李明睿 王震剛 劉婷 匡悅 王強(qiáng) 李迎瑞 李博洋 劉向濤 吳雨聰 張海燕

摘要

胞內(nèi)共生菌Wolbachia可誘導(dǎo)赤眼蜂產(chǎn)雌孤雌生殖，而高溫可使感染W(wǎng)olbachia的赤眼蜂產(chǎn)雄比例增加。本文以感染W(wǎng)olbachia孤雌產(chǎn)雌生殖的食胚赤眼蜂Trichogramma?embryophagum?為材料，采用30℃和35℃高溫處理卵、幼蟲(chóng)、預(yù)蛹、蛹和成蟲(chóng)等不同發(fā)育階段的蟲(chóng)體，統(tǒng)計(jì)子代蜂發(fā)育歷期、寄生數(shù)、羽化率和性比。結(jié)果表明，與25℃對(duì)照相比，高溫縮短了子代蜂各發(fā)育階段的歷期，其中蛹、成蟲(chóng)和全世代歷期顯著縮短。處理的發(fā)育階段和持續(xù)時(shí)間不同，子代的出雄率不同，而且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)食胚赤眼蜂子代的寄生和羽化有一定的影響?；诟邷靥幚砗笞哟鲂勐手笜?biāo)分析，F(xiàn)3代卵和幼蟲(chóng)經(jīng)高溫處理后代子代雄蜂比率最高，達(dá)到了20.54%和23.78%，明顯高于預(yù)蛹期和蛹期處理的雄蜂率。結(jié)果表明，高溫處理后感染W(wǎng)olbachia的食胚赤眼蜂生殖方式改變的敏感發(fā)育階段為卵期和幼蟲(chóng)期，本研究可為進(jìn)一步揭示W(wǎng)olbachia調(diào)控赤眼蜂生殖的機(jī)理提供理論參考。

關(guān)鍵詞

Wolbachia;?食胚赤眼蜂;?孤雌產(chǎn)雌生殖;?發(fā)育階段

中圖分類(lèi)號(hào)：

S?476.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022087

Sensitive?stages?of?thelytokous?parthenogenetic?Trichogramma?embryophagum?infected?by?Wolbachia?in?response?to?high?temperature

LI?Mingrui1，?WANG?Zhengang1，?LIU?Ting1，?KUANG?Yue1，?WANG?Qiang1，?LI?Yingrui1，

LI?Boyang1，?LIU?Xiangtao1，?WU?Yucong1，?ZHANG?Haiyan1，2*

（1.?College?of?Agriculture，?Heilongjiang?Bayi?Agricultural?University，?Daqing?163319，?China;?2.?Heilongjiang

Provincial?Research?Center?for?Engineering?Technology?of?Straw?Resource?Utilization，?Daqing?163319，?China）

Abstract

The?intracellular?symbiotic?Wolbachia?can?induce?thelytokous?parthenogenesis?in?Trichogramma，?but?the?proportion?of?male?offsprings?of?Trichogramma?infected?with?Wolbachia?will?increase?after?treatment?with

higher?temperature.?In?this?study，?the?eggs，?larvae，?prepupae，?pupae?and?adults?of?infected?Trichogramma?embryophagum?were?treated?at?30℃?and?35℃.?The?developmental?duration，?parasitism?number，?emergence?rate?and?sex?ratio?of?progenies?were?calculated.?The?results?showed?that?high?temperature?shortened?the?developmental?duration?of?the?offspring，?especially?the?developmental?durations?of?pupa，?adult?and?whole?generation.?The?percentages?of?offspring?males?were?different?with?different?developmental?stages?treated?and?different?treatment?durations.?The?parasitism?and?emergence?were?changed?with?increasing?treatment?time.?Based?on?the?analysis?of?the?percentages?of?offspring?males?under?hightemperature?treatment，?the?highest?percentages?of?males?were?recorded?when?eggs?and?larvae?were?treated?in?F3?generation，?reaching?20.54%?and?23.78%，?respectively，?higher?than?those?when?prepupae?and?pupae?were?treated.?The?results?suggested?that?the?changes?of?reproductive?pattern?of?T.embryophagum?induced?by?Wolbachia?were?most?sensitive?to?hightemperature?treatment?at?egg?and?larval?stages.?This?study?provides?a?theoretical?reference?for?further?revealing?the?reproductive?mechanism?of?Trichogramma?associated?with?Wolbachia?infection.

