趙玉強 卓可兒 郭云 朱燦燦 王行軍 陸小美 田艷麗 胡白石

摘要

瘡痂病是薄殼山核桃上最具毀滅性的病害，帶菌植物材料是傳播瘡痂病的重要來源。準(zhǔn)確、靈敏、快速的檢測方法可為該病害流行規(guī)律調(diào)查和防控提供有力的依據(jù)。本文通過比較薄殼山核桃瘡痂病菌Venturia?effusa及其近似種之間的ITS序列差異，設(shè)計了特異性引物和TaqMan探針，建立了薄殼山核桃瘡痂病菌的熒光定量PCR檢測方法。特異性檢測結(jié)果表明，該方法可以檢測不同地區(qū)的薄殼山核桃瘡痂病菌菌株，而對其近似種以及薄殼山核桃上的其他真菌均沒有信號。本研究建立的檢測方法對薄殼山核桃瘡痂病菌DNA的最低檢測限可達0.5?pg/μL。該方法用于田間樣品檢測時，檢測時間僅需1?h，遠快于常規(guī)的分離培養(yǎng)法。本研究建立的基于TaqMan探針的熒光定量PCR檢測方法為薄殼山核桃瘡痂病菌的快速檢測和監(jiān)測提供了有力工具。

關(guān)鍵詞

薄殼山核桃瘡痂病菌;?熒光定量PCR;?TaqMan探針;?快速檢測

中圖分類號：

S?436.64

文獻標(biāo)識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022163

Development?and?application?of?TaqMan?fluorescence?quantitative?PCR?for?detection?of?Venturia?effusa

ZHAO?Yuqiang1*，?ZHUO?Keer2，?GUO?Yun2，?ZHU?Cancan1，?WANG?Xingjun3，?LU?Xiaomei4，TIAN?Yanli2，?HU?Baishi2

（1.?Institute?of?Botany，?Jiangsu?Province?and?Chinese?Academy?of?Sciences?（Nanjing?Botanical?Garden?Mem.

Sun?YatSen），?Nanjing?210014，?China;?2.?College?of?Plant?Protection，Nanjing?Agricultural?University，?Key

Laboratory?of?Integrated?Management?of?Crop?Diseases?and?Pests，?Ministry?of?Education，?Nanjing?210095，

China;?3.?Anhui?Fengyang?Plant?Protection?Station，?Chuzhou?233100，?China;?4.?Changzhou?Guomei

Agricultural?Technology?Co.，?Ltd.，?Changzhou?213245，?China）

Abstract

Venturia?effusa?causes?pecan?scab，?which?is?the?most?destructive?disease?in?pecan?orchards.?The?funguscarrying?plant?materials?are?the?important?sources?for?transmission?of?the?scab?disease.?Accurate，?sensitive?and?rapid?detection?of?the?pathogenic?fungi?provides?powerful?measures?for?investigation?of?epidemical?regularity?and?control?of?this?disease.?In?this?study，?a?pair?of?primers?and?a?TaqMan?probe?based?on?the?internal?transcribed?spacers?（ITSs）?of?V.effusa?and?its?related?species?were?designed?and?synthesized?for?fluorescence?quantitative?PCR?assay.?The?results?showed?that?the?fluorescence?quantitative?PCR?assay?facilitated?detection?of?all?V.effusa?strains?regardless?of?their?geographical?origins，?while?no?signals?were?detected?for?the?other?fungi?tested，?including?the?closely?related?Venturia?species?and?other?fungi?isolated?from?pecans.?The?detection?limit?of?this?assay?was?0.5?pg/μL?of?total?DNA.?Compared?to?conventional?culture?method，?the?fluorescence?quantitative?PCR?assay?was?rapid?and?reliable?for?detection?of?V.effusa?in?the?field;?the?whole?detection?process?can?be?finished?in?one?hour，?which?provides?a?valuable?tool?for?rapid?detection?and?identification?of?V.effusa.

