各辣椒產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，嚴(yán)重影響辣椒的產(chǎn)量與品質(zhì)。廣東省是我國辣椒生產(chǎn)大省之一，年種植面積約10萬hm2，其中冬種面積超過70%。病毒病每年給廣東辣椒生產(chǎn)造成不同程度的損失，危害辣椒的病毒種類眾多，世界各地已報(bào)道危害辣椒的病毒有70種以上，而我國發(fā)現(xiàn)至少有37種［2］。關(guān)于危害廣東辣椒的病毒種類，前人利用鑒別寄主、血清學(xué)及RTPCR等技術(shù)從廣東辣椒病樣中檢測到黃瓜花葉病毒（cucumber?mosaic?virus，?CMV）、煙草花葉病毒（tobacco?mosaic?virus，?TMV）、馬鈴薯Y病毒（potato?virus?Y，?PVY）等13種［36］。本團(tuán)隊(duì)利用小RNA深度測序及RTPCR檢測技術(shù)，鑒定出侵染廣東辣椒的病毒有14種，分別為CMV、TMV、PVY、辣椒輕斑駁病毒（pepper?mild?mottle?virus，?PMMoV）、甜椒內(nèi)源RNA病毒（bell?pepper?endornavirus，?BPEV）、煙草輕型綠花葉病毒（tobacco?mild?green?mosaic?virus，?TMGMV）、辣椒脈斑駁病毒（chilli?veinal?mottle?virus，?ChiVMV）、辣椒黃脈病毒1?（pepper?vein?yellow?virus?1，?PeVYV1）、甜椒斑駁病毒（pepper?veinal?mottle?virus，?PVMV）、辣椒環(huán)斑病毒（chilli?ringspot?virus，?ChiRSV）、辣椒黃脈病毒6?（pepper?vein?yellow?virus?6，?PeVYV6）、辣椒褪綠病毒（capsicum?chlorosis?virus，?CaCV）、蠶豆萎蔫病毒2號（broad?bean?wilt?virus?2，?BBWV2）、辣椒隱癥病毒1?（pepper?cryptic?virus?1，?PCV1），且復(fù)合侵染很普遍［7］。

番茄斑駁花葉病毒tomato?mottle?mosaic?virus（ToMMV）屬植物桿狀病毒科Virgaviridae煙草花葉病毒屬Tobamovirus成員，是一種（＋）ssRNA病毒，基因組全長約為6.4?kb，主要侵染番茄、辣椒、茄子等茄科作物，引起植株表現(xiàn)斑駁、花葉、生長緩慢等癥狀，嚴(yán)重影響產(chǎn)量和品質(zhì)。ToMMV最先發(fā)現(xiàn)于墨西哥番茄上［8］，隨后在中國［910］、美國［11］、以色列［12］、西班牙［13］、巴西［14］等國家也相繼報(bào)道發(fā)現(xiàn)該病毒危害番茄、辣椒。在我國，最先發(fā)現(xiàn)危害云南的辣椒［9］，截至目前，海南、云南、湖南、遼寧、山東、河南、河北、陜西、西藏和內(nèi)蒙古等?。ㄗ灾螀^(qū)）的番茄、辣椒、茄子等茄科作物已受到該病毒的危害，該病毒已在我國擴(kuò)散和流行，極有可能成為危害茄科作物的主要病毒之一［1516］。目前，GenBank數(shù)據(jù)庫中已登錄有來自墨西哥、美國、巴西、荷蘭、西班牙和中國6個國家的14個ToMMV分離物的全基因組序列，包括來自中國海南和遼寧的2個番茄分離物、云南和西藏的2個辣椒分離物全基因組序列。

2020年，作者團(tuán)隊(duì)對危害廣東省辣椒的病毒種類進(jìn)行監(jiān)測與鑒定，首次在廣州市南沙區(qū)辣椒病樣中檢測到ToMMV，進(jìn)一步對ToMMV廣東分離物的全基因組進(jìn)行了克隆與序列分析，同時對廣東省其他地區(qū)辣椒病樣進(jìn)行分子檢測，以期監(jiān)測該病毒并為該病毒病的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?材料

供試樣品：2019年-2021年，從廣東省辣椒產(chǎn)區(qū)采集田間表現(xiàn)花葉、斑駁、環(huán)斑、皺縮、褪綠等癥狀疑似病毒病的辣椒葉片樣品77份，其中湛江19份、茂名9份、韶關(guān)16份、肇慶8份、河源7份、佛山8份、廣州10份，置于-80℃冰箱保存待用。