Key?words

Wolbachia;?Trichogramma?embryophagum;?thelytokous?parthenogenesis;?developmental?stage

節(jié)肢動(dòng)物胞內(nèi)共生細(xì)菌沃爾巴克氏體Wolbachia廣泛存在于自然界中［1］，可通過(guò)宿主細(xì)胞質(zhì)（非細(xì)胞核遺傳）向宿主子代垂直傳播［2］。Wolbachia?可改變宿主生殖方式，誘導(dǎo)宿主細(xì)胞質(zhì)不親和（cytoplasmic?incompatibility，CI）（包括單向不親和與雙向不親和）［35］、孤雌生殖（parthenogenesis?inducing，PI）［產(chǎn)雄孤雌生殖（arrhenotoky，AY）與產(chǎn)雌孤雌生殖（thelytoky，TY）］［67］、遺傳雄性的雌性化（feminization）［8］、雄性致死（malekilling）［9］等。近十年來(lái)，Wolbachia?改變宿主生殖方式的現(xiàn)象在蛛形綱、等足目和一些昆蟲(chóng)中均有報(bào)道［1014］。例如，Wolbachia?pipientis可調(diào)控赤眼蜂發(fā)生孤雌產(chǎn)雌生殖［15］，同時(shí)Wolbachia的殺雄、胞質(zhì)不親和等特性也可以應(yīng)用到其他昆蟲(chóng)中，這對(duì)改良天敵種群具有重要意義［1617］。

赤眼蜂是一類(lèi)廣泛應(yīng)用于害蟲(chóng)生物防治的卵寄生蜂。其中，孤雌產(chǎn)雌生殖的赤眼蜂無(wú)需交配即可產(chǎn)下近100%的子代雌蜂，因此無(wú)需飼養(yǎng)雄蜂，大幅節(jié)約了生產(chǎn)成本［18］。目前已知Wolbachia可感染約20種赤眼蜂，如松毛蟲(chóng)赤眼蜂Trichogramma?dendrolimi、短管赤眼蜂T.pretiosum、螟黃赤眼蜂T.chilonis

、食胚赤眼蜂T.embryophagum和安荔赤眼蜂T.oleae等［1921］。研究發(fā)現(xiàn)，高溫和抗生素對(duì)赤眼蜂體內(nèi)Wolbachia影響顯著，超過(guò)28℃的高溫可使子代蜂出現(xiàn)雄性，且溫度越高、處理時(shí)間越長(zhǎng)子代蜂雄性比例越高［22］。此外，喂食抗生素也可使感染W(wǎng)olbachia的赤眼蜂生殖方式部分或完全恢復(fù)為兩性生殖［23］。研究發(fā)現(xiàn)，Wolbachia誘導(dǎo)的赤眼蜂產(chǎn)雌孤雌生殖現(xiàn)象取決于Wolbachia的滴度［24］，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，除了滴度因素外，高溫（30℃以上）會(huì)影響Wolbachia對(duì)宿主赤眼蜂生殖方式的調(diào)控。

本研究采用25、30℃和35℃分別處理食胚赤眼蜂各發(fā)育階段（卵、幼蟲(chóng)、預(yù)蛹、蛹和成蟲(chóng)），通過(guò)調(diào)查處理后子代蜂生殖表型，明確高溫對(duì)Wolbachia調(diào)控赤眼蜂產(chǎn)雌孤雌生殖方式產(chǎn)生影響的關(guān)鍵階段。研究結(jié)果將有助于揭示W(wǎng)olbachia調(diào)控赤眼蜂生殖表型發(fā)生改變的機(jī)理。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

蜂種：感染W(wǎng)olbachia的孤雌產(chǎn)雌食胚赤眼蜂Trichogramma?embryophagum?（Hartig）由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，在黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院養(yǎng)蟲(chóng)室飼養(yǎng)80代以上。

寄主米蛾卵：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院養(yǎng)蟲(chóng)室飼養(yǎng)的米蛾Corcyra?cephalonica（Stainton）所產(chǎn)新鮮卵。

1.2?試驗(yàn)方法

蜂種保種：將天然桃樹(shù)膠均勻地涂抹在滅菌濾紙上，將新鮮米蛾卵均勻地灑在上面，在距離紫外燈10?cm處滅菌10?min，接蜂后將蜂卡置于25℃，相對(duì)濕度為70%的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)保種繁殖。