Key?words

Venturia?effusa;?fluorescence?quantitative?PCR;?TaqMan?probe;?rapid?detection

薄殼山核桃Carya?illinoinensis?（Wangenh.）?K.?Koch又稱美國山核桃，是綠化的優(yōu)選樹種，其果實又稱碧根果，是世界著名的干果之一。薄殼山核桃原產(chǎn)于美國和墨西哥北部，因其較高的經(jīng)濟價值目前已被引種到全球20多個國家和地區(qū)［12］。大量研究表明，瘡痂病（scab）是薄殼山核桃上最具毀滅性的病害［35］。該病害起源于美國，目前已廣泛分布于全球各大薄殼山核桃種植區(qū)，包括美國、墨西哥、南美洲、南非以及中國［3，6］。我國引進薄殼山核桃已有100多年的歷史，在國內(nèi)先后建立了多處萬畝薄殼山核桃基地，發(fā)展勢頭強勁［68］。然而，隨著種植面積的不斷擴大，病蟲害發(fā)生日益嚴(yán)重，尤其是瘡痂病的發(fā)生嚴(yán)重影響了果實的產(chǎn)量和質(zhì)量。

薄殼山核桃瘡痂病的病原為散生黑星菌Venturia?effusa，可侵染薄殼山核桃的葉片、果實和嫩枝，導(dǎo)致植物的光合作用面積減少，進而影響果實的大小和質(zhì)量［35］。目前，薄殼山核桃瘡痂病菌的檢測主要以傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法為主［9］。然而，薄殼山核桃瘡痂病菌在人工培養(yǎng)條件下生長緩慢，容易受到其他腐生菌的干擾而使分離培養(yǎng)具有一定難度，同時檢測效率很低。尚未見關(guān)于薄殼山核桃瘡痂病菌分子生物學(xué)檢測的報道。

本研究基于TaqMan探針的熒光定量PCR方法建立了薄殼山核桃瘡痂病菌的快速檢測方法，構(gòu)建了標(biāo)準(zhǔn)曲線，并對方法的特異性和靈敏度進行了驗證，同時評價了該方法對實際樣品的檢測效果。

1?材料與方法

1.1?供試菌株

供試菌株包括分離自江蘇句容、高淳、金壇、泗洪和東海地區(qū)薄殼山核桃種植園的瘡痂病菌15株，以及薄殼山核桃瘡痂病菌的形態(tài)近似種和薄殼山核桃上分離的其他真菌共計21株。本研究的參試菌株分別來源于江蘇省中國科學(xué)院植物研究所和南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物檢疫實驗室（表1）。

1.2?儀器和試劑

熒光定量PCR儀為ABI公司生產(chǎn)的7500型。真菌DNA提取試劑盒為天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)。Premix?Ex?TaqTM（Probe?qPCR）、pMD19T載體連接試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自大連寶生物公司。

1.3?核酸提取

按照真菌?DNA?提取試劑盒說明書提取待測菌株的基因組DNA。

1.4?引物及探針的設(shè)計與合成

分離自江蘇金壇的薄殼山核桃瘡痂病菌JT11菌株的ITS序列，為本研究測序后上傳至GenBank?（登錄號：ON055759），該序列與NCBI中薄殼山核桃瘡痂病菌多個菌株的一致性均超過99%。利用BioEdit軟件進行序列比對，尋找差異位點設(shè)計薄殼山核桃瘡痂病菌的特異性引物對VEF/VER（5′TAGTCTGAGAACCAGTCG3′/5′CGGGGACGGGGCTCAACG3′）和探針VEP（5′FAMCACACCTGTTCGAGCGCCATTTCABHQ13′），預(yù)期產(chǎn)物大小為224?bp（圖1）。探針和引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.5?熒光定量PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化與建立

以分離自江蘇金壇的薄殼山核桃瘡痂病菌JT11菌株的DNA（50?pg/μL）作為熒光定量PCR擴增模板。20?μL反應(yīng)體系為：?Premix?Ex?Taq（TaKaRa）10?μL，ROX?Reference?Dye?Ⅱ?0.4?μL，上、下游引物各0.4?μL，TaqMan探針0.4?μL，模板1?μL，ddH2O?7.4?μL。反應(yīng)條件為：?95℃?30?s;95℃?15?s，60℃?35?s，40個循環(huán)。試驗重復(fù)3次。