主要試劑和儀器：植物RNA提取試劑RNAiso?Plus、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript?Ⅱ?1st?Strand?cDNA?Synthesis?Kit）、Premix?TaqTM?（Ex?TaqTM?Version?2.0?plus?dye）和pMD?19T?Vector購自寶生物工程（大連）有限公司;瓊脂糖凝膠回收試劑盒（GeneJET?Gel?Extraction?Kit）購自美國Thermo賽默飛公司;大腸桿菌Escherichia?coli?T1化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;T100TM?Thermal?cycler?PCR儀、Universal?HoodⅡ凝膠成像系統(tǒng)以及電泳儀均購自美國BIORAD公司;植物組織自動研磨儀MM400購自德國Retsch（萊馳）公司。

1.2?小RNA深度測序和分析

對2020年6月從廣東省廣州市南沙區(qū)萬頃沙鎮(zhèn)采集的10份辣椒病葉混合成2份樣品進(jìn)行小RNA深度測序。采用TRIzol方法提取待測樣品總RNA，構(gòu)建滿足Illumina平臺測序的小RNA文庫，通過Illumina?nextseq?500測序儀進(jìn)行深度測序;應(yīng)用Cutadapt［17］和質(zhì)量分?jǐn)?shù)預(yù)處理方法對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行去除接頭序列等預(yù)處理，然后對預(yù)處理后的數(shù)據(jù)采用SPAdes［18］拼接;利用BLAST程序?qū)⑵唇有蛄信cGenBank數(shù)據(jù)庫中的已知病毒基因組序列進(jìn)行相似性比對，根據(jù)相似性結(jié)果初步判斷樣品中存在的病毒。上述深度測序和分析由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.3?RTPCR擴(kuò)增驗(yàn)證

根據(jù)小RNA深度測序獲得病毒序列，應(yīng)用引物在線設(shè)計(jì)網(wǎng)站（http：∥primer3.ut.ee/）設(shè)計(jì)引物，檢測ToMMV的引物為ToMMVF：5′CACGCAGAACTACGCTGCGTTGTCCG3′，ToMMVR：

5′CCGGACAACTCAGGTGAATTAAAGTTC3′，擴(kuò)增的目的片段大小為807?bp;檢測PVMV的引物為PVMVF：

5′GGTTTGGTGTATAGAAAATGGG3′，PVMVR：5′CAGACTCTATCAGGTGGTATAAC

3′，

擴(kuò)增的目的片段大小為758?bp;檢測ToMV的引物為ToMVF：5′AAACCGCTTTTTAGCGGCAG3′，ToMVR：5′TATTAATGAGTTTATC

GATCTGTC3′，擴(kuò)增的目的片段大小為322?bp;引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以用于小RNA深度測序的單個病樣為模板，采用Trizol法分別提取10份待測辣椒病葉的總RNA，進(jìn)一步用隨機(jī)引物（大連TaKaRa公司）逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)體系和具體方法按照試劑盒說明書操作，然后利用所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：反轉(zhuǎn)錄合成cDNA?1?μL，ExTaq?PCR?MIXER?25?μL，10?μmol/L的上、下游引物各2?μL，加滅菌水至總體積50?μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4?℃?4?min;94?℃?30?s，55℃?30?s，72?℃?1?min，35個循環(huán);72?℃?10?min。根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小和產(chǎn)物直接測序結(jié)果確定病樣中的病毒種類。

1.4?病毒基因組全長的擴(kuò)增與測定

通過對登錄在GenBank數(shù)據(jù)庫中14條ToMMV全基因組序列進(jìn)行對比，設(shè)計(jì)4對覆蓋全基因組的引物（表1）。以小RNA深度測序與RTPCR相結(jié)合確定存在ToMMV的樣品cDNA為模板，利用所設(shè)計(jì)覆蓋ToMMV全基因組4對引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增（圖1）。PCR反應(yīng)體系同1.3，反應(yīng)程序?yàn)椋?94?℃?4?min;94?℃?30?s，55?℃?30?s，72?℃?2?min，35個循環(huán);72?℃?10?min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。應(yīng)用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，純化后連接到pMD19T載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌T1感受態(tài)細(xì)胞。在含100?μg/mL?Amp、40?μL/mL?Xgal的LB固體培養(yǎng)基上37℃倒置培養(yǎng)過夜;每個平板隨機(jī)挑取3個陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.5?病毒基因組全長序列分析