不同溫度下感染W(wǎng)olbachia的食胚赤眼蜂各階段發(fā)育歷期：取單頭食胚赤眼蜂雌蜂，置于玻璃指形管內(nèi)，給予含足量新鮮米蛾卵的卵卡（超過(guò)200粒米蛾卵），用棉花塞住管口，轉(zhuǎn)移至25、30、35℃的人工氣候箱中恒溫培養(yǎng)，相對(duì)濕度均為70%，光周期為L(zhǎng)∥D=12?h∥12?h。每隔8?h觀察1次食胚赤眼蜂發(fā)育情況，統(tǒng)計(jì)卵期、幼蟲(chóng)期、預(yù)蛹期、蛹期和成蟲(chóng)期持續(xù)時(shí)間。

短期高溫處理方法：取初羽化成蟲(chóng)60頭，每15頭為1組，每頭單獨(dú)放入一個(gè)小指形管內(nèi)，放入新鮮卵卡（約200粒卵）供其寄生。試驗(yàn)分別設(shè)卵期、幼蟲(chóng)期、預(yù)蛹期和蛹期進(jìn)行30℃或35℃高溫處理，以25℃為對(duì)照溫度。卵期高溫處理：將接入卵卡的指形管轉(zhuǎn)移到30℃或35℃，相對(duì)濕度70%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，寄生8?h去除種蜂，待寄生蜂卵期結(jié)束（去除種蜂后約1?d），將指形管重新放回25℃，相對(duì)濕度70%的條件下培養(yǎng)，當(dāng)被寄生的米蛾卵變黑（此時(shí)赤眼蜂發(fā)育至蛹期）時(shí)從每組的卵卡（15張卵卡每張卡上取1～2粒）上隨機(jī)挑取15粒以上待羽化出蜂的米蛾卵，用于出蜂后下一代的處理。幼蟲(chóng)期、預(yù)蛹期和蛹期的高溫處理：接入卵卡的指形管在25℃，相對(duì)濕度70%的條件下培養(yǎng)8?h后去除種蜂，待卵發(fā)育至幼蟲(chóng)初期（去除種蜂后約2?d）、預(yù)蛹期（去除種蜂后約4?d）和蛹期（去除種蜂后約5?d）時(shí)?，將指形管分別放入30℃或35℃，相對(duì)濕度70%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，其中幼蟲(chóng)和預(yù)蛹在高溫下均處理1?d，蛹期處理3?d，而后將指形管重新放回25℃，相對(duì)濕度70%的條件下培養(yǎng)。羽化出蜂后代按上述方法繼續(xù)處理，其中第1次處理的蜂為F0代，經(jīng)高溫處理1次后獲得的子代蜂為F1代，第2次處理后羽化子代蜂為F2代，依次類(lèi)推統(tǒng)計(jì)至F3代出蜂。

統(tǒng)計(jì)每一子代寄生數(shù)、羽化數(shù)，統(tǒng)計(jì)羽化率、雄蜂率。

寄生數(shù)為米蛾卵被寄生變黑的數(shù)量。

羽化率=羽化出蜂數(shù)/寄生卵粒數(shù)×100%;雄蜂率=羽化雄蜂數(shù)/羽化出蜂數(shù)×100%。

1.3?數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

調(diào)查記錄的試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)?Excel?整理后，不同處理的寄生數(shù)、發(fā)育歷期均值首先進(jìn)行單因素方差分析，對(duì)存在顯著性差異的數(shù)據(jù)進(jìn)一步采用?Duncan?氏新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。羽化率及雄蜂百分率數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后再進(jìn)行分析。顯著性水平α=0.05。

2?結(jié)果與分析

2.1?孤雌產(chǎn)雌食胚赤眼蜂的發(fā)育歷期

通過(guò)顯微鏡觀察孤雌產(chǎn)雌赤眼蜂各發(fā)育階段的特征及歷期，結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，與25℃相比，30℃和35℃下食胚赤眼蜂蛹、成蟲(chóng)和全世代