熒光定量PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化主要是對反應(yīng)體系中的引物和探針濃度進行優(yōu)化。上、下游引物濃度設(shè)置為0.1～1?μmol/L，并以0.1?μmol/L依次遞增;探針濃度設(shè)置為0.2～1?μmol/L，以0.2?μmol/L依次遞增，其他條件不變。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)Ct值和ΔRn值確定最佳引物和探針濃度。

1.6?標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

1.6.1?標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建

以提取的JT11菌株基因組DNA為模板，利用引物VEF/VER進行PCR擴增?；厥漳康钠魏笈cpMD19T載體連接、轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞。挑選陽性克隆子37℃過夜搖菌后，提取質(zhì)粒，并委托南京擎科生物公司進行測序驗證。經(jīng)鑒定正確后，利用分光光度計測定質(zhì)粒濃度，并按照下列公式計算質(zhì)粒拷貝數(shù)：

標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的拷貝數(shù)=（質(zhì)量數(shù)×6.023×1023）/（質(zhì)粒堿基對數(shù)×660）。

1.6.2?標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進行10倍倍比稀釋，得到3×107～3×101?拷貝/μL?系列模板，利用優(yōu)化后的檢測體系進行熒光定量PCR，將得到的Ct值為縱坐標(biāo)，起始模板濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7?特異性檢測

采用真菌?DNA?提取試劑盒提取表1中菌株基因組DNA，濃度調(diào)整為50?pg/μL作為檢測模板。以菌株JT11的基因組DNA為陽性對照，無菌超純水為陰性對照，利用優(yōu)化的最佳反應(yīng)體系和條件進行特異性檢測。

1.8?靈敏度檢測

以JT11菌株的基因組DNA為模板，利用無菌水對模板進行梯度稀釋，得到5×102～5×10-2?pg/μL系列濃度，進行熒光定量PCR檢測。

1.9?實際樣品檢測

采自南京高淳、安徽鳳陽、浙江臨安地區(qū)的病葉和病果樣品共計18份。植物樣品按照Wang?等的NaOH法［10］提取DNA。主要方法為：取發(fā)病的植物組織，每毫克組織中加入10?μL?NaOH（0.5?mol/L），?在1.5?mL離心管中充分研磨后，12?000?r/min離心5?min，取5?μL上清液，加入495?μL?Tris緩沖液（100?mmol/L，pH?8.0），充分混合后取1?μL用于熒光定量PCR檢測。同時，對樣品進行病原菌分離，并對其進行ITS序列分析，與本研究建立的熒光定量PCR方法的檢測結(jié)果進行比對。

2?結(jié)果與分析

2.1?熒光定量PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化與建立

通過比較不同濃度的引物和探針反應(yīng)后的Ct值和ΔRn值，并在擴增效率差異不明顯的情況下，從經(jīng)濟節(jié)約的角度考慮，引物濃度為0.5?μmol/L、探針的濃度為0.6?μmol/L時為最佳反應(yīng)濃度。本研究最終建立的反應(yīng)體系（20?μL）為：?Premix?Ex?Taq?10?μL，ROX?Reference?DyeⅡ?0.4?μL，上、下游引物VEF/VER（終濃度為0.5?μmol/L）各?0.4?μL，TaqMan探針VEP（終濃度為0.6?μmol/L）0.4?μL，模板1?μL，ddH2O?7.4?μL。

2.2?標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以10倍倍比稀釋的3×107～3×101?拷貝/μL的重組質(zhì)粒為模板，以空質(zhì)粒為陰性對照，進行熒光定量PCR擴增。結(jié)果如圖2所示，模板濃度與可檢測到的熒光信號的循環(huán)數(shù)呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)R2=0.997?7，大于0.98，?表明Ct值與倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度之間具有良好的線性關(guān)系。

2.3?特異性檢測結(jié)果

利用2.1中優(yōu)化建立的檢測體系，對15株薄殼山核桃瘡痂病菌以及21株參試菌株進行熒光定量PCR檢測。檢測結(jié)果如圖3所示，不同來源的15株薄殼山核桃瘡痂病菌均有明顯的擴增曲線，Ct值為24.21～25.66，而其他參試菌株以及陰性對照均無擴增（本試驗中Ct值>35視為陰性）。結(jié)果表明，本研究設(shè)計的引物和探針具有較好的種內(nèi)適用性和種間特異性。