利用DNAStar軟件的SeqMan對所獲得的基因序列進(jìn)行拼接，獲得ToMMV基因組全長序列，利用BLAST程序在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列相似性搜索，并從GenBank數(shù)據(jù)庫下載已報(bào)道的14個ToMMV分離物及危害我國番茄且同屬于煙草花葉病毒屬的番茄花葉病毒（tomato?mosaic?virus，?ToMV）、番茄褐色皺果病毒（tomato?brown?rugose?fruit?virus，?ToBRFV）代表分離物的全基因組序列，用DNAStar的MegAlign進(jìn)行序列比較分析，采用MEGA?6.06的鄰接法（neighbor?joining，NJ）構(gòu)建進(jìn)化樹，bootstrap檢驗(yàn)1?000次。

1.6?其他地區(qū)病樣的檢測

利用擴(kuò)增ToMMV的引物ToMMVF/ToMMVR對2019年-2021年從廣東省其他地區(qū)采集的67份辣椒病樣進(jìn)行RTPCR檢測，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同1.3。根據(jù)PCR檢測確定ToMMV在廣東地區(qū)的分布。

2?結(jié)果與分析

2.1?小RNA深度測序以及RTPCR驗(yàn)證結(jié)果

2020年6月從廣東省廣州市南沙區(qū)采集田間表現(xiàn)花葉、斑駁、葉片皺縮、輕微叢生等典型病毒病癥狀的辣椒樣品10份（圖2），將其混合成2份樣品進(jìn)行小RNA深度測序。結(jié)果顯示，樣品1共獲得17?474?690條reads，除雜后為2?921?707條reads，拼接獲得179個contigs;經(jīng)與GenBank數(shù)據(jù)庫中報(bào)道的病毒序列進(jìn)行比對，其中有14條比對到ToMMV，相似性均高于94%～100%，長度為144～1?183?bp，11條比對到ToMV，相似性在97%以上，長度為111～322?bp，6條比對到PVMV，相似性在97%以上，長度為549～4?261?bp。樣品2共獲得16?853?953條reads，除雜后為4?835?767條reads，拼接獲得468個contigs;經(jīng)與GenBank數(shù)據(jù)庫中報(bào)道的病毒序列進(jìn)行比對，其中有7條比對到ToMMV，相似性在99%，長度為153～2?529?bp，9條比對到PVMV，相似性在97%以上，長度為235～2?261?bp。測序結(jié)果初步表明，廣東廣州南沙辣椒病葉混合樣品中可能含有ToMMV、ToMV、PVMV?3種病毒。

2.2?RTPCR驗(yàn)證小RNA深度測序結(jié)果

利用根據(jù)小RNA深度測序獲得病毒序列所設(shè)計(jì)的檢測ToMMV、ToMV和PVMV特異引物，對廣東省廣州市南沙區(qū)萬頃沙鎮(zhèn)2份混合樣品的10份單個樣品分別進(jìn)行RTPCR檢測，結(jié)果顯示：ToMMV、ToMV和PVMV特異引物能從不同的單株病樣中擴(kuò)增出預(yù)期大小的目的條帶（圖3），其中1份病樣為ToMV單獨(dú)侵染，1份病樣為ToMV和PVMV復(fù)合侵染，2份病樣為ToMMV和PVMV復(fù)合侵染，5份樣品為3種病毒復(fù)合侵染，還有1份病樣未檢測到這3種病毒。PCR產(chǎn)物測序結(jié)果表明，上述3個特異片段分別是對應(yīng)病毒ToMMV、ToMV和PVMV的基因片段。因此，引起廣東省廣州市南沙區(qū)辣椒病毒病的病原至少有ToMMV、ToMV和PVMV?3種病毒，且以復(fù)合侵染為主。

2.3?ToMMV廣東分離物的基因組結(jié)構(gòu)

以小RNA深度測序和RTPCR檢測驗(yàn)證確定含有ToMMV的病樣總RNA為模板，利用設(shè)計(jì)覆蓋全基因組的4對引物進(jìn)行分段PCR擴(kuò)增，均能擴(kuò)增出預(yù)期大小的目的片段（圖4），克隆、測序分析獲得大小分別為1?693、1?717、1?687、1?694?bp的4條片段，進(jìn)一步通過拼接獲得ToMMV廣東分離物（ToMMVGD2020）基因組全序列大小為6?399?nt（GenBank登錄號：OK180812），包含4個開放閱讀框，分別編碼復(fù)制相關(guān)蛋白（76-3?426?nt）、復(fù)制酶蛋白（76-4?926?nt）、運(yùn)動蛋白（4?910-5?716?nt）、外殼蛋白（5?719-6?198?nt）。