歷期均顯著縮短，而兩個(gè)高溫處理之間赤眼蜂各階段的發(fā)育歷期無(wú)顯著差異。

2.2?高溫處理后孤雌產(chǎn)雌食胚赤眼蜂的生物學(xué)特性

2.2.1?高溫處理食胚赤眼蜂不同發(fā)育階段后各代的寄生、羽化情況

由表2可知，食胚赤眼蜂F0代卵、幼蟲(chóng)、預(yù)蛹和蛹經(jīng)過(guò)30℃或35℃高溫處理后，F(xiàn)1代的寄生數(shù)（19.61～22.86粒）、羽化率（64.43%～87.86%）與未經(jīng)高溫處理的對(duì)照（25℃）的寄生數(shù)和羽化率（23.88粒和81.04%）相比均無(wú)顯著差異，35℃預(yù)蛹期處理的羽化率為87.86%，顯著高于該溫度下卵和幼蟲(chóng)處理后，以及30℃處理各階段后F1代蜂的羽化率。30℃處理卵、幼蟲(chóng)、預(yù)蛹和蛹后F1代蜂的羽化率沒(méi)有顯著差異。

由表3可知，食胚赤眼蜂同一發(fā)育階段經(jīng)過(guò)連續(xù)兩代30℃或35℃高溫處理后，F(xiàn)2代的寄生數(shù)與25℃對(duì)照相比均沒(méi)有顯著差異，但30℃和35℃的卵處理其F2代的寄生數(shù)差異顯著，分別為19.47粒和28.77粒，其他階段經(jīng)高溫處理后F2代寄生數(shù)均無(wú)顯著差異。30℃處理預(yù)蛹后F2代的羽化率最低，為66.35%，顯著低于其他處理。35℃處理卵和幼蟲(chóng)，F(xiàn)2代羽化率分別為86.17%和84.27%，顯著高于25℃時(shí)的羽化率。

由表4可知，食胚赤眼蜂同一發(fā)育階段經(jīng)過(guò)連續(xù)三代的高溫處理后，除了30℃蛹處理的F3代寄生數(shù)為20.54粒，顯著低于35℃預(yù)蛹處理外，其他各處理間及與對(duì)照間F3代的寄生數(shù)均無(wú)顯著差異。羽化率統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，30℃卵處理F3代羽化率最低，為60.78%，其次為35℃預(yù)蛹處理，羽化率為61.54%，兩者顯著低于30℃蛹處理和35℃其他階段的處理。35℃幼蟲(chóng)處理后羽化率最高，為83.45%，顯著高于30℃卵、幼蟲(chóng)和預(yù)蛹處理。

2.2.2?食胚赤眼蜂各個(gè)發(fā)育階段高溫處理后子代的雄蜂率

研究發(fā)現(xiàn)，在25℃下，食胚赤眼蜂孤雌產(chǎn)雌，子代沒(méi)有雄性個(gè)體出現(xiàn)，不同發(fā)育階段蟲(chóng)體經(jīng)30℃和35℃高溫處理后，子代均羽化出雄蜂。卵、預(yù)蛹和蛹連續(xù)3代經(jīng)30℃處理，隨著連續(xù)處理代數(shù)增加，子代雄蜂率明顯增加，其中卵處理后子代雄性個(gè)體比例隨著處理代數(shù)增加而顯著增加，到F3代雄蜂率最高，為20.54%（圖1），幼蟲(chóng)期處理后子代F2代雄蜂率最高，也在20%左右，與F3代沒(méi)有顯著差異，但顯著高于F1代的雄蜂率。比較同一世代的各處理之間的雄蜂率，可以看出，F(xiàn)1代、F2代的雄蜂率均以幼蟲(chóng)期處理較高，但F3代的雄蜂率以卵處理最高，F(xiàn)3代的卵、幼蟲(chóng)、預(yù)蛹處理的雄蜂率間沒(méi)有顯著差異，但三者均明顯高于蛹期處理的雄蜂率。

卵、幼蟲(chóng)和蛹連續(xù)3代經(jīng)35℃處理，隨著處理代數(shù)的增加，子代雄蜂率增加，其中幼蟲(chóng)處理后子代雄性個(gè)體比例隨著處理世代增加而顯著增加，到F3代雄蜂率最高達(dá)23.78%（圖2），卵處理的F1代和F3代間雄蜂率差異顯著，F(xiàn)3代卵和幼蟲(chóng)處理的雄蜂率顯著高于預(yù)蛹和蛹期處理的雄蜂率。