2.4?靈敏度檢測

將JT11菌株的DNA模板濃度稀釋為500、50、5、0.5?pg/μL和0.05?pg/μL，分別進行熒光定量PCR檢測。靈敏度試驗結(jié)果表明，本研究所建立的熒光定量PCR檢測的最低DNA濃度為0.5?pg/μL（圖4），即20個分生孢子的基因組DNA。

2.5?實際樣品檢測結(jié)果

利用分離培養(yǎng)和熒光定量PCR法對采自南京高淳、安徽鳳陽、浙江臨安地區(qū)的18份病葉和病果樣品進行了檢測。結(jié)果顯示，熒光定量PCR檢測中有10份樣品呈陽性，結(jié)果與分離培養(yǎng)法一致。但是，薄殼山核桃瘡痂病菌人工培養(yǎng)生長緩慢，分離培養(yǎng)法所需試驗周期長，分離和鑒定過程需要1個月左右，且容易受到腐生菌的干擾，需要多次分離。綜上所述，熒光定量PCR法檢測薄殼山核桃瘡痂病菌特異性強且省時省力，適用于實際樣品的快速檢測。

3?結(jié)論與討論

薄殼山核桃瘡痂病是世界各薄殼山核桃產(chǎn)區(qū)的重要病害［3，6］，在其傳播過程中，薄殼山核桃瘡痂病菌隨帶病苗木和接穗的調(diào)運進行遠距離傳播，進而造成病區(qū)的擴大和形成新病區(qū)［11］。因此，為避免薄殼山核桃產(chǎn)業(yè)因瘡痂病帶來的損失，亟須準(zhǔn)確、快速的檢測技術(shù)，限制帶菌苗木的傳播，保障薄殼山核桃產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。本研究以ITS序列為靶標(biāo)，建立了薄殼山核桃瘡痂病菌的熒光定量PCR檢測方法。結(jié)果表明，結(jié)合DNA快速提取法，本研究建立的檢測體系對實際樣品檢測僅需1?h，實現(xiàn)了病害的快速檢測。

瘡痂病是薄殼山核桃上最具毀滅性的病害［45］。目前，關(guān)于瘡痂病病原的鑒定，主要采用分離培養(yǎng)法。然而，由于薄殼山核桃瘡痂病菌人工培養(yǎng)生長緩慢，給分離培養(yǎng)帶來一定難度，同時效率很低。本文建立的基于TaqMan探針的熒光定量PCR檢測方法，能夠特異性識別薄殼山核桃瘡痂病菌，檢測的最低限D(zhuǎn)NA為0.5?pg/μL，且檢測時間僅需1?h，在檢測效率上遠高于常規(guī)的分離培養(yǎng)法。

薄殼山核桃瘡痂病菌屬于黑星菌屬真菌，與枝孢屬?Cladosporium?sp.的分生孢子在形態(tài)上相似，早期被鑒定為枝孢菌［1213］。直至2005年，Beck等［14］根據(jù)ITS序列，才將薄殼山核桃瘡痂病菌重新劃分為V.effusa。前期研究發(fā)現(xiàn)，在蚜蟲發(fā)生嚴(yán)重的種植園，枝孢霉能夠引起薄殼山核桃的煤污?。?5］。因此，我們在設(shè)計薄殼山核桃瘡痂病菌特異性引物時，將分離自薄殼山核桃的枝孢霉作為近似種進行序列比對，并進行特異性檢測。此外，我們在評價薄殼山核桃瘡痂病菌熒光定量PCR檢測體系的特異性時，還使用了薄殼山核桃褐斑病菌Colletotrichum?sp.、黑斑病菌Pestalotiopsis?microspora以及枝枯病菌?Diaporthe?sp.作為測試菌株。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本研究建立的薄殼山核桃瘡痂病菌的熒光定量PCR檢測方法對來自薄殼山核桃的不同病原菌有區(qū)分能力，說明該方法的檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

綜上所述，TaqMan熒光定量PCR技術(shù)具有特異性好、靈敏度高和耗時短等

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（責(zé)任編輯：田?喆）