2.4?ToMMV廣東分離物的基因組全長序列分析

BLAST結(jié)果顯示，與ToMMVGD2020基因組全序列具有較高相似性的序列均為ToMMV分離物。采用MegAlign的Clustal?W方法比較結(jié)果表明（表2），ToMMVGD2020與登錄GenBank的ToMMV?14個分離物全基因組核苷酸序列相似性為99.0%～99.7%，其中與中國遼寧分離物ToMMVLN（GenBank登錄號：MN853592）的相似性最高，為99.7%，而與危害我國番茄、同屬煙草花葉病毒屬的ToMVSGZZ（GenBank登錄號：KY967221）、ToBRFVSD（GenBank登錄號：MT018320）的相似性分別為84.6%和81.0%。

對ToMMVGD2020、已登錄GenBank的14個ToMMV分離物、ToMVSGZZ和ToBRFVSD的全基因組序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示（圖5），ToMMVGD2020與來自墨西哥、中國、美國、巴西、荷蘭、西班牙6國的14個ToMMV分離物聚集在一個大分支上，其中與來自中國遼寧的LN分離物聚集在一個小分支，二者親緣關(guān)系最近，而與危害我國番茄的同屬病毒ToMVSGZZ和ToBRFVSD親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.5?廣東其他地區(qū)辣椒疑似病毒病樣品檢測結(jié)果

利用ToMMV的檢測引物ToMMVF/ToMMVR對2019年-2021年從廣東省湛江、茂名、韶關(guān)、肇慶、河源、佛山6個市采集的67份辣椒病樣進(jìn)行RTPCR擴(kuò)增，均未擴(kuò)增出目的片段，該結(jié)果初步表明ToMMV目前是在局部地區(qū)危害廣東省辣椒。

3?結(jié)論與討論

本文應(yīng)用小RNA深度測序與RTPCR檢測相結(jié)合的方法在廣東辣椒病樣中檢測到ToMMV，該病毒分離物基因組全長為?6?399?nt，與國際上已報(bào)道的14個ToMMV分離物基因組核苷酸序列相似性均超過99.0%，但在廣東7個市辣椒產(chǎn)區(qū)病樣中僅廣州市南沙區(qū)檢測發(fā)現(xiàn)該病毒。這是在廣東首次發(fā)現(xiàn)該病毒。

ToMMV是2013年發(fā)現(xiàn)的煙草花葉病毒屬一個新種，目前已在多國有發(fā)生和分布。在我國，2014年首次在辣椒上檢測到該病毒，目前在我國至少10個?。ㄗ灾螀^(qū)）已有發(fā)生，可見該病毒擴(kuò)散速度快，存在發(fā)生流行的趨勢［16］。2013年-2016年，本團(tuán)隊(duì)利用小RNA深度測序技術(shù)對侵染危害廣東辣椒的病毒進(jìn)行調(diào)查與鑒定，從廣東各地采集的辣椒病樣中檢測到14種病毒，但未檢測到ToMMV［6］。此后，本團(tuán)隊(duì)持續(xù)監(jiān)測辣椒病毒病發(fā)生動態(tài)。2020年，在廣州市南沙區(qū)辣椒產(chǎn)區(qū)病樣中檢測到ToMMV，說明ToMMV已擴(kuò)散傳播到廣東省，并危害辣椒。

本文采用分段擴(kuò)增、克隆獲得了ToMMV廣東分離物的基因組全長序列，該序列與國際上已報(bào)道的ToMMV各分離物間相似性均在99.0%以上;同時，ToMMV各分離物基因組序列相似性也均在99.0%以上，說明該病毒高度保守。這對開展抗病資源篩選與抗病品種選育十分有利。

ToMMV可通過汁液摩擦傳播，也可通過種子帶毒傳播［19］。該病毒自然條件下可侵染番茄、辣椒等茄科作物;人工接種條件下除茄科作物外，還可以侵染葫蘆科、豆科、十字花科等多種作物，且致病性比同屬的TMV更強(qiáng)，接種植株癥狀更嚴(yán)重［20］，而且ToMMV比ToMV的寄主范圍更廣，侵染性更強(qiáng)［21］?？梢姡琓oMMV的潛在危害性很大。2014年首次在云南辣椒上檢測到該病毒以來，ToMMV目前已在我國多個?。ㄗ灾螀^(qū)）發(fā)生，呈現(xiàn)流行與擴(kuò)散的趨勢，很有可能將成為危害我國蔬菜作物的主要病毒。本研究僅在廣東省廣州市南沙區(qū)辣椒上檢測到ToMMV，至于其是否危害其他作物及擴(kuò)散動態(tài)，還有待于進(jìn)一步監(jiān)測。

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（責(zé)任編輯：田?喆）