3?結(jié)論與討論

關(guān)于溫度對(duì)感染W(wǎng)olbachia的赤眼蜂的影響已有較多研究，其中高溫可以改變感染W(wǎng)olbachia赤眼蜂的生殖特性也有報(bào)道［25］，但高溫誘導(dǎo)孤雌產(chǎn)雌赤眼蜂生殖發(fā)生改變的敏感發(fā)育階段至今沒(méi)有報(bào)道，明確高溫改變赤眼蜂生殖方式的敏感發(fā)育階段，對(duì)于研究孤雌產(chǎn)雌赤眼蜂生殖具有重要意義。孤雌產(chǎn)雌的松毛蟲(chóng)赤眼蜂Trichogramma?dendrolimi經(jīng)短期高溫刺激，尤其是38℃高溫刺激后羽化出蜂率和單卵出蜂數(shù)明顯降低，其子代蜂各指標(biāo)變化不明顯，二代赤眼蜂均未有雄蜂出現(xiàn)，說(shuō)明短期高溫沖擊沒(méi)有對(duì)?Wolbachia?調(diào)控其宿主生殖方式的作用產(chǎn)生影響［26］。?隨著溫度的升高赤眼蜂體內(nèi)的Wolbachia滴度會(huì)降低，在28℃到31℃中滴度隨著代數(shù)的增加先下降后上升，雄蜂百分率和雌雄間體百分率卻隨著代數(shù)的增加呈先上升后下降再上升的趨勢(shì)［29］。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果和現(xiàn)象推斷，高溫會(huì)促使感染W(wǎng)olbachia的赤眼蜂由孤雌產(chǎn)雌轉(zhuǎn)變?yōu)楣麓飘a(chǎn)雄;過(guò)高和過(guò)長(zhǎng)的溫度處理會(huì)降低Wolbachia對(duì)赤眼蜂的作用;所以適當(dāng)?shù)亩虝r(shí)高溫和選擇不同發(fā)育階段進(jìn)行處理是本試驗(yàn)進(jìn)行的關(guān)鍵。本研究連續(xù)高溫處理3個(gè)世代，孤雌產(chǎn)雌品種食胚赤眼蜂生殖方式有所改變，而根據(jù)張海燕等［28］、潘雪紅等［25］及寧素芳等［29］對(duì)不同種孤雌產(chǎn)雌赤眼蜂的研究，高溫對(duì)松毛蟲(chóng)赤眼蜂和短管赤眼蜂的出雄率變化的影響較明顯的結(jié)論略有不同，是否與食胚赤眼蜂體內(nèi)Wolbachia菌系或赤眼蜂種類(lèi)對(duì)高溫的耐受性有關(guān)需進(jìn)一步試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

除了高溫以外，其他外界環(huán)境因子如抗生素、交配等誘導(dǎo)孤雌產(chǎn)雌赤眼蜂生殖方式發(fā)生改變也有報(bào)道［25］。不同溫度下與雄蜂交配不會(huì)改變?Wolbachia?感染引起的松毛蟲(chóng)赤眼蜂產(chǎn)雌孤雌生殖方式，抗生素處理和持續(xù)至少?20?d?的?32℃高溫是改變感染?Wolbachia?的松毛蟲(chóng)赤眼蜂生殖方式的決定因素［27］。本試驗(yàn)孤雌產(chǎn)雌的食胚赤眼蜂各發(fā)育階段在經(jīng)過(guò)短期30℃和35℃高溫處理后，子代出現(xiàn)了雄蜂，且處理的發(fā)育階段不同、世代不同，子代恢復(fù)出雄的比率也不同，處理代數(shù)越多子代出現(xiàn)雄蜂的幾率越大。短期高溫處理卵和幼蟲(chóng)后生殖方式改變即出雄的幾率較大，尤其是幼蟲(chóng)處理后變化較明顯，預(yù)蛹期和蛹期高溫處理后出雄率

變化不大，只有個(gè)別世代出現(xiàn)變化。說(shuō)明高溫對(duì)Wolbachia誘導(dǎo)赤眼蜂生殖改變的影響主要發(fā)生在卵期和幼蟲(chóng)期。田間釋放赤眼蜂防治害蟲(chóng)的時(shí)候，都是選擇赤眼蜂即將羽化出蜂的時(shí)期，所以田間生產(chǎn)應(yīng)用過(guò)程中如遇高溫不會(huì)影響寄生效果，這一研究結(jié)果為生產(chǎn)上釋放孤雌產(chǎn)雌的赤眼蜂提供了參考。

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